工業微生物遺傳和環境擾動的調控和適應進化

藺玉萍，王欽宏

工業微生物遺傳和環境擾動的調控和適應進化

藺玉萍，王欽宏

中國科學院天津工業生物技術研究所 中國科學院系統微生物工程重點實驗室，天津 300308

開發工業微生物，使其利用可再生的原料生產生物燃料、大宗化學品、食品添加劑和營養品、藥物以及工業酶等，是發展生物產業的基礎。工業微生物高產和脅迫抗性等魯棒性狀受復雜遺傳調控網絡控制，其改造需要從全基因組尺度進行系統的全局的多位點的擾動，以達到快速積累多樣性基因型突變并產生所期望的表型。文中對工業微生物魯棒性狀的遺傳調控與脅迫響應機制、基因組全局擾動與多位點快速進化以及細胞水平氧還平衡的全局擾動進行了簡要綜述，未來需要繼續借助系統生物學和合成生物學手段，進一步加強對工業環境下工業微生物魯棒性狀調控機理的解析與建模預測以及系統的工程改造。

遺傳調控，環境脅迫，基因組全局擾動，多位點快速進化

在自然環境條件下，地球的生命經歷了上億年的進化，擁有了精細而復雜的遺傳調控系統，以支撐其適者生存和繁殖的性狀。然后在人類上千年的馴化過程中，一些天然動植物和微生物被自覺與不自覺地改造，演化出積累特定產物以滿足人類需要的性狀，彼時人類對性狀與遺傳之間的關系還知之甚少，這個過程主要借助于自然環境的篩選壓力[1]。生物經過長期進化，獲得特有的生物魯棒性，從而具備在特定環境下的生存能力和競爭優勢。生物魯棒性是指生物系統在受到環境變化、隨機事件 (或細胞內噪聲) 和遺傳變異等不確定干擾時保持其表型穩定性的一種特性，是所有生物系統所進化出來的固有特性[2-3]。伴隨百年工業發展史和生產規模的不斷擴大，工業微生物需要暴露在更為復雜更為嚴苛的工業環境條件下完成高產高效的生產任務。工業微生物的魯棒性狀體現在能夠應對復雜多樣的惡劣工業環境，并且具有與正常環境下可比擬的生產性能[4-5]。現代生物產業不僅要求工業微生物具有高產高效的魯棒性狀，還能夠兼容擴展底物譜和產物譜，以滿足人類社會可持續發展的需求[2]。解析工業微生物魯棒性狀和適配性的遺傳調控規律，是構建高性能工業微生物以滿足現代生物制造需求的基礎。現代生命科學的發展正從認知生命邁向創造生命，不僅為解析工業環境條件下的生物遺傳和適應機制提供了強有力工具，而且為人工創制工業微生物的新性狀提供依據。

雖然針對生物復雜性狀的遺傳調控機制已經開展了大量的研究，但是由于細胞代謝、基因調控和信號轉導等網絡及其之間相互關系的復雜性，加之工業環境條件下細胞暴露在各種脅迫壓力下，對于工業環境下細胞的響應和適應機制，我們的理解尚有限。常規的育種手段耗時、耗成本、耗勞動力，想要克服這些問題，需要從系統全局的角度出發，整合最先進的系統生物學、合成生物學和進化工程工具并不斷迭代來克服[7-8]，不斷加深對工業微生物遺傳調控機制的理解，從而開發遺傳穩定的、魯棒的、適配的工業微生物。本文從基礎研究和實際應用兩個角度總結了工業微生物遺傳調控和脅迫響應機制以及系統全局改造的研究進展，進而探討未來工業微生物學在性狀的遺傳解析和改造方面所面臨的挑戰和發展方向。

