維持性血液透析終末期腎病患者腸道菌群特點探討

李 晟，陳 宏，孫 巖，陳 丁，田紅霞，袁 鷹，肖王艷

人類胃腸道微生態系統非常復雜，健康人群的腸道內寄居著一百億以上的細菌，這些腸道菌群構成了腸道微生態系統。不同種類的腸道菌群保持一種動態的平衡狀態并且與機體相互作用，在代謝、營養、宿主消化、免疫等多方面發揮重要作用。慢性腎臟病(chronic kindney disease，CKD)是全球性的健康問題，中國成人CKD患病率已超過10%[1]。第6次全國人口普查顯示我國60歲以上老年人已占總人口的13.26%，增齡是CKD發病的主要危險因素之一[2]。Pahl等[3]于2015年提出了“腎臟病-結腸軸”學說，進一步闡明了CKD與腸道菌群的相互作用關系，其認為CKD患者在疾病進展過程中會出現腸道菌群失調，加重腎臟損害。終末期腎病(end stage renal disease，ESRD)患者進行血液透析時，血流動力學不穩定，腸道低灌注缺血缺氧亦可造成腸道屏障破壞，促使腸道菌群移位及變化[4]。本研究旨在探討維持性血液透析ESRD患者腸道菌群的特點，研究腸道菌群分布情況及代謝通路變化，為尋找維持性血液透析ESRD患者可能的腸道治療靶點提供線索。

1 對象與方法

1.1 對象 選取2018-10至2019-01我院血液透析中心維持性血液透析的穩定ESRD患者22例(A組)，其中男16例，女6例，平均年齡(63.73±14.67)歲，每周透析2～4次，每次4～5 h，透析時間>3個月。所有患者病情穩定，無急慢性感染、活動的自身免疫性疾病，近3個月無輸血史，2周內未使用過腎上腺皮質激素、免疫抑制藥。健康對照組(B組)為本院健康體檢者，共計22例，其中男13例，女9例，平均年齡(57.59±14.71)歲。健康對照組未使用過抗菌藥物和免疫抑制藥，無明顯病毒、細菌或真菌病原體感染。

1.2 標本收集及保存 收集受試者新鮮糞便樣品，取中段內部糞便樣品分裝至2 ml無菌EP管，每管糞便量0.5～2 g，放入液氮中保存。

1.3 糞便樣本微生物DNA提取及質量檢測 使用DNA提取試劑盒(Qiagen，德國)，按說明書步驟，經過微生物細胞破碎、DNA抽提、純化，提取糞便微生物DNA。

1.4 建庫測序 提取糞便微生物總DNA后，根據保守區設計得到引物，在引物末端加上測序接頭，進行PCR擴增并對其產物進行純化、定量和均一化形成測序文庫，建好的文庫先進行文庫質檢，質檢合格的文庫用Illumina HiSeq 2500進行測序。

1.5 統計學處理 受試者基本信息采用統計軟件SPSS 22.0來計算，并進行獨立樣本t檢驗。組間差異物種采用Krushal-Wallis秩和檢驗進行分析。通過與KEGG數據庫進行比對，進行功能基因在代謝途徑上的差異分析。

2 結 果

2.1 研究對象基本特征 兩組年齡、性別構成比、年齡分組均無統計學差異(表1)。

2.2 糞便微生物群落多樣性比較

2.2.1 α多樣性 維持性血液透析ESRD組觀察到的各樣品微生物物種量、物種多樣性較健康對照組低，但無統計學差異。按年齡分層后維持性血液透析ESRD組僅18～44歲患者中觀察到的物種多樣性較對照組低，有統計學差異(P<0.05)。

表1 維持性血液透析(A)組與健康對照(B)組基本信息

2.2.2 β多樣性 主坐標分析法(Principal coordinates analysis，PCoA)可以看出兩組明顯分開，提示兩組樣品微生物群多樣性可能有差異(圖1)。

2.3 兩組菌群在各分類水平上的微生物組成及組間差異物種分析 兩組糞便菌群共有的優勢菌門為厚壁菌門(Firmicutes)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、變形菌門(Proteobacteria)、放線菌門(Actinobacteria)。在門水平兩組微生物菌群的相對豐度無統計學差異物種。在綱、目、科、屬、種分類水平上分別發現2、4、9、29、28個相對豐度有統計學差異的物種(P<0.05)； 其中Negatibicutes綱、糞球菌屬-3(Coprococcus-3)相對豐度維持性血液透析ESRD組低于對照組，而丹毒絲綱、目、科、屬、種水平相對豐度維持性血液透析ESRD組高于對照組(圖2 A-B)。

