利用流式細胞儀鑒定槭樹染色體倍性的方法探究

柳 斌，任紅劍，李美榮，賈冰玉，黃 華

（1.寧陽縣生態林業發展中心，山東 泰安 271400；2.寧陽縣農業農村局，山東 泰安 271400；3.山東農業大學林學院，山東 泰安 271000）

多倍體植物通常表現有莖干粗壯、葉片大而厚和抗逆性強等特點，特別是在生長速度、遺傳特性等方面具有明顯優勢[1]。植物多倍化進程當中，基因表達傳控出現巨大變化[2]，這為植物變異進化提供了有利條件，植物多倍體誘導是今后植物遺傳變異研究的重要育種手段。

流式細胞儀可以定量測試某一植物細胞中RNA、DNA的含量，與傳統的組型分析法染色體計數法相比，該方法能夠較為迅速準確地鑒定植物倍性[3]。在植物遺傳育種研究過程中，流式細胞儀的檢測不受植物取材部位與時間限制，極為方便簡單，精準度較高[4]。某一植物多倍體一旦產生后能夠增加該類群植物的遺傳進化多樣性，為培育植物新品種和育種研究提供重要參考。

三角楓（Acer buergerianum Miq.）和元寶楓（Acer truncatum Bunge）都屬槭樹科槭樹屬落葉喬木，都是我國自然分布廣泛的優良鄉土觀賞樹種[5]。有關槭樹類植物多倍體的報道較少，僅有山東農業大學豐震教授的研究團隊，對以三角楓為代表的槭樹植物進行過多倍體誘導試驗[6]，并獲得三角楓多倍體的植物新品種，命名為“興旺”。

本試驗研究利用流式細胞儀，以元寶楓、三角楓等槭樹植物葉片為試驗材料，探究快速鑒定槭樹科植物倍性的步驟和方法。該試驗探究為開展槭樹科植物多倍體育種奠定基礎，以期為槭樹科植物多倍體育種工作能夠取得突破性進展。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試三角楓材料：三角楓1號和三角楓2號，均取自山東省高橋國有林場苗圃基地內的槭屬資源圃。兩個三角楓無性系的選育方法：在槭屬資源圃內發現兩株生長特征比較奇特的單株，之后用普通三角楓實生苗作砧木，通過嫁接方式培育得到三角楓1號和2號。

供試元寶楓材料：元寶楓A號、元寶楓F號，取自山東勝鑫園林苗圃地內。兩個元寶楓無性系的選育方法：通過多年野外調查和選擇，確定了一株秋葉紅色明顯且時間較長的優良母株，從其母株上采種、播種繁殖形成 A、B、C、D、E、F、G 號 7 個家系，而本試驗中所采用的元寶楓A號是從A號家系單株嫁接繁殖得到的3年生無性系苗。元寶楓F號同樣是從F號家系單株經過上述過程繁育而來。元寶楓A號和元寶楓F號是其中兩個形態及秋季葉色差異顯著的單株，其中，元寶楓A號秋季葉色表現為鮮紅色，葉柄較短，樹冠寬廣；元寶楓F號秋季葉色表現為金黃色，葉柄長而纖細較柔軟，樹冠窄。嫁接所用的砧木是同批次得到的元寶楓實生苗，種子采自于山東省高橋國有林場10年生以上的元寶楓大樹。

葉片采自于2018年9月份，每個系號分別采集葉片。采集時，用酒精輕微擦洗后用錫箔紙包好后，立即放入液氮中帶至山東農業大學實驗室。從液氮中取出后迅速放入-80℃冰箱保存備用。

1.2 槭樹外觀形態測定

使用游標卡尺測量4個系號的槭樹葉片長度、寬度和葉柄長度，用測桿和圍尺分別測量其樹高和胸徑。

1.3 槭樹DNA含量的測定

1.3.1 溶液配備

溶液Ⅰ：將4.2 g濃度為0.1 mol/L的檸檬酸和1 ml的0.5%的吐溫20混合，將其定容至200 mL，在4℃下保存備用。

溶液Ⅱ：將28.65 g濃度為0.4 mol/L的磷酸氫二鈉，PI 20 mg定容至200 mL，在室溫下保存備用。

1.3.2 材料處理與檢測

分別取兩個三角楓和元寶楓的無性系各少量的葉片，放在4個不同的干凈培養皿內并標號1、2、3、4 號（1、2、3、4 號分別代表三角楓 1 號、三角楓 2號、元寶楓A、元寶楓F。要注意避開葉脈的干擾）。用移液槍取 200μL溶液Ⅰ和600μL溶液Ⅱ分別加入4個培養皿，在此裂解液中用鋒利的雙面刀片切碎葉片。之后靜置10min左右，使其裂解。（一般嫩葉只需3-5min）

