發酵過程多尺度解析與調控的研究進展

劉延峰，李雪良，張曉龍，徐顯皓，劉龍，堵國成

發酵過程多尺度解析與調控的研究進展

劉延峰1,2，李雪良2，張曉龍1,2，徐顯皓1,2，劉龍1,2，堵國成1,2

1 江南大學 糖化學與生物技術教育部重點實驗室，無錫 214122 2 江南大學 工業生物技術教育部重點實驗室，無錫 214122

工業發酵科學致力于實現高產量、高轉化率和高生產強度的相對統一。通過從分子、細胞和反應器進行發酵過程多尺度解析與調控，實施全局與動態的優化與控制能夠確保發酵過程高效、轉化定向、過程穩定和系統有序。本文從發酵微生物代謝途徑動力學模型、細胞代謝特性、發酵提取相耦合與反應器設計四個方面，總結和討論發酵過程多尺度解析與調控的研究進展。整合分析發酵過程不同尺度特征并且針對性地開展多尺度整合調控是實現高效工業微生物發酵的重要策略。

動力學模型，細胞代謝特性，發酵提取相耦合，反應器設計

工業發酵科學是工業生物學的重要組成部分，是促進重要生物產品從實驗室制備走向工廠大規模生產的關鍵學科。工業發酵科學致力于從分子、細胞和系統不同層次解析工業環境下發酵微生物行為的基本規律，提高生物制造和生物工藝效率，實現高產量、高轉化率和高生產強度的相對統一 (圖1)。

發酵過程主要包含分子、細胞和系統3個層次，這3個層次交互作用并且共同決定著發酵過程的效率。例如枯草芽孢桿菌發酵合成N-乙酰氨基葡萄糖過程中，N-乙酰氨基葡萄糖合成途徑和競爭途徑基因表達在分子層次影響目標產物的合成效率；底物葡萄糖的和木糖的供給在細胞反應動力學層次決定產物合成的效率；反應器中攪拌轉速和溫度等條件在反應器層次影響目標產物的合成效率[1]。

圖1 多尺度發酵條件對發酵過程的調控

發酵微生物代謝途徑動力學模型設計與構建、細胞代謝特性分析與發酵過程調控、發酵-提取耦合系統開發與應用以及新型反應器設計 4個方面的進展顯著提升了工業發酵科學的技術手段，促進了發酵過程多尺度解析與調控。本文針對上述4個方面的研究進展進行總結和討論，并且對發酵過程多尺度解析與調控的發展趨勢進行了展望。

1 基于代謝途徑與發酵過程動力學模型的發酵過程優化與控制

將經驗轉變為數據模型并且預測發酵過程曲線是發酵工藝控制和優化的重要手段 (圖2)。發酵過程代謝模型在發酵工藝控制和優化中具有重要意義，主要應用于以下3個方面，包括：指導發酵過程放大、解決大型發酵過程中不易測量數據估算的限制以及指導發酵工藝優化以提高目標產物產量。

首先，基于代謝速率和生長動力學相結合的發酵過程模型可用于評估反應器放大過程中的限制條件，通過模型計算來指導發酵工藝調整和優化，如pH、DO和發酵最大體積等參數優化[2]。例如，針對絲狀真菌發酵過程，基于發酵過程模型的分析指導確定了不同工藝條件下的最優發酵體積，并且在此基礎上開發了在線控制策略模型，成功預測了生物量等系統狀態[3]。另外，在ω-3脂肪酸發酵過程中，動力學模型被用于分析、優化以及指導發酵工藝放大過程，并且模型分析發現控制發酵工藝劃為前期生長和后期合成過程的兩階段法連續發酵可以顯著提高目的產物合成效率[4]。根據數值分析和流體力學原理，計算流體力學能夠輔助預測流體流動、傳熱、傳質以及發酵放大過程的潛在限速步驟。計算流體力學與反應動力學相結合能夠為發酵過程放大提供指導[5]。

其次，建立發酵模型還可以解決大型發酵過程中檢測器因位置和成本因素等限制數據獲取的限制，包括發酵罐中不同位置存在的pH和DO梯度等。例如，在700 L發酵罐中進行乳酸發酵過程中存在pH梯度，通過產物合成動力學模型和流體動力學相結合的模型，pH梯度范圍得以準確地預測，并且用以指導發酵工藝優化[6]。