1 工業微生物魯棒性狀的遺傳調控與脅迫響應機制

伴隨系統生物學和合成生物學的發展，我們所能駕馭的工業微生物已經開始突破原有的局限，不僅僅局限于傳統發酵所使用的天然生產者和常規代謝工程的底盤細胞[9-11]，比如大腸桿菌[12]、釀酒酵母[13]、放線菌[14]、枯草芽孢桿菌[15]等，還包括近年來廣受重視的非常規工業微生物，比如解脂耶氏酵母[16]、假單胞菌[17]、需鈉弧菌[18]等，從而大大擴展了工業微生物技術的底物譜和產品譜。常規底盤細胞具有相對成熟的工業應用和長期的工程改造研究。與之相比，非常規工業微生物的應用潛力近年來才逐漸被鑒定、認識和開發。以研發用于生產生物燃料的工業微生物為例，通過利用和改造微生物的脂肪酸生物合成來生產高級生物燃料已經有大量的研究。這些研究主要是以大腸桿菌和釀酒酵母為宿主菌，通過引入外源或強化內源脂肪酸合成途徑、抑制競爭途徑以及體內群體質量控制系統 (PopQC) 持續篩選高性能菌株等手段，提高工程菌株積累各種高級生物燃料的生產性能[19-22]。然而，目前這些菌株的生產性能尚不能完全滿足產業化的要求。近幾年來，研究人員把目光投向產油微生物的開發，其中最具代表性的是解脂耶氏酵母[23]和不透明紅球菌[24]。解脂耶氏酵母被認為是非致病性的安全菌種。圍繞解脂耶氏酵母的改造，其合成生物學工具已經日益成熟，包括DNA組裝技術、構建表達盒的DNA元件、基因組編輯技術以及基因組尺度代謝模型的構建等，使得該菌也可以作為生產醫藥化合物和食品添加劑的良好底盤細胞[25]。最近，韓國KAIST研究所的研究人員采用系統代謝工程的策略，將不透明紅球菌改造為高級生物燃料的高產菌，從而為化學品和燃料的可持續生產提供了新的可能性[24]。此外，非常規微生物還可以作為新型功能元件的來源。木糖發酵真菌的比較基因組學研究挖掘了一些與木糖代謝有關的基因，能夠顯著提高釀酒酵母工程菌的木糖利用，從而促進生物質轉化生產生物燃料過程中菌株的研發[26]。高度多樣化的子囊菌酵母能夠將多種底物轉化成乙醇、脂類、維生素等具有工業應用潛力的產物，并且能夠在極端的溫度、高鹽和pH條件下生長。對這些酵母的比較基因組學研究揭示了與有用的代謝性狀所關聯的基因和遺傳基礎，不僅有助于相關生物合成途徑的工程改造，而且為篩選有應用潛力的工業細胞底盤提供依據[27]。因此，非常規微生物相關系統生物學和合成生物學的研發，對于拓展工業微生物的應用以及揭示其魯棒性狀的遺傳基礎都將是不可或缺的。

總的來講，對于天然生產者而言，比如用于食品和飲料發酵的微生物，通常在特定的人為環境下不斷馴化，獲得了與之相適應的魯棒性能，包括高效利用特定底物、應對特定工業壓力以及積累理想的化合物。而且不同工業環境來源的同一物種的不同譜系，呈現基因型和表型多樣性。基于大規模的基因組測序，逐漸揭示這些多樣性產生的遺傳調控方式包括：種間雜交、基因水平轉移、拷貝數變異、基因組衰退、染色體重排等[1]。以被人類長期馴養的、用來生產啤酒和葡萄酒的酵母為例，用于生產拉格 (Lager) 啤酒的工業菌株巴氏酵母，是釀酒酵母和貝酵母的雜交種，融合了前者強勁的發酵能力和后者的耐寒性狀，從而能夠進行低溫發酵[28]。在許多用于生產葡萄酒的釀酒酵母菌株的基因組中，有一段約158 kb的區域是通過基因水平轉移來自于另外一種酵母菌小捕有胞圓酵母，該區域含有編碼寡聚肽轉運蛋白的基因，能使菌株利用寡聚肽為氮源，從而可以在氮源受限的葡萄酒發酵環境中依然具有發酵活力[29]。此外，葡萄酒酵母耐受亞硫酸鹽性能與馴養過程中染色體間發生重排有關，和基因上游5′區域非常短的序列之間發生微同源末端重組介導的不等交換，導致8號和16號染色體之間發生易位，從而使的表達水平提高。基因編碼亞硫酸鹽泵，進而賦予菌株更高的亞硫酸鹽抗性[30]。葡萄酒酵母的銅脅迫抗性和啤酒酵母高效發酵麥芽糖和麥芽三糖的性能則分別是由于其基因組中存在高拷貝的基因 (編碼銅結合蛋白)[31]和基因 (編碼麥芽糖轉運蛋白和水解酶)[32]。用于乳制品生產的乳酸乳球菌，其在牛奶環境的馴化過程同樣也伴隨著基因組衰退以及通過基因水平轉移獲得特異利用蛋白質和乳糖的基因[33]。對于用于工程改造的底盤細胞而言，所引入的外源代謝途徑往往需要遵循宿主本身的遺傳調控規律，包括遺傳操作系統、啟動子和終止子、編碼區的密碼子偏好性、轉錄翻譯及其調控網絡，或者通過引入合成的調控系統，最終與細胞內源的代謝相平衡[5,34-36]。

