基因組學技術解碼天然產物合成

池淏甜，陳實

基因組學技術解碼天然產物合成

池淏甜，陳實

武漢大學 藥學院 組合生物合成與新藥發現教育部重點實驗室，湖北 武漢 430071

天然產物一直以來都是新藥發現的重要來源。自20世紀末以來，隨著組學技術的不斷發展，許多生物的基因組被破譯并解析，發現基因組中潛藏著眾多未知的天然產物生物合成基因簇，而這些基因簇在實驗室生長條件下無法表達或低表達。因此，需要綜合運用多種學科深入挖掘生物中潛藏的具有新型結構和生物活性的天然產物，使其廣泛應用于人類的生產生活。文中將從天然產物合成基因簇的挖掘、“沉默”天然產物合成途徑的激活和生物底盤構建3個方面簡述基因組學技術在天然產物挖掘中的研究進展。

基因組學，天然產物，基因挖掘，生物底盤

20世紀40年代，第一個抗生素青霉素被發現并成功運用于臨床以后，已有數千種結構多樣的天然產物被發現并廣泛應用于人類的生產生活中[1]。天然產物已成為抗生素、免疫抑制劑、抗惡性細胞增生劑、抗高血壓和抗病毒等藥物的重要來源[2-3]。在過去的35年中，美國FDA批準的藥物超過半數都是源于天然產物[4]。因此，挖掘生物中的天然產物是制藥產業的重要支柱之一。

傳統觀點認為生物只能產生數量有限的次級代謝產物。但隨著DNA測序技術和生物信息學的快速發展，鏈霉菌和曲霉屬真菌的第一個基因組序列被公布[5-6]，生物潛藏的天然產物合成能力被發現。生物信息學分析預測鏈霉菌基因組，發現其可以產生約150 000多種潛在的抗菌藥物[7-8]，然而到2005年只有約7 600個天然產物被確認[4]。在標準的實驗室生長條件下，多數次級代謝產物都未能表達或是低表達。這些“沉默”的生物合成基因簇(Biosynthetic gene clusters，BGCs) 可能編碼眾多結構新穎的生物活性分子，而這些天然產物可以廣泛用于醫藥或是畜牧業[9]。因此，挖掘并喚醒這些“沉默”的次級代謝途徑可以極大地豐富現有的天然產物庫，為研發更具臨床應用價值的藥物，解決愈發嚴重的抗生素耐藥性問題提供來源[10]。

組學時代的來臨，基因組學、轉錄組學、蛋白組學和代謝組學等學科研究的不斷深入，有利于挖掘并激活生物中“沉默”的天然產物合成途徑。本文將從天然產物合成基因簇的挖掘、“沉默”天然產物合成途徑激活和生物底盤構建3個方面介紹組學技術在天然產物挖掘中的研究進展。

1 天然產物合成基因簇的挖掘

16S核糖體RNA (Ribosomal RNA，rRNA)的分析數據顯示，只有1%的細菌可以在實驗室條件下進行培養[11]。因此為了獲得活性豐富的天然產物，就需要突破傳統基于生物活性尋找天然產物的方法，尋找新的方法。宏基因組學則直接從環境DNA (Environment DNA，eDNA) 中獲取隱藏的編碼天然產物的基因序列[12]?；诳焖俦憬莸臏y序技術和累積的豐富數據信息，這種新方法可以打破傳統篩選模式，挖掘更多結構多樣、生物活性優良的天然產物。

1.1 宏基因組學

宏基因組學的挖掘工作流程主要分為兩種。傳統方法需要構建巨大的cosmid文庫，并對單個eDNA克隆進行功能篩選。篩選克隆的方法較為多樣，如可視的檢測信號、生物活性、報告/生物傳感器或特定的催化反應。最新發展的方法是基于生物合成中保守DNA序列的相似性，選擇性地獲取環境樣本中潛在的生物合成基因簇。隨后將篩選得到的基因簇進行異源表達，最終獲得新的化合物[13]。

