典型工業發酵過程環境變化下的細胞自適應行為與系統優化

丁健，羅洪鎮，史仲平

典型工業發酵過程環境變化下的細胞自適應行為與系統優化

丁健1，羅洪鎮2，史仲平1

1 江南大學 生物工程學院，江蘇 無錫 214122 2 淮陰工學院 生命科學與食品工程學院，江蘇 淮安 223003

工業發酵過程中，當細胞遭受到極端環境脅迫或劇烈環境變化時，細胞必須要作出必要的舉動來適應環境的劇烈變化。細胞的自適應行為有可能不能應對劇烈的環境變化，導致發酵失敗；但也有可能產生意想不到的效果，改善發酵性能。文中以畢赤酵母生產異源蛋白和丁醇發酵過程為例，闡述了環境變化條件下的細胞自適應行為及其基于自適應行為的發酵過程優化方法和策略，為利用基于細胞自適應行為的發酵過程優化提供參考。

細胞自適應行為，環境變化，發酵過程優化，異源蛋白生產，丁醇發酵

工業發酵產業在我國國民經濟中占重要地位，如何深化工業發酵的內涵和外延是發酵領域科研工作者需要深思的重要問題。近年來，通過先進生物技術的創新實現工業發酵的系統優化得到了廣泛關注，而微生物菌株是工業發酵的核心要素。但是，在工業發酵過程中，操作模式經常需要進行改變(如溫度、底物切換、操作環境、環境脅迫等)，微生物細胞必須對上述環境變化作出適應，以確保自我生存。上述細胞自適應行為將導致細胞內部基因轉錄、關鍵生物酶活性、代謝流、電子流等發生變化，并最終在發酵性能上得到體現。有時發酵性能可以得到提高，有時則惡化。如何充分利用“細胞自適應行為”，改善或穩定發酵性能是本綜述所要探討的主要內容。

1 環境變化下的細胞自適應行為與系統優化

1.1 環境變化下的細胞自適應行為

細胞自適應行為有兩種類型：1) 隱性自適應，也就是說即使由于細胞自適應、其內部結構發生了變化，但表觀發酵參數卻沒什么變化[1-2]，很長時間以后發酵性能的差異才能得到體現；2) 顯性自適應，當環境條件或操作變量發生后，表觀發酵參數很快就會發生顯著變化。比較典型的例子包括：在高濃度乙醇連續發酵過程中，將稀釋速率直接設定為0.04 h?1，發酵過程可以達到穩態；而將稀釋速率由0.027 h?1切換至0.04 h?1后，過程則在較短的時間內進入到周期振蕩狀態[3]；在丁醇發酵進入產酸期后添入廢棄畢赤酵母處理懸濁液，發酵產氣量迅速大幅增加[4]。細胞的這種自適應行為對于提高發酵性能指標，有時是有利 的[3-4]，有時則是有害的，必須通過一定的控制手段將其抑制或排除，以確保發酵性能的穩定[2]。

1.2 利用細胞自適應行為的過程優化

利用細胞的這種自適應行為改善發酵過程性能是可能的。以顯性自適應行為為例，在高濃度乙醇連續發酵過程中，細胞自適應所引發的周期振蕩狀態可以降低殘糖濃度、提高乙醇平均濃度和生產強度[3]。在利用帶遺傳質粒的釀酒酵母分批補料發酵生產b-半乳糖苷酶時，利用周期控制策略強行將葡萄糖濃度從“過量”向“匱乏”的狀態進行切換，并重復4–5個周期，可將細胞遺傳質粒的脫落率控制在較低水平，提高b-半乳糖苷酶的產量[5]。具有隱性自適應特征的發酵過程也可以利用數據聚類、代謝分析等手段[1-2]找出原因后，對有害的細胞自適應行為加以抑制，同樣也可以優化發酵過程[2]。

2 利用細胞自適應行為的優化

2.1 畢赤酵母高效生產異源蛋白

甲醇營養型畢赤酵母能夠在以甲醇為唯一碳源的條件下生長，基于這一特性開發出的表達系統是一種應用廣泛的異源蛋白表達系統。畢赤酵母蛋白表達系統通過誘導醇氧化酶啟動子(Alcohol oxidase，AOX)進行異源蛋白的合成。在異源蛋白表達過程中，甲醇起著碳源、能源和誘導劑的三重作用。與大腸桿菌等原核表達系統相比，畢赤酵母表達系統除了具有遺傳操作簡單、細胞生長快、易于培養等原核生物的特點外，還具有真核生物特有的加工、修飾蛋白的功能。畢赤酵母表達系統具有表達效率高、外源基因遺傳穩定、易實現高密度培養、蛋白翻譯后可被正確加工、蛋白產物分泌于胞外等眾多優點，已經成為極受青睞的外源蛋白表達宿主，產品種類涉及藥物蛋白、抗體、酶制劑、食品添加劑等。畢赤酵母表達宿主菌株主要包括兩種表型，即甲醇利用慢型菌(MutS) 和甲醇利用快型菌(Mut+)。Mut+型菌的AOX由1和2基因共同編碼，胞內AOX活性高、細胞利用甲醇速度快；而MutS型菌1基因缺失，AOX僅由2一個基因編碼，因此其胞內AOX活性較低，細胞利用甲醇的速度較慢。