與自然界環境相比，工業微生物所面臨的脅迫壓力更復雜更嚴苛，主要總結為以下幾個方面 (圖1)[37-38]：1) 外源代謝途徑的引入，可能會造成合成外源蛋白的翻譯負擔、非折疊蛋白反應和內質網應激、蛋白質穩態失衡、蛋白分泌系統壓力、代謝通量負擔、破壞氧化還原平衡等；2) 與底物相關的脅迫，包括高濃度底物造成的高滲壓力、抑制物等[39]；3) 中間代謝產物和/或終產物積累帶來的壓力和毒性；4) 環境壓力：異常溫度、異常pH、有機無機酸、抑制化合物、營養缺乏、靜壓、氧化脅迫、其他生物競爭等。一方面，作為系統生物學的一項技術，組學分析被廣泛應用于從系統和網絡的層面解析細胞應對不同水平脅迫壓力的響應機制；另一方面，反向代謝工程獲得的突變菌株，經過組學分析，揭示突變表型背后的遺傳基礎和調控網絡，鑒定和挖掘與提高脅迫抗性和生產性能相關的候選目標。相關的脅迫響應機制包括 (圖1)[40-41]：1) 細胞壁和細胞膜的屏障作用：細胞壁重構、細胞膜流動性降低、海藻糖聚集等；2) 轉運系統清理有毒物質；3) 信號轉導系統的激活和級聯調控作用，例如MAPK、TOR等信號轉導途徑，進而調控轉錄和翻譯；4) DNA遺傳水平發生損傷修復突變；5) 特定的轉錄因子被激活或失活，進而影響更多功能基因的表達；6) 非折疊蛋白應激，比如熱激蛋白分子伴侶促進蛋白折疊；7) 線粒體脅迫響應；8) 代謝水平的調控，比如平衡氧化還原穩態。

圖1 工業微生物魯棒性與脅迫響應(參考文獻[5]修改)

另外，這些脅迫在實際工業生產過程中，可能是組合或者順序發生，因此細胞應對多重脅迫響應的機制可能涉及上述細胞不同層面的重塑和調控[42]。為了從多個層面解析工業釀酒酵母菌株進行高溫濃醪乙醇發酵時的脅迫響應機制，本實驗室陸續開展了一些研究。通過對高溫發酵條件下的酵母細胞進行蛋白質組分析，發現工業酵母的長時高溫脅迫響應不同于實驗室菌株的熱激響應，在高溫條件下，工業酵母的磷酸戊糖途徑蛋白表達量降低，而糖酵解途徑蛋白表達量提高，這意味著工業酵母進行高溫發酵時發生了代謝調控，同時鑒定了一些特異響應長時高溫脅迫的蛋白和轉錄因子[43-44]。通過對耐熱特異響應轉錄因子的敲除菌株進行轉錄組測序，解析了與耐熱相關的基因轉錄水平上的層級調控網絡 (未發表)。另外，基于孢子池全基因組測序和數量性狀基因座定位策略高效挖掘了與工業酵母高溫發酵性能相關的遺傳變異，揭示了海藻糖積累和膜流動性降低有利于工業酵母的高溫發酵性能的分子基礎[45]。這些結果為改造和選育適用于高溫濃醪發酵的工業酵母菌種提供了理論依據。

2 工業微生物基因組全局擾動與多位點快速進化

目前，絕大多數重要的工業微生物是通過長期的人工馴化和誘變篩選獲得。基于物理和化學誘變的育種技術，盡管在一定程度上有效，但存在改造周期長、非定向、遺傳機制不清晰和不能突破代謝網絡剛性的特點，在創造具有卓越生產性能的工業微生物方面，正面臨著許多無法逾越的障礙。伴隨分子生物學的發展，針對單基因的基因工程或針對單一代謝途徑的代謝工程的學術研究已經很多，但對生產性能的提升效果有限，較難在工業生產上推廣使用。由于工業微生物的高產性狀通常對應著復雜的基因型，傳統育種手段對涉及到十幾個、甚至是數十個基因的表達優化無能為力。隨著基因組學、系統生物學、合成生物學的發展和高通量分析技術的進步，以全局轉錄機器工程 (Global transcription machinery engineering，gTME)、多位點自動基因組工程 (Multiplex automated genome engineering, MAGE)、可跟蹤多輪重組工程 (Trackable multiplex recombineering, TRMR) 和核酸酶介導的基因組編輯為代表的基因組工程技術日益成熟，可以在單一宿主細胞中實現多個不同性狀的同時改造，大幅度縮短了改造時間。基因組尺度的理性設計、途徑重建、網絡重構、全局擾動、多位點快速進化和基因組刪減技術可以對工業微生物基因組進行多位點、高通量、高效率修飾。從而賦予工業微生物粗原料利用、新產品合成等新型生產功能，優化工業微生物的發酵生產能力，極大加快工業微生物的改造進程，顯著提高改進效果。這些技術已經在氨基酸、大宗化學品、天然化合物藥物、蛋白質/工業酶等生產領域取得了一系列標志性成果，為系統改造工業微生物的生產性狀提供了全新手段。