傳統方法中，宏基因組文庫是通過提取eDNA、克隆并連接到穿梭載體上，然后轉化到合適的異源宿主中而構建得到的。篩選陽性克隆的主要方法是觀察表型或色譜分離鑒定，也可以用報告/生物傳感器篩選系統，如代謝調節表達系統(Metabolite-regulated expression，METREX)[14]和基質誘導基因表達篩選系統(Substrate-induced gene expression screening，SIGEX)[15]。然而，這種方法發現的天然產物較少，結構相對比較簡單，如抗菌色素(Violacein)[16]、靛玉紅(Indirubin) 及其同分異構體(Indigo)[17]、N-?；野彼醄18]等。

最新發展的方法是從環境樣品中提取粗eDNA，通過聚合酶鏈反應(Polymerase chain reaction，PCR) 擴增子特異地針對天然產物生物合成基因簇內的序列進行篩選。其中PCR擴增子的混合物稱為天然產物序列標簽(Natural product sequence tags，NPSTs)?；贜PSTs的系統發育關系預測工具，如天然產物多樣性預測工具(Environmental surveyor of natural product，eSNaPD)[19]和天然產物結構域檢測工具(Natural product domain search，NaPDos)[20]，可以對DNA序列標簽進行系統分類和生物合成來源評價，并與數據庫進行比較，重組潛在的目標生物合成基因簇。新方法構建的宏基因組文庫是由重組的生物合成基因簇所組成，可以排除大多數與生物合成途徑無關的DNA序列。蛋白酶體抑制劑landepoxin A是通過該方法篩選得到，它是通過比較酮合成酶(Ketosynthase，KS) 結構域序列標簽和已知的環氧酮生物合成基因簇的KS結構域，從宏基因組樣本中識別環氧酮蛋白酶抑制劑的衍生物而發現[21]。Brady等通過該方法篩選到色氨酸二聚體hydroxysporine和reductasporine[22]、細胞毒性蒽環霉素arimetamycin A[23]、抗生素tetarimycin A[24]、malacidins A和B[25]、蛋白酶體抑制劑clarepoxcins A-E、landepoxcins A和B[21]。

1.2 生物信息學

自20世紀末對生物體進行基因組分析以來，已有超過7 000個微生物的基因組信息被報道。在這之前，人們認為產生次級代謝物的微生物只含有少數幾種BGCs。然而，阿維鏈霉菌和天藍鏈霉菌的基因組解碼后發現有20–37個未知的生物合成基因簇[6,26–27]。生物信息學分析顯示天然產物生物合成基因簇超過總基因組的5%–7%[28]。絲狀真菌構巢曲霉的基因組具有更大的潛力，推測有56條次級代謝途徑[29]。此外，分析不同生態位的生物群落，如人類微生物群[30]和環境樣本[31]，進一步揭示了天然產物的多樣性。

隨著新一代測序技術的應用，DNA序列分析的處理速度和準確性顯著提高，成本大幅度降低。獲得的大量基因組分析數據讓公共數據庫很好地建立起來，利用BLAST和FASTA可以在一定程度上推斷出未知基因的功能[32-33]。目前，除了利用同源性預測功能外，隱馬爾可夫模型(Hidden Markov model，HMM) 分析蛋白質家族(Protein family，Pfam) 被廣泛應用[34]。專門分析預測BGCs產物的統計模型antiSMASH也被公開[35]。由于計算機處理能力的顯著提高，蛋白質功能預測的精確度也有所提升，BGCs的評估更加精準[36]。因此，從基因組序列數據中挖掘次級代謝生物合成基因簇的方法被廣泛應用。

分析基因組中可能存在的次級代謝生物合成酶的編碼基因是挖掘新型天然產物的經典方法。雖然次級代謝物結構豐富多樣，但其生物合成機理是相對保守的，尤其是核心酶的氨基酸序列相似度非常高[37]。經典挖掘方法運用了反向遺傳學原理，即以一個或多個“參考”酶的基因序列來確定目標生物基因組序列中的同源基因。常用軟件有BLAST[38]、DIAMOND[39]、HMMer[40]和antiSMASH，其中antiSMASH的3.04版本可以識別44種不同的基因簇類型[35,41-42]。經典挖掘方法找到的生物合成基因簇通常都是較容易識別的，如泰斯巴汀(Teixobactin)[43]、卷曲霉素(Cypemycin)[44]、瑞斯托霉素(Ristomycin)[45]等。