典型的、利用重組畢赤酵母高密度培養生產異源蛋白的發酵過程可以大致分為細胞培養和甲醇誘導兩個階段。在培養階段，適宜的環境條件(如溶解氧濃度DO、甘油濃度等) 是細胞快速生長，同時保證細胞以較高生理活性狀態進入誘導階段的前提條件[6]。誘導階段中的環境條件(如溫度、甲醇濃度、DO等) 則決定了異源蛋白的表達水平[7-9]。畢赤酵母對培養和誘導階段環境的綜合自適應調節能力決定了細胞自身的生理狀態，并最終影響到異源蛋白的轉錄、翻譯、折疊、分泌，特別是最終的發酵性能指標。

2.1.1 細胞高密度培養條件下異源蛋白表達主要抑制物乙醇的控制方法

在使用MutS型畢赤酵母表達豬a干擾素(pIFN-a) 的過程中，即便采用相同的甘油流加策略和甲醇誘導控制策略，發酵性能也會表現出很大的差異[1]。“正常發酵”批次的pIFN-a抗病毒活性在106–107IU/mL，而“異常發酵”批次的pIFN-a抗病毒活性只有105IU/mL，甚至更低。

在細胞培養階段，所有10個發酵批次的DO變化、最終細胞濃度和甘油耗量是基本一致的。將誘導期內的各種表觀數據的組合(O2攝取速度OUR、CO2釋放速度CER、呼吸商RQ、甲醇濃度和流加速度) 在二維平面上進行聚類分析發現，“正常”發酵批次的表觀數據基本聚類于幾個特定區域，而“異常”發酵批次的表觀數據則散落于平面的各處(圖1)。

葡萄糖效應(Crabtree effect) 是細胞高密度培養時普遍存在的現象。有報道指出，在重組釀酒酵母和大腸桿菌表達外源蛋白的過程中，葡萄糖過量流加會導致代謝副產物乙醇和乙酸的積累，這本身就是細胞對于培養環境的一種隱性自適應行為，其結果最終導致目標蛋白表達水平和發酵穩定性顯著下降[10–11]。即便乙醇或乙酸被耗盡，這種發酵性能惡化也無法避免。細胞長時間處在高乙醇或高乙酸濃度環境，其功能骨架受到嚴重破壞，進而抑制目標產物的表達，而且這種抑制作用還是不可逆的。重組菌功能骨架因代謝副產物的嚴重積累而受到破壞是一種典型的和具有負面效應的“細胞隱性自適應”現象。因此，必須在細胞培養期遏制住上述“細胞隱性自適應”現象，才能保證發酵性能的穩定。

圖1 誘導期“正常”和“異常”發酵批次的表觀(在線測量)數據在二維平面上的聚類(純甲醇誘導)

畢赤酵母表達pIFN-a過程中，上述“細胞隱性自適應”行為(葡萄糖效應) 也會出現。在細胞流加培養期，使用傳統DO-Stat甘油流加策略時，某些批次的最終pIFN-a濃度也可以達到相當高的水平。如批次#1，最大乙醇濃度相對較低 (4.37 g/L) 且細胞處于高乙醇濃度環境的時間比較短(圖2，表1)。有時乙醇濃度高(7.08 g/L) 且細胞處于高乙醇濃度環境的時間較長，進入誘導期后AOX根本無法正常啟動，pIFN-a濃度很低(批次#3)。pIFN-a發酵性能不穩定的原因就在于此。商業化的甲醇電極，可以同時在線檢測甲醇和乙醇：細胞培養階段發酵液只含有乙醇；進入到誘導階段后，由于前期積累的乙醇全部消耗殆盡，發酵液中僅含有甲醇。因此，甲醇電極可以分別用于在線檢測細胞培養階段的乙醇和誘導階段的甲醇濃度，且互不干擾。在此基礎上，提出了一種基于乙醇/DO在線測量的“改良型”DO-Stat甘油流加控制策略，根據乙醇濃度測量值自動調節DO-Stat策略的流加延遲時間，交替利用甘油和積累的乙醇作為碳源，可以將培養期內的乙醇濃度控制在任意水平。控制乙醇濃度在低水平(約2.0 g/L)，則AOX被激活，pIFN-a表達順利穩定地進行；控制乙醇濃度在高水平(約10.0 g/L)，則AOX被抑制，pIFN-a表達無法進行(圖2， 表1)。高效穩定的pIFN-a表達控制策略得到了實驗驗證[2]。