2.1 轉錄因子全局擾動

針對細胞非特定生化途徑所關聯的復雜性狀，比如高產和脅迫抗性，其改造提升往往需要對細胞內在的代謝進行徹底的重編程，這就需要同時改變很多基因的表達水平，難以通過連續的多基因修飾來實現。全局轉錄機器工程 (gTME) 是通過改造和進化全局轉錄因子、轉錄機器等關鍵蛋白，構建高度多樣、復雜的轉錄調控突變文庫，在轉錄水平上產生新型的豐富多樣性，實現對基因表達網絡和細胞代謝重編程，并以定向進化方式加以迭代，從而使細胞獲得所期望的表型[46]。gTME是一種從轉錄全局角度工程改造復雜性狀的普適性方法。自2006年開發以來[47]，該方法已成功地應用于原核生物和真核生物系統，比如釀酒酵母、馬克斯克魯維酵母、大腸桿菌、植物乳桿菌和運動發酵單胞菌等，從而改善細胞的環境脅迫耐受性、代謝產物產量和底物利用效率 (表1)。

2.2 基因組進化動力擾動

在自然界沒有人工參與的情況下，生物體受自然誘變劑的作用或在DNA復制、轉錄、修復時以一定頻率 (約10–9–10–6) 自然發生突變，產生遺傳和表型多樣性，推進生物進化。但這個過程非常緩慢，通過人工模擬自然進化過程，改造和突變基因組的進化動力，可以建立加快進化速率的基因組全局擾動新技術[62]。該技術會讓上百種或上千種變異同時進行，從而制造出十億種不同的DNA序列。利用細胞自身的進化機制，經過無數次的變異，使得細胞在短期內被賦予所期望的特性，使其生產特定產物具有更為低廉的成本和更短的研發周期。

多位點自動基因組工程 (MAGE) 是近年來發展的針對基因組中多條相關代謝途徑進行快速改造的重要方法[63-64]。MAGE基于λ噬菌體Red重組酶的同源重組系統，針對與某條特定的代謝途徑或局部的代謝網絡進行理性設計，人工合成的多個兼并寡核苷酸靶向基因組上的特定序列，通過同源重組的方式靶向序列，將許多已知具有最為優良功能的基因整合在一起，從而獲得具有最優工業性能的工業微生物。例如，現已知至少有20種基因影響番茄紅素的生產，一次改寫一個或一部分基因的常規基因工程技術顯然不能滿足需求。為了解決這一問題，哈佛大學的研究人員利用MAGE改造大腸桿菌生產番茄紅素[63]。此外，為了進一步提高MAGE進行基因組進化的效率，通過引入co-marks建立改進后的共選擇Co-selection MAGE，可以修飾大腸桿菌基因組80個位點。通過破壞復制體中引發酶和解旋酶之間的相互作用，提高ssDNA在復制叉處的豐度，進一步提高了每輪操作的修飾效率[65-66]。MAGE技術應用于釀酒酵母中，建立的eMAGE技術獨立于Rad51介導的同源重組，避免了DNA雙鏈斷裂造成的意外突變，一次可以同時轉化具有60個靶向突變的12個寡核苷酸，迭代轉化寡核苷酸混合庫，能夠快速產生大于105個的基因組組合突變。該技術在異源胡蘿卜素生物合成途徑基因的啟動子、基因和終止子引入精確突變，產生遺傳多樣性，從而調控類胡蘿卜素的產物水平[67]。為了同時鑒定MAGE基因組進化過程中與性狀相關聯的遺傳基礎，進而發展了可跟蹤多輪重組工程 (TRMR) 技術，通過合成帶有條形碼的突變序列，轉化宿主細胞，然后利用分子條碼和微陣列技術追蹤相關突變，量化突變率，并對遺傳性狀進行定位。該技術能在一天之內修飾大腸桿菌95%的基因，并在一周內完成影響細胞不同培養基 (豐富、基礎和纖維素水解液) 和抑制物 (β-糖苷、D-巖藻糖、纈氨酸和丙酮醛) 條件下生長的近4 000個基因的遺傳定位[68]。