圖2 代謝途徑與發酵過程動力學模型的設計與構建

最后，發酵過程代謝模型能夠指導發酵工藝優化，以提高目標產物產量。針對發酵過程的復雜多變的特點，將群體平衡模擬 (Population balance modeling) 和控制論模擬 (Cybernetic modeling) 之間進行柔性連接，能夠使其形成系統性模型用以分析微生物和復雜發酵底物之間的發酵動力學關系，指導目的產物乙醇產量的提高[7-8]。結合Luedeking-Piret反應和Monod生長動力學，可對較難處理的分批發酵過程進行簡便建模，用以計算生長和產物合成動力學數據[9]。基于線性微分方程組的發酵過程動力學模型已被成功應用于指導青霉素、乙醇等典型發酵產品的發酵過程優化與控制[10-12]。

2 針對細胞代謝特性的培養條件和補料策略優化

通過分析細胞代謝特性鑒定影響細胞代謝的關鍵因素，然后針對細胞代謝特性進行發酵過程補料和控制是發酵過程優化的重要策略。

以枯草芽孢桿菌生產異源蛋白、功能糖等目標產物為例，對于不同目標產物需要針對性地優化培養基組成和補料策略[13]。當利用枯草芽孢桿菌合成人類生長激素 (hGH) 時，使用富含蛋白胨為氮源的補料培養基有助于菌體快速生長，并且使得目的蛋白產量提高了約3倍[14]。當枯草芽孢桿菌用于合成N-乙酰氨基葡萄糖時，采用富含酵母粉和蛋白胨的復合培養基有助于提高N-乙酰氨基葡萄糖產量，添加尿素可進一步顯著提高N-乙酰氨基葡萄糖的產量[1]。當利用枯草芽孢桿菌合成四甲基吡嗪時，在補料過程中添加(NH4)2HPO4可使四甲基吡嗪產量提高近2倍[15]。

使用特殊基因表達調控元件時，需要針對性地優化補料策略。例如采用特定條件激活啟動子調控目標基因表達時，需要優化特定的培養條件和補料策略。相關條件激活啟動子包括來源于枯草芽孢桿菌的葡萄糖饑餓誘導型啟動子P、磷酸鹽饑餓啟動子P、DO饑餓型啟動子P等[16-18]。

針對目標產物合成過程進行針對性且系統性的細胞代謝分析和前體供給平衡，能夠促進目標產物的合成。例如，優化畢赤酵母合成granulyte- colony stimulating factor (G-CSF) 過程中，通過整合分析培養基優化和轉錄組學數據，獲得了有利于細胞生長和蛋白質合成的培養基，使得目的產物 (G-CSF) 產量提高5倍[19]。以束絲放線菌為宿主生產安絲菌素P-3時，在工程菌株強化前體供給的基礎上，進一步結合發酵補料策略強化前體供給，即通過在60、96和120 h間歇性補加15 g/L果糖和1.64 g/L異丁醇，安絲菌素產量顯著提高[20]。

當目標產物積累對于細胞生長具有一定抑制作用時，針對性補加能夠緩解抑制作用的物質可以顯著促進目標產物合成。例如，以出芽短梗霉作為宿主生產蘋果酸時，培養基中需要添加30 g/L的CaCO3，用以緩沖低pH對細胞的毒害作用[21-23]。另外，通過原位產物分離策略也可以實現解除有毒性的產物積累對細胞生長的抑制，例如通過添加有機相來萃取目的產物游離脂肪酸，以減少產物積累對細胞的毒害作用[24]。

3 發酵過程與提取過程相耦合的過程設計與優化

生物合成途徑的調控機制包括誘導、營養阻遏 (包括碳、氮、磷、硫等) 和反饋調控等。其中，反饋調控是發酵與提取相耦合工藝 (product recovery/removal, ISPR) 及其優化所依賴的理論基礎。它指的是代謝途徑受其自身產物的控制，可以是限制已有酶的活性 (反饋抑制)，或者是阻遏相關酶的繼續合成 (反饋阻遏)。一般認為這是微生物進化出來的競爭和自保機制的一種。