2.1.2 聯合操控DO和甲醇誘導濃度促進異源蛋白表達

在確保重組菌達到高密度，且其功能骨架完整健全后，發酵就進入到甲醇誘導階段。誘導階段的主要目標就是通過合理地控制誘導條件，實現目標產物產量或活性的最大化。甲醇誘導體系的一個最主要的特征就是高耗氧，甲醇濃度和溶解氧濃度DO是影響誘導性能和目標代謝產物表達水平的主要操作或控制參數。甲醇消耗與O2消耗相互耦聯，在使用空氣的條件下很難同時將甲醇和DO控制在相應的設定水平。這時，只能選擇其中一個參數并將其優先控制于設定水平。因此，可行的甲醇和DO控制模式就只有以下兩種，即“高甲醇濃度/低DO”或“高DO/低甲醇濃度”。Mut+和MutS型的畢赤酵母是兩種最常用的表達宿主，但是，兩種模式菌株對不同控制環境的自適應行為是不同的[12-15]，難以形成統一的最優控制標準。有研究者針對利用Mut+和MutS型畢赤酵母表達目標產物提出了不同的、但具有一定普適效果的DO/甲醇濃度“次優(Sub-optimal)”聯合操控方案，并對“次優控制”條件下的細胞自適應行為與系統優化機理進行了歸納總結[16–17]。

圖2 使用不同甘油流加控制策略時，培養期內的乙醇、DO、甘油流加速度和細胞濃度的變化模式

表1 不同控制策略下的豬a干擾素的發酵性能和甲醇代謝關鍵酶的基因轉錄水平

Note: 1) ?: Refers to the gene transcriptional data collected at 40 h after initiating methanol induction; 2) Methanol/sorbitol co-feeding induction mode was adopted; 3) Methanol/sorbitol co-feeding ratio of 1:1 was applied for runs #1–#7, but 4:1 for run #8; 4) N/A presented no measurements.

MutS和Mut+型畢赤酵母在“高甲醇/低DO”和“高DO/低甲醇”誘導模式下顯示出不同的顯性自適應行為表征。有研究[16-17]以一株產人血清白蛋白-人粒細胞集落刺激因子突變體融合蛋白(HSA- GCSFm) 的Mut+型和一株產pIFN-a的MutS型重組畢赤酵母為模式菌株，探討了二者在“高甲醇/低DO”和“高DO/低甲醇”模式下的發酵性能差異，并與文獻結果[12-13,18-21]進行了綜合分析比較。對Mut+型畢赤酵母而言，通過限制甲醇流加的方式可將DO控制在10%左右，此時甲醇濃度降低到接近于0 g/L的水平，形成了“高DO/低甲醇”的誘導環境，誘導50 h后HSA-GCSFm濃度達到587.5 mg/L。而利用在線甲醇電極將甲醇濃度控制在5–8 g/L的較高水平，由于甲醇供應充足、耗氧劇烈，DO迅速降至接近于0%的低水平，形成了“高甲醇/低DO”的誘導環境，誘導50 h后HSA-GCSFm濃度僅有88.5 mg/L。但是，MutS型菌卻表現出與Mut+型菌截然相反的特性：同樣，在限制甲醇流加的條件下，可將DO控制在10%左右，甲醇濃度自然降低到接近于0 g/L的水平，形成了“高DO/低甲醇”的誘導環境，但誘導70 h后pIFN-a濃度僅有0.79 g/L。而將甲醇濃度控制在5–8 g/L的較高水平，DO自然降低到接近于0%的低水平，形成“高甲醇/低DO”的誘導環境，誘導70 h后pIFN-a濃度則高達1.86 g/L。

Mut+型畢赤酵母生產異源蛋白時，用限制碳源流加的方式來提高DO水平，甲醇濃度雖然很低，但細胞消耗利用甲醇速率的變化不大(僅降低10%左右)，這增加了甲醇利用效率，促進了異源蛋白的高效表達。而MutS型畢赤酵母生產異源蛋白時，限制碳源流加雖然提高了DO水平，但同時會導致甲醇消耗速率大幅下降(超過50%)，進而減少異源蛋白合成過程所需的碳源供給，顯著降低了異源蛋白的表達水平。以上結果總結歸納在表2中，總的結論就是：Mut+型畢赤酵母的“次優誘導控制”策略是“高DO/低甲醇”；而MutS型畢赤酵母的“次優誘導控制”策略則是在“高甲醇/低DO”。從轉錄組學分析的角度研究了Mut+型和MutS型畢赤酵母應對不同“次優控制”誘導環境的自適應調節機制：Mut+型菌在“高DO/低甲醇” (甲醇/山梨醇共混誘導) 的誘導環境下，上調的基因主要集中在甲醇主代謝、TCA循環和過氧化物酶體合成途徑中，下調的基因則主要集中在蛋白水解過程中。表明在該誘導條件下，甲醇和山梨醇的代謝活性高，細胞抗高DO沖擊能力強，錯誤折疊的蛋白減少。而MutS型菌在“高甲醇/低DO”的誘導環境下，上調基因主要集中于甲醇代謝、過氧化物酶體合成和核糖體蛋白合成途徑中，甲醇代謝和異源蛋白合成得到促進[17]。

表2 “高甲醇濃度-低DO”和“低甲醇濃度-高DO”誘導模式下Mut+和MutS型畢赤酵母異源蛋白表達量比較

Note: 1) N/A represented that the data not found; 2)?: Using the enzymatic data to replace the concentrations data.