裂解之后的葉片溶液經過尼龍篩網過濾，將所得濾液在13000 r/min的條件下離心30s，4個培養皿分別過濾到4個不同的Eppendorf管中，分別標號 1、2、3、4 號。 之后加入 PI（染料）使染料和葉片溶液整個的溶液濃度大約維持在0.1mol/L左右。

4 個不同的 Eppendorf管中標號的 1、2、3、4 號對應是三角楓1、三角楓2、元寶楓A號、元寶楓F號，分別用1 mL移液槍取上滴0.1mL處的液體，加入流式細胞儀內進行檢測。

1.4 數據處理

運用Excel 2007和SPSS 22軟件進行統計分析。

2 結果與分析

2.1 流式細胞儀檢驗結果

經過流式細胞儀檢測分析后，得到4個槭樹品系的圖像（圖1-圖4）如下：元寶楓的活細胞數所占比例是優于三角楓的，具體活細胞所占比例的關系是：三角楓1號＜三角楓2號＜元寶楓A號＜元寶楓F號。而DNA含量方面三角楓高于元寶楓。尤其三角楓1號，DNA含量較高。由于采集葉片時間正處秋季，葉子的纖維素含量過高，雖然采集的是嫩梢基部的綠葉，但是總體效果不是太好，黑色雜質部分較多（主要是由于季節的原因）。

圖1 三角楓1號檢測圖像

圖2 三角楓2號檢測圖像

圖3 元寶楓A號檢測圖像

圖4 元寶楓F號檢測圖像

2.2 形態特征比較

三角楓1號枝干高大挺拔，葉片肥厚寬大，當年新生枝條鮮綠色；三角楓2號，樹冠分散，葉片、樹高等形態數據明顯小于三角楓1號；元寶楓A號和元寶楓F號形態數據較為相似，樹高有所差距，葉片表現形態基本一致，葉長、葉寬在60 mm和90 mm左右。四個槭樹品系的葉片形態學比較結果如表1所示。兩個三角楓品系間差異顯著。

表1 形態特征比較

3 討論與結論

流式細胞儀能夠自動快速地進行植物的倍性檢測[7-8]，流式細胞儀進行植物倍性鑒定的數據真實可靠，多次得到試驗證實。本文用流式細胞儀鑒定兩個三角楓品系和兩個元寶楓品系，通過試驗數據分析，得到春季嫩葉的葉尖是最優檢測時間和位置；最優裂解液是0.1 mol/L的檸檬酸和0.5%的吐溫20制成的混合液取200ul，再加入0.4 mol/L的磷酸氫二鈉600ul。檢測得到的其活細胞數和DNA含量均差異差異較為顯著，具體活細胞所占比例的關系是：三角楓1號＜三角楓2號＜元寶楓A號＜元寶楓F號；DNA含量方面三角楓高于元寶楓。

多倍體個體在植物界中廣泛存在，這是植物趨于進化變異、適應新環境的重要途徑之一[9]。多倍體育種在林業植物新品種發展中具有巨大潛力，林木多倍體在長勢和抗逆性方面均優于普通種質[10]。多倍體研究當中，對形態學的比較分析是非常必要的[11]，本試驗就是對各槭樹植物形態進行測量比較的，得到結果，三角楓1號的形態學數據明顯大于三角楓2號，其枝干高大挺拔，葉片肥厚寬大；元寶楓A號和元寶楓F號形態整體較為相似。

槭樹植物作為傳統的彩葉樹種[12-13]，社會需求量越來越大，其育種繁殖研究肯定會成為熱點。槭樹多倍體研究為槭樹植物新種質提供了理論基礎，會加速槭樹植物新品種的培育與繁殖。總之，流式細胞儀是快速便捷鑒定植物倍性的現代化科技手段，本試驗通過用槭樹科植物對該類群進行倍性檢測，是對該領域一個新的探索，同時也為槭樹科植物多倍體育種提供了一定的方向和目標。