工業生產中多種初級和次級代謝產物是具有反饋調控功能的，包括氨基酸、有機酸酸和抗生素等。例如，在大腸桿菌中，不但、和編碼的天冬氨酸激酶同工酶受到蘇氨酸、蛋氨酸和賴氨酸等終產物的反饋抑制，代謝途徑中的每個節點還受到各自中間產物的抑制[25]。檸檬酸對其合成途徑中的磷酸果糖激酶也有一定的抑制作用[26]。Sanchez和Demain總結了多種初級代謝產物反饋調控的例子[27]。抗生素的例子則更多，且通常是直接抑制其合成途徑中最后一步或者接近最后一步的酶，在此不再贅述。有些次級代謝產物還能首先通過物理和化學的機制對菌體產生破壞作用，比如乳酸乳球菌素Nisin[28-30]。Nisin是乳酸乳球菌分泌的一種小分子多肽，由于其對革蘭氏陽性菌具有很強的抑制作用，而作為多肽在人的消化道可以被迅速分解，常作為一種安全的防腐劑用于肉制品和奶制品中。其作用機理是通過與細胞膜中的磷脂及磷脂前體相結合，干擾細胞膜平衡離子濃度及pH的功能，造成胞內物質泄漏，破壞細菌的生理功能。與此類似但更加復雜的是傳統丙酮-丁醇-乙醇發酵中 (ABE fermentation) 3種溶劑尤其是丁醇對生產菌丙酮丁醇酸菌的抑制[31]。ABE發酵在二戰前曾是世界最大的生物產業，但戰后隨著石油工業的興起及原料成本的增加而迅速失去了競爭力[32]。其中由于產物抑制，總溶劑濃度不超過18–20 g/L，后期分離提取能耗較高也是其中的一個原因。近年來，由于化石燃料面臨枯竭及其對自然環境的巨大破壞，人們開始重新探索生物方法生產可再生能源，ABE發酵再次引起了研究人員的興趣。在2009年時，我國仍有至少12家ABE發酵工廠[33]，之后又有十幾家新建或者恢復生產[34]。

雖然通過基因工程的方法可以在一定程度上改進生產菌對產物的耐性[35]，但這與發酵提取相耦合的工藝并不矛盾，甚至是相輔相成的。在抗生素的生產中，ISPR通常采用膜分離或者是液-液萃取的方式[36]，其他產品還有用到結晶[37]。前面提到的Nisin傳統上是分批培養，發酵結束后通過泡沫分離進行提取[38]。Zheng等[39]發現，將泡沫分離與發酵工程相結合，在線提取Nisin可以明顯提高底物利用率和產量。關于ABE發酵-提取相耦合的研究則更多，幾乎所有常規的分離提取技術都有嘗試，包括液-液萃取、滲透萃取、精餾、滲透蒸發、氣提等[40-41]。美國現在仍在運行的唯一ABE發酵工廠明尼蘇達州的Green Biologics采用的是低溫真空精餾連續培養，其工藝流程應與圖3所示類似。為了進一步降低氣相中溶劑的分壓，還可以在精餾塔中注入惰性氣體[42]，相當于氣提與精餾相結合。實際上，發酵與一種以上分離提取技術相耦合的情況并不少見。同樣在可再生能源的大環境下興起的合成氣發酵(Syngas fermentation) 也面臨傳統ABE發酵類似的問題。Phillips等給出的過程流程圖就使用了超濾和精餾兩種技術[43]，簡化后如圖4所示。圖3、圖4各代表了ISPR回收目標產物的兩種基本思路：直接接觸式和間接接觸式。

除上述目標產物的反饋調控，發酵過程中最常見的副產物CO2對微生物的生長和代謝也有很大的影響。Shimoda等[44]的實驗發現，釀酒酵母在CO2的作用下呈現一階線性死亡動力學特性。溶解的CO2對青霉素生產菌的影響較為復雜：在延遲生長期，低水平的CO2能促進菌的生長，但是以犧牲青霉素的產率為代價。較高的CO2溶解度則會嚴重抑制底物的攝取，造成生產菌形態學上的變化，影響目標產物的產量[45]。在好氧發酵中，通過監測呼吸商(Respiratory quotient, RQ) 來推算反應器內生物代謝狀態是多尺度發酵控制的經典案例[46-47]。在合成氣發酵中，雖然CO2是Wood Ljungdahl路徑的底物，但推動反應進行的能源是由一氧化碳在一氧化碳脫氫酶(CODH) 的催化下還原鐵氧化還原蛋白來提供的[48-50]，如圖5所示。此外，氫氣在氫化酶的催化下被氧化也能提供一部分能量。原料氣H2和CO的比例決定整個反應的最終結果是否有CO2排出以及各個產物之間的比例[51]。Simpson等[52]通過提高CO2的溶解度將產品導向2,3-丁二醇。相反，降低CO2分壓則應有利于目標產物乙醇的合成。從發酵液中分離溶解的CO2可以使用選擇性膜分離技術，但成本和能耗較高，得不償失，目前未見報道。帝國化學工業(ICI) 在20世紀70年代末曾轟動一時的大規模單細胞蛋白生產所用60 m高的氣升式反應器，則是利用從底部到頂部高達303.975 kPa 靜壓差使溶解的CO2析出，使循環到底部的發酵液含有較低的CO2，達到緩解其對生產菌抑制的效果[53]。