2.1.3 甲醇濃度周期控制強化MutS型畢赤酵母表達外源蛋白

將狀態變量(如濃度、比生長速度、底物比消耗速度等) 定值控制在恒定水平，是實現發酵過程優化的普遍控制方法。但是，周期控制(Periodic control)，無論是自發式的[22]還是強制式的[5]，在某些特定情況下比定值控制具有優勢。所謂周期控制，就是將狀態變量以一定的頻率在兩種不同的狀態之間反復切換，并具有一定數量的周期重復循環次數。

周期控制在發酵過程控制領域也有一定的應用和研究報道[4-5,23-24]。實際上，周期控制與細胞自適應行為和基于自適應行為的過程優化密切相關。比如，Ye等[23]利用費氏丙酸桿菌發酵生產維生素B12，發現細胞在厭氧環境中生長較快，但是長期在厭氧環境中培養，生成的丙酸濃度較高，會抑制細胞生長。細胞長期處在有氧環境下會造成細胞生長速率和產物合成大幅下降。因此，采用一種周期性的、在有氧和厭氧環境進行切換的操作方法來解決上述問題。與傳統厭氧發酵相比，利用上述“周期控制”發酵的細胞濃度提高了189%，丙酸控制在較低水平(5.08 g/L?2.78 g/L)，維生素B12產量提高了 1倍左右。馬善康等[24]通過大幅改變發酵環境，利用雙碳源(甲醇和甘油) 交替刺激畢赤酵母高效表達人尿激酶原，5 L罐上的發酵結果表明，與對照相比(單純流加甲醇)，雙碳源交替刺激法的人尿激酶原酶活可以提高57%。

MutS型畢赤酵母嗜好“高甲醇/低DO”的誘導環境，在利用MutS型畢赤酵母表達生產pIFN-a和人源溶菌酶(hLYZ) 的過程中，通常將甲醇濃度控制在5–10 g/L。但是如果細胞長期處于“高甲醇/低DO”的誘導環境，由于O2匱乏，由AOX催化的甲醇代謝的第一步反應(甲醇+O2?甲醛) 成了律速反應步驟。這時，甲醇(有毒物質) 不斷地跨膜進入細胞體內，卻又無法高效消耗利用，胞內積累嚴重，最終造成細胞代謝活性和目標蛋白合成能力逐步下降，限制了目標產物誘導表達效率的提升。為解決這一問題，有研究提出了一種新穎的周期甲醇誘導控制策略，并將其用于MutS型畢赤酵母表達生產pIFN-a和hLYZ的過程中[25]。研究的基本思路如圖3所示。使用傳統的“高甲醇/低DO”誘導策略，甲醇和DO長時間處于高濃度和低濃度，會造成毒性物質甲醇在胞內的積累；而在“高DO/低甲醇”的極端誘導環境下，細胞可以吸收并有效利用胞內的毒性物質甲醇合成目標產物。甲醇周期誘導控制就是利用上述兩種極端誘導環境下的細胞自適應特性，在“高甲醇/低DO”的誘導環境下，增強誘導強度(T1= 7 h)；而在“高DO/低甲醇”的誘導環境下，旨在解除胞內甲醇毒性作用，恢復細胞的代謝活性(T2=4 h)。圖5對每一完整控制周期內的T1和T2進行了優化。以此循環往復，持續5–6個周期。相比于傳統的定值控制策略(甲醇濃度和DO定值控制)，使用該甲醇周期控制策略進行甲醇誘導，兩種目標蛋白的產量和活性都有大幅提升。表達生產pIFN-a時，使用傳統的甲醇濃度定值控制策略(8–10 g/L)，胞內甲醇濃度最高可達0.014 g/g DCW，誘導后期pIFN-a不能持續表達。而使用周期誘導控制時，甲醇誘導強度并沒有受到太大影響，胞內甲醇濃度控制在極低水平(≤0.003 g/g DCW)，pIFN-a抗病毒活性達到水平3.90×107IU/mL，比使用“甲醇濃度定值控制”策略時提高了86%，與低溫、通純O2進行甲醇誘導時的水平相當[26](圖4)。代謝強度(OUR、CER) 維持在較高水平，甲醇比消耗速率也有提高。表達生產hLYZ時，使用周期誘導控制也可將胞內甲醇濃度控制在低水平，最終hLYZ酶活達到2.15×105IU/mL，比使用“高甲醇/低DO”誘導控制策略提高了69%。周期誘導控制策略能提高MutS型畢赤酵母生產異源蛋白的通用性得到了一定程度的驗證。甲醇周期誘導控制策略有效整合了“高甲醇/低DO”和“高DO/低甲醇”兩種極端誘導環境下細胞自適應行為的優點，使得目標蛋白的產量和活性得到大幅改善。