最新發展的方法不再專注于參與合成的單一基因，而是通過分析部分或全部基因簇、抗性或調控基因來深入挖掘新型天然產物。Cimermancic等運用雙態HMM建立了一個尋找BGCs的算法[46]。首先用677個已驗證的次級代謝生物合成基因簇和隨機選取的非次級代謝生物合成基因序列中的Pfam域字符串驗證該模型。然后用該概率模型對1 154個原核生物基因組進行篩選，得到33 000個可能的BGCs，其中有10 700個BGCs的評分很 高[46]。這些分析數據表明挖掘微生物中的新型天然產物潛力巨大。

隨著人們對天然產物生物合成途徑的認識不斷深入，發現BGCs不僅含有編碼天然產物合成的生化酶，還有調控元件、轉運蛋白和抗性基因等。因此，逐漸發展出基于抗性或是調控因子的天然產物挖掘方法。Wright等驗證了對糖肽和安莎霉素類抗生素耐受的微生物更有可能產生類似的化合物，并開發了基于抗生素耐藥性的挖掘平臺用于分離特定的抗生素產生菌[47-48]。Moore等則將這種方法進一步改良優化，開發了一種靶向基因組挖掘方法[49]；他們篩選了86株海洋放線菌屬的菌株，確定了一個在細菌脂肪酸合酶附近的非常規PKS-NRPS基因簇。通過克隆、異源表達和突變分析，發現該基因簇與已知的脂肪酸合成酶抑制劑硫拉霉素的生物合成有關。因此，將假定的耐藥基因與“沉默”的次級代謝基因簇相關聯，是一種挖掘天然產物的有效途徑。

2 “沉默”天然產物合成途徑的激活

宏基因組學、生物信息學解析基因組序列發現的BGCs在特定生長條件下沒有表達或是表達量低檢測不到，這些BGCs被稱為“沉默”天然產物生物合成基因簇。目前主要有兩種策略可以激活這些“沉默”BGCs。一是隨機激活，主要有對生長條件的經驗優化[50]、添加化學誘變劑[51-52]、微量金屬離子[53]、提供外源性小分子[54]、核糖體工程[55-57]、與其他生物共培養等方法。二是基于基因組序列的靶向激活[58]，主要針對調節基因[59]。

2.1 隨機激活

隨機激活通過高通量篩選獲得目的菌株。改變菌株的生長環境，如溫度、pH、共培養或添加化學誘導劑等，均可誘導BGCs表達[50-51,53-54]。在spp.培養基中加入低濃度稀土元素如鈧和鑭，不僅提高了已知抗生素的產量同時誘導了新型天然產物的產生[60-61]。2016年，篩選含有 30 569個小分子的化合物庫，發現了19個新的化學誘變劑[62]。這些誘變劑能夠使天藍色鏈霉菌菌落的色素沉著，而色素的產生又通常與天然產物的生成有關。其中ARC2被認為是一種極具潛力的化學誘變劑，其衍生物Cl-ARC用于篩選50株不同的放線菌，有至少23%的BGCs被激活，還有3種罕見的對細菌和真核生物具有活性的天然產物[62-63]。煙曲霉菌與鏈霉菌進行共培養激活了煙曲霉菌中一個聚酮類BGC的表達，發現了一種新型多酚類天然產物并命名為煙環烷(Fumicyclines)[64]。這類化合物對的生長有一定抑制作用，并可以在防御真菌時發揮作用。