圖3 真空精餾與發酵過程相耦合在線提取揮發性產物示意圖

圖4 合成氣連續發酵與過濾、精餾相耦合流程示意圖[42]

當然，發酵-提取相耦合也并不能適用于所有的發酵。使用基因重組大腸桿菌以果糖為原料生產的乙酸紫蘇酯的中間產品檸檬烯是不溶于水的，而且在很低濃度下即可完全抑制大腸桿菌的生長。一般的思路是在反應器內添加有機相來萃取檸檬烯。然而，由于檸檬烯在有機相中分配系數過高，這反而阻斷了反應的進行。Willrodt等[54]把檸檬烯的合成路徑與乙酸紫蘇酯的合成路徑分別在兩個大腸桿菌菌株中實現，然后以特定的比例將兩個菌株混合培養，對檸檬烯生產菌來講相當于產物在線提取，而對乙酸紫蘇脂生產菌來講相當于補料培養，很好地解決了檸檬烯溶解度低和生長抑制的問題。類似的例子并不多，可以說Willrodt等的工作為解決難溶、易揮發的中間產物抑制提供了一個新的思路。

圖5 簡化的Wood Ljungdahl路徑固定CO2示意圖，包括向乙醇、乙酸、2,3-丁二醇的延伸

有些微生物還會依據培養環境中的菌體濃度調節基因表達，但一般不被歸納到反饋調節，而是自動誘導，因為其原理是基于菌體自身分泌的微量信號物質——自動誘導因子。如果需要延長對數生長期進而得到更高的菌體濃度，將自動誘導因子的濃度控制在較低水平的方法與發酵-分離相耦合是一致的。總之，發酵與分離相耦合本質上是為了達到系統中菌體停留時間 (Cell retention time) 與水力停留時間 (Hydraulic retention time) 解耦，進而使發酵產物可以獨立于菌體濃度進行調節，給代謝調控更大的操作空間。

4 針對發酵動力學優化的反應器設計

發酵微生物代謝過程是生物反應器的核心和基礎，生物反應器服務于細胞代謝與產物合成。因此，針對發酵微生物代謝的特點設計反應器能夠顯著提升發酵過程的效率。在小型和微型生物反應器中，保持發酵參數的均一性相對容易[55]，但在工業規模的大型裝置中，其不均一性是不可忽視的[56-57]。解決方法只能是針對生產菌的代謝動力學進行反應器優化設計。我國科研人員[47]根據計算流體力學(CFD) 模擬結果，將一個12 m3攪拌釜反應器的徑向流攪拌槳更換成組合式的軸流攪拌槳來提高氣液兩相的混合效率，這不但顯著降低了攪拌能耗，還使頭孢霉素C的產量提高了15%。之后，該實驗室與Haring等[58]合作，通過CFD模擬與底物消耗動力學相結合，預測在一個54 m3的反應器內，底物濃度梯度的存在能造成18%–46%的產黃青霉素得率損失 (與完全混合的理想反應器相比)。經進一步研究，他們將CFD與更為復雜的代謝動力學模型相結合，提出了理性生物反應器設計策略[59]，如圖6所示。University of Massachusetts Amherst與LanzaTech合作將基因組規模代謝模型 (Flux balance analysis) 與流體力學、反應動力學和傳質模型相結合，對活塞流鼓泡塔合成氣發酵進行了研究[60-61]。

在特定情況下，反應器內底物的梯度可能產生有利的結果。Enfors等[62]用流式細胞儀觀測到在大規模反應器以及模型縮小反應器的動態環境的誘導下，大腸桿菌細胞的完整性得到了提升。有此類代謝特性的系統，可以考慮使用活塞流反應器，或者是多級反應器串聯發酵。南京工業大學團隊通過動力學模擬，優化了2–3級連續發酵生產二十二碳六烯酸 (DHA) 工藝，取得了比普通補料分批發酵高出將近一倍的產量[63]。合成氣發酵生產燃料乙醇工藝是通過反應器設計對發酵過程進行精確代謝調控的經典例子[60-61]。如圖5所示，Woold Ljungdahl路徑下從乙酰輔酶A經乙酸、乙醛到乙醇這一分支上，乙酸的合成產生ATP有利于菌體生長，而目標產物乙醇的合成則需要消耗還原當量，與菌體生長是競爭關系。這一步的調控，對維持系統的穩定性和產物的選擇性起著關鍵的作用。還原乙酸到乙醛的鐵氧還蛋白氧化還原酶以及催化乙醛成乙醇的醇還原酶通常都是過量表達的，對產物選擇性沒有太大的影響，反應基本上是受還原當量[H]的濃度決定[49]。還原當量主要來自于一氧化碳脫氫酶催化的COàCO2這一步反應，而這一步反應又直接受反應器傳質速率的控制，所以反應器的設計就直接決定了發酵的效果。