圖3 甲醇周期誘導控制提高發酵性能的概念圖

2.2 丁醇 (丙酮A-丁醇B-乙醇E，ABE) 發酵過程中的細胞自適應行為及其優化

丁醇和丙酮都是重要的平臺化合物。另外，它們也都是清潔/高效的液態燃料或燃料添加劑。丁醇作為燃料添加劑使用時，其許多性能均優于乙醇[27-31]。丙酮也是高效的柴油助燃劑，可以大幅改善柴油的燃燒性能，燃燒后產生的尾氣中SOX和NOX含量低[32-33]。丙酮是丁醇發酵的主要副產物(丁醇60%、丙酮30%)。隨著化石資源的日益枯竭，微生物發酵法生產丁醇和丙酮重新受到人們的重視。目前國內外科研人員對丁醇發酵的研究主要包括代謝工程改造微生物細胞、利用廉價原料發酵生產丁醇、通過分離耦合技術解除丁醇對微生物細胞的抑制作用以及發酵過程優化與控制策略改善丁醇發酵性能等。關于上述幾個方面的相關綜述和成果最近幾年已有較多論文發表[34-35]，在此不再贅述。這里，主要針對丁醇發酵過程環境變化下的細胞自適應行為與系統優化方面進行探討，為丁醇發酵過程優化提供新的思路和參考。

2.2.1 電子受體添加條件下的梭菌生理代謝自適應特征以及丁醇合成的強化

提高丁醇產量、丁醇/丙酮比或丁醇占總溶劑比例是改善丁醇發酵性能的主要目標。添加電子載體(如中性紅、甲基紫等) 可導致丙丁梭菌胞內的代謝流發生變化，是提高丁醇/丙酮比的比較公認的手段[36]，但是，丁醇/丙酮比的提升實際上是以降低丙酮濃度或總ABE濃度為代價的。另外，電子載體一般是對細胞有毒的化學染料或色素，其添加增加了產品分離純化過程的操作成本。

圖4 甲醇周期控制策略下的pIFN-a發酵性能

圖5 理論確定每一誘導周期內的T1和T2

最近，有研究提出了電子受體添加策略強化丁醇合成的新型發酵策略[37]。外添Na2SO4/CaSO4等電子受體后，梭菌胞內發生硫還原反應，少量的SO42–被還原成H2S。該反應打破了胞內H+/e–的原有平衡，造成e–相對過剩和H+相對匱乏。這時，細胞為了自身正常生存，必須要恢復H+/e–的原有平衡。在梭菌胞內電子穿梭傳遞系統中，NADH再生反應和H2合成反應都需要H+和e–，并因此產生競爭。但NADH再生反應中e–的需求量是H2合成反應中e–需求量的2倍，在H+相對匱乏的情況下，為了消耗過量的e–，更多的e–/H+(電子/質子對) 必須向NADH再生途徑遷移，使得丁醇合成得到強化(圖6)。在此過程中，細胞應對環境變化的自適應行為得到了充分體現。7 L厭氧發酵罐下，當發酵進入到產溶劑期后，在發酵液中添加2.0 g/L的CaSO4或Na2SO4，最終丁醇濃度分別達到12.80 g/L和12.94 g/L，比不添加電子受體的發酵批次的相應值提高35%左右，丁醇/丙酮比也有一定幅度的增加(15%)。添加Na2SO4等廉價電子受體提高了丁醇濃度，雖然提高幅度有限，但通過合理地利用細胞自適應行為，可為改善丁醇發酵性能提供一條新的途徑和優化模式。

