HPLC法同時測定逍遙丸中阿魏酸和甘草酸含量探討

田 潔，孫玉坤，尹 祿，唐 哲，王海鵬

逍遙散出自《太平惠民和劑局方》，后經中藥現代化的工藝改造而制成的中成藥制劑逍遙丸[1]。功效為調經養血，疏肝理氣，臨床常用于治療肝氣不舒所致頭昏目眩，食欲不振，月經失調，胸脅滿脹等[2-4]。逍遙丸的主要成分包括當歸、白芍、柴胡、薄荷、白術、茯苓、甘草。市面上與逍遙丸相關的制劑有逍遙膠囊、濃縮丸、逍遙水丸、逍遙片。2015年版《中國藥典》對以上劑型的質量控制僅規定檢測芍藥苷的含量，而對于其他的化學成分卻沒有相應的檢測標準[5]。文獻[6-8]報道了對逍遙丸中的主要成分阿魏酸、甘草苷、槲皮素、柴胡皂苷的成分檢測。中成藥的復方制劑中往往含有多種復雜的化學成分，單一測定其中一種成分，不能客觀全面地反映藥品質量，應多種成分同時檢測。本實驗通過對檢測條件的優化，建立了HPLC法同時對逍遙丸中阿魏酸和甘草酸兩種有效成分含量的測定方法，為逍遙丸的產品質量評價提供有效的試驗數據。

1 材料與儀器

Agilent1260高效液相色譜儀、Agilent1260 Infinity 四元泵系統、Agilent1260紫外檢測器等購自安捷倫科技有限公司；DP-uw實驗室超純凈水器購自北京亞歐德鵬科技有限公司；YZ-250DB型數控超聲波清洗器購自上海越眾儀器設備有限公司；ES-E110A電子分析天平購自天津市德安特傳感技術有限公司；DHG-9070A電熱恒溫鼓風干燥箱購自上海右一儀器有限公司。阿魏酸對照品(批號:110773-201508)和甘草酸對照品(批號:1405-86-3)，均從中國藥品生物制品檢定所購得；被測樣品均為市售的逍遙丸；甲醇和乙腈、色譜純由sigma試劑公司生產；磷酸、分析純購自德州潤昕實驗儀器有限公司。

2 方法與結果

2.1 色譜條件選擇 采用Agilent Zorbax XDB-C18 的色譜柱(150 mm×4.6 mm，5 μm)；梯度洗脫液選用的是乙腈和0.05%磷酸水溶液30∶70(v/v)；流速為1.0 ml/min；檢測波長為 278 nm；柱溫設為35 ℃；每次注入樣品量為10 μl；流動相梯度程序見表1。

表1 梯度洗脫程序

2.2 對照品溶液的制備 精密稱取對照品阿魏酸2.71 mg、甘草酸5.53 mg，置于100 ml 的容量瓶中，然后加入甲醇溶解并定容至刻度，搖勻，得阿魏酸和甘草酸濃度分別為0.0271 mg/ml、0.0553 mg/ml的對照品溶液，備用。

2.3 供試品溶液的制備 取大約50粒市售逍遙丸(仲景宛西制藥股份有限公司，國藥準字Z44020869)，于研缽中反復研磨至細粉、收集后精密稱取1.0 g粉末置于具塞磨口三角燒瓶中，加入20 ml甲醇溶液搖勻溶解，稱定并記錄重量后，超聲波預處理20 min，取出三角燒瓶，待降至室溫，再次稱定重量，加入甲醇溶液補充損失的重量，充分振搖后濾過，濾過液減壓干燥，將殘渣搜集于10 ml的容量瓶中，加甲醇搖勻、溶解，并定容至刻度，經過微孔濾膜(0.22 μm)濾過，獲得的續濾液，即為制備的供試品溶液，備用。

2.4 陰性對照溶液的制備 在逍遙丸的配方組成中除去甘草、當歸兩味中藥成分，將柴胡、白芍、白術、茯苓、薄荷，按照5∶5∶5∶5∶1比例經煎煮、濾過、干燥等工藝處理，制成逍遙丸陰性樣品，取其適量陰性樣品參照“2.3”項處理方法制備陰性對照品溶液。分別取10 μl對照品、供試品和陰性品三種溶液注入高效液相色譜儀中，應用本文給出的色譜條件對試品進行測定并繪制各自的色譜圖。對得出的三幅色譜圖進行分析比較，發現陰性對照品溶液在相應的保留時間處沒有出現對照品成分吸收峰，說明陰性對照品溶液無干擾(圖1)。