圖6 理性反應器設計工作流程

總之，無論是以有機物為底物的傳統發酵，還是近年來興起的氣體發酵，反應器的設計影響底物、產物、pH甚至溫度等在反應器內的分布，對代謝調控有直接或者間接的影響。有時候，僅僅是改變一下進料位置，就能顯著提高發酵的性能[66]。優化反應器設計能提高產量，降低能耗和成本，減少廢物排放。它涉及到合成生物學、蛋白質組學、反應動力學、流體力學、材料、機械、電子、計算機等多個學科，進一步將多學科深度融合是發酵產業邁向現代化的發展方向。

5 結論

針對工業發酵過程分子、細胞和系統3個層次，發酵過程多尺度解析與調控在發酵微生物代謝途徑動力學模型設計與構建、細胞代謝特性分析與發酵過程調控、發酵-提取相耦合系統開發與應用以及新型反應器設計4個方面取得了顯著的進展，促進了工業發酵過程高產量、高轉化率和高生產強度的實現。未來研究中，進一步從以下3個方面開展研究能夠提升基于多尺度發酵條件的過程優化與控制：1) 建立工業規模多尺度實時生物感應系統，包括在分子尺度實時監測代謝途徑的生物感應器，在細胞尺度實時監測細胞動力學特性的生物感應器，在反應器尺度實時監測多種代謝物濃度及多種發酵參數的在線檢測系統；2) 建立發酵過程大數據系統，使細胞生理代謝特性可視化，建立基于大數據指導下的發酵培養基與發酵過程優化；3) 建立智能化高效發酵與分離耦合過程，提升發酵過程與分離過程的適配性與協調性，提升發酵過程的智能化控制。綜上所述，進一步整合分析發酵微生物不同尺度特征并且針對性地開展多尺度整合調控能夠提升工業微生物發酵的效率并且拓展生物制造的應用范圍。

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Advances in multi-scale analysis and regulation for fermentation process

Yanfeng Liu1,2, Xueliang Li2, Xiaolong Zhang1,2, Xianhao Xu1,2, Long Liu1,2, and Guocheng Du1,2

1,,,214122,,2,,,214122,,

Industrial fermentation focuses on realizing the uniform of high titer, high yield, and high productivity. Multi-scaleanalysis and regulation, including molecule level, cell level, and bioreactor level, facilitate global optimization and dynamic balance of fermentation process, which determine high efficiency of biosynthesis, targeted directionality of bioconversion, process robustness, and well-organized system. In this review, we summariz and discuss advances in multi-scale analysis and regulation for fermentation process focusing on the following four aspects: 1) kinetic modeling of metabolic pathways, 2) characteristic of cell metabolism, 3) co-coupling fermentation and purification, and 4) bioreactor design. Integrating multi-scaleanalysis of fermentation process and integrating multi-scale regulation are expected as an important strategy for realizing highly efficient fermentation by industrial microorganisms.

kinetic modeling, characteristics of cell metabolism, co-coupling fermentation and purification, bioreactor design

10.13345/j.cjb.190244

堵國成 教授，博士生導師，教育部長江學者特聘教授、國家“萬人計劃”教學名師，長期從事工業微生物發酵領域的科研和教學工作。作為項目負責人承擔包括國家重點研發計劃項目、國家863項目、科技部重點領域創新團隊項目和教育部長江學者創新團隊項目等在內的國家和部省級項目8項。獲國家技術發明二等獎2項、國家科技進步二等獎1項，部省級科技成果一等獎5項，中國專利金獎 1項。擔任、副主編，編委。

劉延峰, 李雪良, 張曉龍, 等. 發酵過程多尺度解析與調控的研究進展. 生物工程學報, 2019, 35(10): 2003–2013.

Liu YF, Li XL, Zhang XL, et al. Advances in multi-scale analysis and regulation for fermentation process. Chin J Biotech, 2019, 35(10): 2003–2013.

June 11, 2019;

September 23, 2019

Supported by: National Natural Science Foundation of China (Nos.31622001, 31671845, 31600068), Natural Science Foundation of Jiangsu Province (No.BK20160176).

Guocheng Du. Tel/Fax: +86-510-85918309; E-mail: gcdu@jiangnan.edu.cn

國家自然科學基金 (Nos.31622001, 31671845, 31600068)，江蘇省自然科學基金(No.BK20160176)資助。

(本文責編 郝麗芳)