圖6 電子受體添加條件下的丙丁梭菌代謝簡圖

2.2.2 梭菌/釀酒酵母混菌培養改善丁醇發酵性能

混菌培養作為一種重要的發酵技術，廣泛應用于食品生產、生物降解和生物燃料生產等領域。近幾年，在實驗室規模，研究者們已經將混菌培養技術用于丁醇的發酵生產。Tran等[38]將丁酸梭菌和枯草芽孢桿菌進行混菌培養，由于芽孢桿菌分泌a-淀粉酶，并在其生長過程中消耗培養液中的氧氣，而自產的a-淀粉酶可以將淀粉分解為單糖，在無需對可溶性淀粉進行預處理的前提下改善了丁醇的發酵性能。Li等[39]將拜氏梭菌和酪丁酸梭菌混合培養，拜氏梭菌可以將酪丁酸梭菌產生的丁酸直接用于丁醇合成。在某些混合培養體系中，“輔菌”被置于惡劣的生存環境之下。“輔菌”為了生存，通過其自適應行為被迫釋放出某些有益于“主菌”生存或代謝的物質或輔因子，而“主菌”則通過充分利用上述物質，提高其自身的發酵性能。Ashe等[40]發現，在10 g/L的高濃度丁醇環境下，釀酒酵母會發生適應性改變，胞內翻譯過程中的真核起始因子2B活性被抑制，胞內氨基酸存留在“氨基酸池”中。如果將釀酒酵母置于高丁醇脅迫環境下，使其從“氨基酸池”中分泌一定量的有益于丁醇合成和梭菌耐受生存的氨基酸，將有望提高丁醇發酵性能。

基于以上分析，Luo等提出了混菌培養丁醇發酵策略：當丁醇發酵進入到產溶劑期后，添加少量活性釀酒酵母(輔菌，0.2 g DCW/L)。釀酒酵母在惡劣的生存環境(37 ℃、嚴格厭氧) 下，可釋放出苯丙氨酸、酪氨酸、蛋氨酸和賴氨酸 4種有益于丁醇合成的氨基酸，但釋放量(濃度) 有限；總葡萄糖消耗速度提高，但梭菌(主菌) 的葡萄糖消耗速度反而有所下降；總ABE產量提高，ABE產量的提高完全得益于乙醇濃度的大幅上升(2.0–3.0 g/L?8.4 g/L)，混菌培養的優越性沒有得到體現。于是，在添加活性釀酒酵母的同時外添4.0 g/L的丁酸，這時，丁醇發酵性能得到了極大的改善。首先，在丁醇/丁酸同時存在的情況下，釀酒酵母生存環境更加惡劣，被迫釋放出更多的上述4種“有益”氨基酸，氨基酸濃度大幅度提高，可以進入到梭菌胞內，強化梭菌對高丁醇濃度環境的耐受能力；其次，丁酸的添入壓制住了釀酒酵母的乙醇合成和對葡萄糖的消耗；最后，丁酸雖然是丁醇的合成前體之一，但它對梭菌細胞具有毒性。丁酸進入梭菌胞內后，必須通過代謝反應Butyrate?Butyryl-CoA?Butanol將其排出胞外，而Butyryl-CoA?Butanol這步反應又依賴于NADH。過量的NADH需求，必然誘發和刺激梭菌對葡萄糖的利用消耗和NADH的再生(速率)。以上因素造就了如下結果：在7 L厭氧發酵罐中，實施上述“丙丁梭菌/釀酒酵母混菌培養耦聯丁酸外添”的發酵策略(圖7)，丁醇濃度從對照的11.63 g/L大幅提高至15.74 g/L，丁醇/丙酮比也從對照的1.98猛增至2.83[41]。為降低發酵成本，使用酪丁酸梭菌厭氧發酵濃縮液替代化學合成丁酸，丁醇濃度可提高到16.34 g/L的最高水平，丁醇/丙酮比達到3.02[42]。充分利用“主菌”和“輔菌”的自適應舉動，極大地提高了丁醇發酵的性能。

2.2.3 調控還原力再生速率提高丙酮生物合成和丙酮/丁醇比

丁醇是丁醇發酵或ABE發酵的主產物，提高丁醇濃度和丁醇/丙酮比是ABE發酵的首要性能指標。但是，在維持原有丁醇濃度基本不變的基礎上，提高主要副產物丙酮濃度也可以認為是改善ABE發酵性能的另一個重要指標[43]。目前，自然界中還沒有專一性合成丙酮的微生物，從生命周期評價(LCA) 角度上看，強化ABE發酵中丙酮合成具有顯著的環保和工業需求意義[44–46]，還可以實現ABE發酵的產品多樣化。