變鉛青鏈霉菌中S12的突變激活抗生素actinorhodin的生物合成途徑，而該BGC在變鉛青鏈霉菌中通常是沉默的[65]。進一步研究發現編碼RNA聚合酶(RNA polymerase，RNAP)、30S核糖體蛋白S12和其他核糖體蛋白的基因突變可以上調特定BGCs的轉錄和翻譯。鳥苷四磷酸 (Guanosine tetraphosphate，ppGpp) 是細菌適應環境壓力非常重要的信號素，也可以誘導抗生素的生物合成[66]。S12是細菌核糖體小亞單位的組成部分，參與翻譯起始并決定翻譯的準確性。ppGpp可以與RNAP結合，參與控制rRNA的生物合成同時調節RNAP在不同啟動子上啟動轉錄的能力[67]。因此懷疑RNAP的突變可以使其模仿與ppGpp結合的構象，由此激活沉默BGCs的轉錄[68-69]。有研究使用作用于核糖體的抗生素鏈霉素和慶大霉素以及作用于RNAP的抗生素利福平分別對不同的放線菌進行篩選，使編碼S12的基因和編碼RNAP的β-亞基的基因自發突變。最后發現中殺菌素鏈霉菌的突變株產生了8個抗菌天然產物，隨后的結構研究顯示這是一種新型抗生素piperidamycins[55]。假單胞菌、芽孢桿菌、分支桿菌等微生物的核糖體突變都可以激活生物合成基因簇[61,65]。此外，全局調控因子的改變也會誘導某些“沉默”BGCs的表達。如將天藍色鏈霉菌中多效調控基因的等位基因導入到異源鏈霉菌中，誘導產生了具有廣譜抗菌活性的pulvomycin[70]。

2.2 靶向激活

靶向激活相較于隨機激活具有更好的可控性和可預測性。該方法需要設計和實施特定的策略來激活目標BGCs，通量低于隨機激活。已知天然產物生物合成基因簇內或附近編碼轉錄調控因子的基因會影響天然產物的表達[58-59,71]。因此，誘導激活因子的表達或敲除編碼抑制因子的基因都是非常有效的激活“沉默”BGCs的方法。

在產二素鏈霉菌基因組中發現一個編碼PKS的基因簇[72]。生物信息學分析預測該BGC的代謝產物是一種含有新型碳骨架的聚酮化合物，但qRT-PCR分析顯示該基因簇在實驗室生長條件下低表達。分析發現基因簇內的基因可能編碼特異性轉錄激活因子，該因子屬于LAL家族調控因子。過表達可誘導該PKS和其他生物合成基因的表達，發現了一類新型的大環內酯類抗生素stambomycins[72]。TetR家族抑制蛋白含有一個螺旋的DNA結合結構域和一個響應小分子配體的受體結構域。在特定的響應配體缺失時，TetR二聚體會與DNA結合阻止下游基因的轉錄[73]。失活TetR家族抑制蛋白可以激活多杰霉素(Jadomycin)[74-75]、卡那霉素(Kinamycin)[76]、aurici[77]、ceoelimycin[78]和gaburedins[79]等多種天然產物的表達。

目前使用天然啟動子、修飾啟動子和合成啟動子來挖掘天然產物是非常有效的靶向激活方法[58]。啟動子可能是激活“沉默”BGCs和提高天然產物產量所必需的。因此有研究小組不斷豐富啟動子庫[80]。他們已經成功合成了56個啟動子，將其分為強、中、弱3種不同強度的啟動子，并驗證在多個放線菌菌株中均有活性[81]。這種合成啟動子庫為未來更好地靶向激活生物合成途徑提供了更多選擇。

3 生物底盤構建

多數生物在實驗室生長條件下較難培養，遺傳背景復雜且不易進行基因操作，其他代謝途徑也會影響目標BGC的表達。因此，構建具有精簡化基因組的生物底盤，對于挖掘天然產物至關重要[82]。目前構建生物底盤主要有“自上而下”和“自下而上”兩種策略。

3.1 “自上而下”構建策略

基于對基因組認識的不斷深入，“自上而下”主要是去除贅余基因，降低非必要代謝途徑和復雜調控網絡的干擾。優化細胞代謝途徑提高對底物和能量的利用率，增加底盤的可預測性和可控性[83]。