2.4 兩組糞便菌群差異代謝通路分析 通過KEGG代謝途徑的差異分析，推測兩組間有3個存在統計學差異(P<0.05)的代謝途徑，其中與碳水化合物代謝途徑相關基因在健康對照組糞便樣品中顯著富集，而與細胞運動性及藥物耐藥途徑相關基因在維持性血液透析ESRD組糞便樣品中顯著富集(圖3)。

圖1 維持性血液透析(A)組與健康對照(B)組PCoA分析圖

圖2 維持性血液透析(A)組與健康對照(B)組物種相對豐度比較

A.綱水平；B.屬水平

圖3 維持性血液透析(A)組與健康對照(B)組KEGG代謝途徑差異分析

3 討 論

人類胃腸道優勢菌群是擬桿菌、厚壁菌和放線菌[5]。本研究與此一致，維持性血液透析ESRD組和健康對照組受試者糞便菌群共有的優勢菌門亦為厚壁菌門、擬桿菌門、變形菌門和放線菌門。本研究對兩組糞便微生物群落相對豐度比較，發現2綱、4目、9種、29屬、28種有統計學差異的物種。Negatibicutes綱相對豐度在維持性血液透析ESRD組低于對照組，Negatibicutes綱屬厚壁菌門，為專性厭氧G-菌。文獻[6]報道γ變形菌綱(如G-兼性芽孢桿菌)相對豐富而嚴格厭氧菌(特別是Negativicutes)相對貧乏容易在極低體重嬰兒中形成壞死性小腸結腸炎，說明Negatibicutes綱減少對炎性反應過程有促進作用。金曉倩[7]研究證實，維持性血液透析ESRD患者腸道優勢菌群多樣性發生顯著變化，且與患者炎性反應因子有密切相關性。丹毒絲綱、目、科、屬、種水平相對豐度在維持性血液透析ESRD組均高于對照組，丹毒絲綱亦屬于厚壁菌門，為革蘭陽性桿菌，無莢膜，不形成芽苞。特發性炎性反應性腸病狗γ變形菌綱過表達，而丹毒絲綱、梭菌綱和擬桿菌綱低表達[8]。Pindjakova等[9]發現，高脂飲食喂養的C57/BL6小鼠(模擬代謝健康的肥胖模型)出現肥胖、體重增加、脂肪肝但無系統性炎性反應且未激活適應性免疫應答，此小鼠糞便樣品中γ變形菌綱、δ變性菌綱、丹毒絲綱豐富。由此可見厚壁菌門的丹毒絲綱增多似乎對于炎性反應控制有利。還有研究發現丹毒絲綱在高血壓動物中豐富[10]。ESRD中部分患者有透析相關性低血壓，是否可嘗試將腸道菌群作為治療靶點達到減輕炎性反應、改善血壓的目的尚需進一步研究。

革蘭陽性梭菌特別是糞球菌屬可將膳食纖維和其他復合糖類發酵為丁酸鹽，而丁酸鹽可能是具有抑制結腸炎、抑癌作用的主要結腸代謝物[11]。高膳食纖維結構飲食能夠減輕腸黏膜上皮細胞緊密連接損傷，并延緩腎功能不全的進展[12]。本研究發現，糞球菌屬在維持性血液透析ESRD組中的相對豐度降低，可能對膳食纖維和其他復合糖類的發酵不利，這與本研究中通過KEGG代謝途徑差異分析推測的糖類代謝途徑相關基因在維持性血液透析ESRD組富集程度低于健康對照組是一致的。細菌分解糖類后的主要產物是單糖，其發酵形成各種短鏈脂肪酸(SCFAs)，SCFAs可對免疫調節、降低系統性炎性反應發揮有益作用[13]。說明高纖維飲食及調節腸道菌群可能通過促進糖類代謝及相關有益代謝產物生成進而減輕炎性反應。

綜上所述，本研究發現，維持性血液透析ESRD組優勢菌門種類與健康對照組相似，各樣品糞便微生物群落α多樣性分析顯示，僅18～44歲年齡段兩組物種多樣性有統計學差異。可能與本研究中老年患者比例偏高有關，人在衰老的過程中，腸道微生物多樣性逐漸降低，先前罕見的致病菌株逐漸占據主導地位[11]。β多樣性分析顯示，兩組可能有組間差異。但由于本研究病例有限，這種多樣性的差異顯著性及年齡分層的意義有待進一步研究。各菌門在微生物不同分類水平上的相對豐度有存在統計學差異的物種。厚壁菌門的Negatibicutes、丹毒絲菌增加可能對炎性反應控制、血壓調節起到有益作用，目前尚未見相關文獻報道上述菌群在維持性血液透析ESRD患者中作用，可否為下一步ESRD患者減輕炎性反應、調節血壓提供一個可能的腸道治療靶點？值得進一步擴大樣本深入研究。