圖7 丙丁梭菌/釀酒酵母混合培養外添少量丁酸體系下的ABE發酵代謝網絡簡圖

有研究提出了“混菌培養同時外添少量乙酸(4.0 g/L) 的高效合成丙酮的ABE發酵策略”[47]。與“丙丁梭菌/釀酒酵母混菌培養耦聯丁酸外添”的發酵策略基本類似，該策略也可以充分利用“主菌”和“輔菌”的自適應舉動，改善ABE發酵性能，在此不再贅述。與后者唯一不同的是：外添的乙酸可以直接通過反應途徑Acetate?Acetyl-CoA?Acetoacetyl-CoA?Acetone合成丙酮，而無需NADH的參與；乙酸對梭菌細胞也具有毒性，但其毒性小于丁酸，外添乙酸可以適度降低梭菌的葡萄糖消耗速度和NADH再生速率，使較多碳流走向不依存NADH的丙酮合成途徑，造成丁醇和丙酮比例的改變；適中的NADH再生速率還可以緩解細胞能量周轉負荷，延長有效發酵時間。在7 L厭氧發酵罐中實施“混菌培養外添少量乙酸的ABE發酵策略”，丙酮和丁醇濃度同時達到8.27 g/L和13.91 g/L的較高水平，分別比對照提高了41%和20%。在此基礎上，Luo等[48]又提出了“葡萄糖受限條件下葡萄糖/乙酸雙底物耦聯混菌培養”的更加新型的高效丙酮發酵策略。該策略可以將丙酮濃度和丙酮/丁醇比自由控制在6–12 g/L和0.5–1.0之間，最大丙酮濃度和丙酮/丁醇比達到了11.74 g/L和1.02，且丁醇濃度不受影響。上述策略為ABE發酵的產品多樣化和供需靈活化等目標的實現提供了重要信息。

2.2.4 使用廢棄酵母進行丁醇發酵實現玉米原料的資源化和生物質廢料的減量化

利用玉米原料生產丁醇存在原料成本高和與人爭糧的問題，用廉價基質替代或部分替代糧食原料是目前解決該問題的有效方法。目前這方面的研究主要集中在利用秸稈、木屑等農業廢棄物發酵生產乙醇和丁醇等液態燃料方面。2.1章節所論述的高密度畢赤酵母細胞(400 g-DCW/L，干物質約35%) 屬于難以處理的半固態廢棄生物質，嚴重污染環境，但卻擁有農業廢棄物所不具備的高能量密度化特征，其組成除了含有36%的多糖(碳水化合物) 外，還含有46%的蛋白質(氮源) 和12%的脂肪等物質[49]。利用廢棄畢赤酵母部分替代玉米原料也頗具發展前景。

有研究報道顯示，用NaOH處理半固態廢棄酵母，形成廢棄酵母處理懸濁液，并在ABE發酵進入產溶劑期后向玉米粉培養基發酵液中投入懸濁液，發酵產氣量增加約30%，有機酸積累量最大提高了近300%，總糖(以葡萄糖為結構單位)利用效率從低于50%提高到超過90%的水平，這是一個典型的具有顯性自適應特征的發酵過程。這種細胞自適應行為或特征極大地改善了丁醇發酵性能，特別是整個發酵體系的資源化率(玉米淀粉/固態廢棄酵母) 和半固態廢棄酵母的減量化率[4,50]。這種顯性的細胞自適應特征行為顯著改善丁醇發酵性能和促進半固態廢棄酵母的利用主要得益于：1) 投入廢棄酵母處理液后所自然形成的高SO42–和氨基酸濃度環境(在酸堿中和與蛋白質分解中產生)，根據章節2.2.1和2.2.2所述，上述因素均有利于丁醇合成；2) 丙丁梭菌有分泌糖化酶的能力，減少初始玉米粉用量、并在葡萄糖濃度降低到較低水平后投入廢棄酵母處理液后，糖化酶得到誘導、混合培養基中的二糖/三糖可以得到有效利用，有利于總糖利用效率的提升；3) 廢棄酵母處理液的某些特定物質(尚未能確定) 直接刺激了玉米淀粉中多糖和還原糖的利用，這是總糖利用效率大幅提升的最主要原因，還需今后進一步的研究和探索。

2.2.5 木質纖維素預處理抑制物對梭菌生理代謝的干擾及脅迫響應規律

利用來源更廣泛的木質纖維素廢棄原料進行液態燃料的發酵生產，依舊是相關研究的主流。在利用最常用的稀硫酸法預處理木質纖維素得到可被微生物利用的可發酵糖的過程中，也伴隨有弱酸(如甲酸、乙酸、糠醛等)、呋喃類衍生物和酚類物質(如丁香醛、香草醛、香草酸、阿魏酸等) 的產生(圖8)[34,51]。上述物質對微生物細胞的正常生理代謝均有抑制作用，導致細胞發生適應性改變。