“自上而下”的構建思路主要是通過比較分析來自不同生物的基因組，并結合已有的實驗數據，分析出非必需基因[84]。然后，使用質粒和線性DNA介導、位點特異性重組酶、轉座子和CRISPR/Cas系統等方法進行缺失，構建基因組精簡的底盤。目前，在大腸桿菌[85-89]、鏈霉菌[82,90-92]、枯草芽孢桿菌[93-95]和假單胞菌[96-98]等生物中開展了底盤構建工作。以阿維鏈霉菌SUKA17為例，研究者使用Cre-P重組系統對阿維鏈霉菌基因組進行分步缺失，去除了約20%的基因組，消除了67%的IS序列和78%的轉座基因。此外，SUKA17也是首個用于異源表達次級代謝生物合成途徑的放線菌底盤[92]。SUKA17基因組的穩定性增加且可以在基礎培養基中正常生長，不產阿維鏈霉菌內源次級代謝物如阿維霉素、寡霉素、菲律賓菌素和萜類化合物等。目前，已有超過30多種不同的生物合成基因簇在SUKA17中進行表達，如核苷類、多肽類、氨基糖苷類等[91,99]。多數BGCs異源導入到底盤后可直接檢測到目標代謝物，少數合成基因簇需要導入調控基因。如將75 kb含有pladienolide整個生物合成基因簇的BAC克隆插入到SUKA17中，并沒有產生pladienolide。轉錄分析表明，pladienolide生物合成基因簇和SUKA17基因組中并沒有相關的調控基因可以激活該代謝途徑。在導入調控基因后，突變株可以合成pladienolide。此外，SUKA17可以使經密碼子優化后的合成基因有效表達，產生植物萜類合成中間前體物質。阿維鏈霉菌基因敲除后的底盤更適用于表達多種不同的次級代謝生物合成基因簇，可能因為精簡化的底盤能為新引入的異源代謝途徑提供充足的生物合成前體物[100]。這些充分說明生物底盤的基因組穩定性好且系統兼容性強，為天然產物的挖掘提供良好的基礎。

3.2 “自下而上”構建策略

“自下而上”構建策略則是嘗試從頭合成生物底盤。隨著DNA合成、測序和移植技術的不斷發展，使從頭合成復雜且長的DNA序列成為可 能[101]。該方法主要使用PCR組裝具有同源序列的短片段，最終構建得到全合成生物底盤[102-103]。

2004年，使用PCR技術成功合成了一個長 32 kb的聚酮合酶基因簇[103]。雖然合成價格昂貴且錯誤率高，但這一成果使制備人工細胞成為可能。2008年，Venter等合成了第一個完整的生物體基因組尿道支原體JCVI-1.0[101]。該全合成基因組長582 970 bp，所含基因與野生型尿道支原體G37幾乎完全相同[104]。構建流程為化學合成101個5–7 kb具有重疊序列的片段，并通過測序進行了驗證。然后，通過體外重組得到約24 kb、72 kb (1/8基因組) 和144 kb (1/4基因組) 的中間片段。最后在釀酒酵母中組裝得到完整的基因組。

計算機設計好基因組序列，通過合成、組裝得到1.08 Mb的絲狀支原體基因組JCVI- syn1.0[104-105]。將其移植到山羊支原體受體細胞中，產生僅受該合成染色體控制的絲狀支原體細胞。JCVI-syn1.0的組裝是通過體外酶策略和酵母體內重組相結合完成的。JCVI-syn1.0具有預期的表型特征，能夠持續自我復制。隨后基于syn1.0基因組，設計并構建了531 kb的基因組JCVIsyn3.0，該基因組含有473個基因，編碼438個蛋白和 35個帶注釋的RNA[106]。合成基因組JCVIsyn3.0比任何已知的可以在無菌培養中生長的生物體的基因組都要小。首先，利用Tn5誘變技術來識別必要基因、準必要基因和非必要基因。隨后，驗證準必要基因。最后，通過設計、合成和測試，構建得到最小基因組JCVIsyn3.0。JCVIsyn3.0是一個多功能底盤，可以用于研究生命的核心功能和探索全基因組。這樣將為未來天然產物的挖掘提供更多可能。