圖1 逍遙丸HPLC色譜圖

2.5 標準曲線的考察 精密吸取“2.2”項下制備的兩種樣品的對照品溶液各2、4、7、10、15、22 μl，依次注入高效液相色譜儀中，根據前文給出的色譜條件測定兩對照品峰面積值，以峰面積值為縱坐標(Y)，以對照品進樣量為橫坐標(X)進行線性回歸，得阿魏酸回歸方程：Y=1.537×106X-31851，r=0.9995，其進樣量在0.054～0.596 μg與峰面積線性關系良好；甘草酸回歸方程：Y=29058X+3128，r=0.9993，其進樣量在0.110～1.217 μg與峰面積線性關系良好。

2.6 儀器精密度試驗 精密量取10 μl“2.3”項下制備的供試品溶液，在上述色譜條件下，分6次連續注入高效液相色譜儀中，詳細記錄各自峰面積并計算RSD值，得阿魏酸的RSD值為0.63%，甘草酸的RSD值為0.88%，表明本實驗所應用的器材具有良好的精密度。

2.7 試品穩定性試驗 量取“2.3”項下相同批號逍遙丸制備的供試品溶液，從0 h起每2 h注入樣品1次，共測7次，詳細記錄各自峰面積變化，并根據峰面積計算RSD值，求得阿魏酸峰面積RSD值為0.53%，甘草酸峰面積RSD值為1.02%，結果表明供試品溶液至少在12 h內具有良好的穩定性。

2.8 重復性試驗 量取“2.3”項下相同批號逍遙丸制備的供試品溶液6份，精密量取10 μl溶液在上述色譜條件下依次注入高效液相色譜儀中檢測。通過計算得阿魏酸平均質量RSD值為1.35%，甘草酸平均質量RSD值為1.61%，結果表明此方法具有良好的重復性。

2.9 加樣回收率試驗 取同一批號(批號Z44020869)市售逍遙丸制劑，含量明確，置于研缽中研細混勻，平均分成6等份，每份取約1.0 g，精密稱定，置于容量瓶中，將“2.2”項下制備的對照品溶液各取10 ml分別加入6個容量瓶中，依照上述供試品溶液制備方法處理，得加樣回收率試品溶液。分別精密量取10 μl溶液依次注入色譜儀中，根據測定結果，計算阿魏酸和甘草酸兩種成分的加樣回收率、平均加樣回收率和RSD值(表2)。

表2 逍遙丸中阿魏酸、甘草酸回收率試驗表

2.10 樣品的測定 適量稱取市售逍遙丸樣品6個批次(仲景宛西制藥股份有限公司)，按上述對照品溶液制備方法制備樣品供試液，分別精密量取10 μl進樣測定并記錄峰面積，計算阿魏酸和甘草酸的含量，見表3。

表3 6個批次逍遙丸樣品含量測定結果

3 討 論

通過查閱文獻資料發現，在供試品溶液制備中，對提取溶劑選擇，提取方法與時間優化，以甲醇超聲和甲醇加熱回流的提取方式進行對比，發現甲醇超聲提取法的效率高于加熱回流法，料液比也更加經濟。在甲醇超聲提取時間的考察中，分別選取10、20、30、40 min時間點，結果以20 min為最佳，更長時間不能明顯提高效率，而且浪費時間。

在梯度洗脫液的選擇上，本研究分別考察了甲醇/水、甲醇/磷酸、乙腈/水、乙腈/磷酸四種配比組合，結果發現逍遙丸的主要成分洗脫與洗脫液的pH值關聯較大，甲醇/水、甲醇/磷酸、乙腈/水均不能達到較好的洗脫效果，通過進一步優化，最終選取乙腈/磷酸(0.05%)作為流動相，可使逍遙丸中阿魏酸和甘草酸兩種檢測成分得到良好的分離效果，呈現較好的色譜圖。近年來，已有文獻報道同時檢測逍遙丸中多種成分的研究，在測定多種成分時，對色譜條件的選擇提出了更高要求，每種成分的分離及檢測條件很難達到均衡統一，需要設置多種實驗條件，也就增加了檢測的復雜性。

通過各項條件優化等措施，筆者建立了一套同時對逍遙丸中阿魏酸和甘草酸的含量檢測方法，此方法雖然檢測的成分較少，但兩種物質的最大吸收值相近，選擇一種檢測波長就可達到較好的響應值，因此具有操作簡單、靈敏，結果準確、重現性良好等優點，可為市售逍遙丸的質量控制提供相關依據。