低濃度糠醛可促進拜氏梭菌利用葡萄糖產丁醇的效率，這與胞內還原力再生有關[52]。隨著糠醛濃度的提高，菌株抑制逐漸顯現出來，且需要更長的解毒時間用于恢復發酵能力。高濃度的呋喃類物質可以引發丙丁梭菌的DNA損傷和細胞膜結構的破壞，嚴重擾亂胞內氧化還原平衡，最終導致發酵效能低下。有研究表明[53]，預處理過程產生的甲酸會導致丁醇發酵的“酸崩潰”現象的發生，最終造成發酵失敗。Cho等[54]評估了六類酚化合物對拜氏梭菌的代謝干擾特征，結果顯示當酚類物質的含量達到1.0 g/L時，菌體生長降低64%–74%，丁醇發酵完全停止。丁香醛和香草醛對細胞毒性較小，但對于丁醇合成的毒性卻非常高。在另一篇研究報道中[55]，對拜氏梭菌BA101毒性最大的酚類物質是阿魏酸，其次是對香豆酸。近期的研究結果表明[56]，在合成培養基條件下，添加少量的香蘭素或香草酸(0.2 g/L) 可以提高丙丁梭菌的產酸能力，在丁醇濃度基本不變的前提下，實現了有機酸和溶劑的共生產，這主要是由于梭菌為了適應酚類脅迫必須強化菌體和能量物質ATP的合成。這種現象為基于環境變化下的細胞自適應行為的過程優化提供了借鑒。為了揭示發酵抑制物對產溶劑梭菌生理代謝的影響，國內外研究者進行了大量工作。如俄亥俄州立大學的Ezeji教授團隊基于轉錄組學技術首次解析了拜氏梭菌對糠醛的脅迫響應機制[52]。結果表明，在產溶劑期，糠醛的存在使得721個基因出現差異性表達，而這些基因與輔因子水平調控、膜轉運、糖代謝、熱激蛋白表達等因素關聯密切。中國科學院成都生物研究所的趙海研究員團隊發現，硫化鈉可以解除小麥秸稈水解液對丁醇發酵的抑制作用，并利用基于RNA-seq技術揭示了硫化鈉添加后丙丁梭菌CICC8012在轉錄水平上的變化特征[57]。未來的工作需要分析梭菌脅迫環境下的細胞自適應特征：通過宏觀生理生化參數的測定、發酵性能的比較以及系統生物學的分析，進而全局性地揭示發酵抑制物對丁醇合成的影響特征，并明確關鍵的抑制靶點；通過代謝工程和基因編輯技術提高微生物細胞對抑制物的耐受能力，拓寬產溶劑梭菌對多種可發酵糖的利用能力，最終實現利用木質纖維素原料高效生產丁醇的目標。

圖8 木質纖維素預處理過程中產生的各類發酵抑制物

3 總結與展望

圍繞“典型工業發酵過程環境變化下的細胞自適應行為與系統優化”這一主題，結合介紹國內外的研究者以及本研究團隊在該領域的研究成果，以畢赤酵母高效生產異源蛋白和丁醇發酵過程為例，闡述了環境變化條件下的細胞自適應行為及其基于自適應行為的過程優化方法和策略。目前，基于細胞自適應行為的發酵過程優化方法和策略的研究例證并不很多，發酵性能的提升幅度有限，分子機制研究的還不透徹。這些問題有待今后進一步的深入研究加以解決。

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Fermentation optimization based on cell self-adaptation to environmental stress – a review

Jian Ding1, Hongzhen Luo2, and Zhongping Shi1

1,,214122,,2,,223003,,

In industrial fermentation processes, bacteria have to adapt environmental stresses. Sometimes, such a self-adaption does not work and will cause fermentation failures, although such adaptation also can generate unexpected positive effects with improved fermentation performance. Our review introduces cell self-adaption to environmental variations or stress, process optimization based on such self-adaptions, with heterologous proteins production byand butanol fermentation as examples. Our review can sever as reference for fermentation optimization based on cell self-adaption.

cell self-adaption, environmental variations, fermentation optimization, heterologous proteins production, butanol fermentation

10.13345/j.cjb.190207

史仲平 江南大學生物工程學院教授、博士生導師。1991年日本名古屋大學工學部獲工學博士學位。1991–1995年歷任日本九州工業大學情報工學部助教，美國得克薩斯大學校、西弗吉尼亞大學化工系博士后研究員。1995–2002年在美國/加拿大科技公司工作。研究方向：發酵工程、發酵過程控制、代謝工程、生物燃料。獲中國石油和化學工業協會及中國輕工業聯合會科技進步二等獎3項，發表論文145篇、其中SCI論文81篇。

丁健, 羅洪鎮, 史仲平. 典型工業發酵過程環境變化下的細胞自適應行為與系統優化. 生物工程學報, 2019, 35(10): 1986–2002.

Ding J, Luo HZ, Shi ZP. Fermentation optimization based on cell self-adaptation to environmental stress – a review. Chin J Biotech, 2019, 35(10): 1986–2002.

May20, 2019;

July16, 2019

Supported by: National Natural Science Foundation of China (Nos. 21606106, 21808075), Natural Science Foundation of Jiangsu Province (Nos. BK20150127, BK20160162, BK20170459).

Zhongping Shi. Tel/Fax: +86-510-85918292; E-mail: zpshi@jiangnan.edu.cn

國家自然科學基金 (Nos. 21606106, 21808075)，江蘇省自然科學基金 (Nos. BK20150127, BK20160162, BK20170459) 資助。

2019-08-20

http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1998.q.20190819.1736.001.html

(本文責編 陳宏宇)