4 展望

20世紀末，生物基因組測序的實現讓我們了解到基因組中天然產物生物合成基因簇比預想的多。實質上只有很小部分的天然產物被開發，多數在實驗室生長條件下是保持“沉默”的。隨著生物信息學、基因測序、分子遺傳學等學科的快速發展，天然產物合成基因簇的挖掘、代謝途徑的激活和生物底盤的構建在天然產物挖掘中得到了廣泛應用。我們可以綜合使用各種策略高效地挖掘并喚醒生物中“沉默”的生物合成基因簇(圖1)。

圖1 基因組學技術解析天然產物合成的流程

天然產物合成基因簇的挖掘中，宏基因組學揭示了未經培養的生物可以產生結構復雜并具有生物活性的天然產物，證明eDNA是一個豐富資源。然而宏基因組學仍需要突破兩個局限性問題，一是如何從土壤樣本中分離得到宏基因組學的DNA樣本庫。因為收集含有新型生物合成途徑的eDNA需要花費大量時間，并且需要懂得基礎的生態學知識。二是如何將宏基因組文庫中的BGCs進行異源表達。多數BGCs在異源宿主中是沉默的，可能是受密碼子、稀有tRNAs、毒性或穩定性等因素的影響。在挖掘到可能的天然產物生物合成途徑后，需要隨機激活或靶向激活“沉默”基因簇的表達。通常隨機激活不需要預先了解BGC的機理，且可以進行高通量的篩選，但對激活結果卻無法預估。靶向激活則需要預先對通路有所了解，其通量較低但是具有可控性和可預測性。此外，生物底盤的構建無論對于基因組挖掘還是激活“沉默”基因簇的表達都非常重要。目前有“自上而下”和“自下而上”兩種策略。其中“自上而下”是通過去除贅余基因得到精簡化的生物底盤?！白韵露稀眲t是從頭合成基因組。天然產物挖掘工作充滿挑戰，但隨著組學技術的不斷發展，將會有更多具有新型結構的天然產物被發現并廣泛用于人們的生產生活中。

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Genomics approaches decode natural products synthesis

Haotian Chi, and Shi Chen

,,,430071,,

Novel natural products have always been the most important sources for discovery of new drugs. Since the end of the 20th century, advances in genomics technology have contributed to decode and analyze numerous genomes, revealing remarkable potential for production of new natural products in organisms. However, this potential is hampered by laboratory culture conditions. Therefore, the integration of all these new advances is necessary to unveil these treasures, addressing the rise in resistance to antibiotics. In this review, we discuss the strategies of genome mining, inducing the expression of silent biosynthetic gene clusters and construction of biological chassis.

genomics, natural products, genome mining, biological chassis

10.13345/j.cjb.190219

陳實 楚天學者特聘教授、科技部中青年科技創新領軍人才、青年千人計劃專家、湖北省醫學領軍人才。先后碩博畢業于華中農業大學和上海交通大學；在麻省理工學院及哈佛大學進行博士后研究，2011年回到武漢大學任教。任和副主編。以通訊或共同通訊作者在、、、、等發表論文。主持基金委重點國際合作項目等，擔任973課題組長。致力于表觀遺傳、基因組修飾與編輯、合成生物學與藥物發現等研究。

池淏甜, 陳實. 基因組學技術解碼天然產物合成. 生物工程學報, 2019, 35(10): 1889–1900.

Chi HT, Chen C. Genomics approaches decode natural products synthesis. Chin J Biotech, 2019, 35(10): 1889–1900.

March 18, 2019;

July29, 2019

Supported by:National Natural Science Foundation of China (Nos. 31720103906, 31520103902).

Shi Chen. Tel/Fax: +86-27-68756643; E-mail: shichen@whu.edu.cn

國家自然科學基金(Nos. 31720103906，31520103902)資助。

(本文責編 陳宏宇)