表1 轉錄因子全局擾動

基因組復制工程輔助的連續進化 (Genome replication engineering assisted continuous evolution, GREACE技術)[69]是將保真性下降的DNA聚合酶元件引入到大腸桿菌中，誘發細胞進入高突變態，從而在復制過程中不斷產生基因組突變，在環境壓力下，積累有益突變的子代細胞被篩選出來。不斷提高環境壓力就可以使大腸桿菌不斷地適應新的壓力，達到連續進化的目的。利用該技術可以提高大腸桿菌的耐熱性和甲醇利用能力[69-70]。

基于合成染色體和Cre-loxP位點特異性重組機制，最近開發的基因組重排系統 (Synthetic chromosome rearrangement and modification by loxP-mediated evolution，SCRaMbLE) 可以產生全基因組尺度的、大片段的DNA缺失、重復、易位、倒位和復雜的基因組重排事件，實現釀酒酵母基因組的快速進化[71-72]。利用該技術可以提高底盤細胞與外源路徑間的適配性，實現代謝通路的優化，提高了釀酒酵母細胞工廠類胡蘿卜素、紫羅蘭素、紫色桿菌素、青霉素的生產能力[73-75]以及耐受環境脅迫的能力[76-77]。另外，通過對基因組序列結構變化的解析可以鑒定與表型相關的基因型。

2.3 基因組刪減優化

模式生物基因組測序和分析揭示了大量的生存非必需的序列，以及大量未知功能的基因。為了理解基因組的功能，構建最小基因組的細胞工廠，在大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、釀酒酵母、裂殖酵母等模式微生物和有工業應用價值的微生物 (如谷氨酸棒桿菌) 中已經開展了基因組刪減優化的工作[78-81]。所采用的DNA敲除技術從早期的轉座子隨機整合/缺失、轉座子協同Cre/loxP切除，到最近發展的Red介導/雙鏈斷裂促進的重組、無疤痕缺失等。如Cre/loxP系統可以用于染色體間的基因重排，為研究多種最小基因組的可能性提供了一個很好的技術手段[82]。新的技術能夠做到高效、精確和連續的DNA片段的敲除，目前最多的已敲除了約30%的基因組序列。隨著基因組計算機輔助設計軟件的開發，大片段DNA拼接合成技術的發展，可以在計算機上進行基因組的刪減優化，包括刪除轉座子、去除冗余DNA片段以及重新安置易造成基因組不穩定的tRNA基因等方式，之后采取大片段DNA從頭合成并轉入酵母細胞逐步置換的方法，創建數字化基因組刪減與逐步置換合成相結合的基因組改造創新技術體系[83]。Ikeda研究小組將一株原來不產鏈霉素、頭霉素和普拉地內酯的鏈霉菌，分別改造為高產這3種抗生素的工業菌株，并使其基因組縮小至原野生菌株的83.12%–81.46%，不僅極大地提高了菌株的生長速度，而且困擾這些抗生素多年的無效、有毒副產物均未檢測到[84]。

2.4 基因組多位點編輯進化

近年來，基于核酸酶的基因組編輯技術，特別是CRISPR技術，被廣泛應用于基礎研究、生物技術、基因治療等領域[85]。基因組多位點編輯進化，包括在全基因組尺度上搜索有利于目標產物合成的基因表達或基因敲除，并通過循環篩選得到優化的基因表達和敲除組合；快速實現在基因組上多個位點同時進行突變、缺失或插入短序列等修飾。根據是否引入DNA損傷以及細胞內源組分的參與情況，核酸酶介導的基因組編輯技術在生物技術領域中的應用歸納為以下4個方面 (圖2)。

1) 同源重組介導的途徑構建與改造 (圖2A)：編輯系統的核酸酶切割靶向DNA位點，產生DNA雙鏈斷裂 (DSB)，在有與靶向位點同源臂的外源DNA片段供體存在的情況下，DSB經由細胞內源同源重組系統 (HDR) 進行修復，實現同源片段的整合、敲除、突變、失活或者替換，進而實現生物合成途徑的構建與改造[86]。

2) 基于失活核酸酶的基因表達調控 (圖2B)：利用失活的核酸酶，融合細胞內源激活子或抑制子，對基因表達進行調控，從而實現外源生物合成途徑以及與之適配的底盤細胞的優化。最近，哈佛大學Church實驗室通過CRISPRi確定了需鈉弧菌快速生長所需的最小基因集[87]。

圖2 核酸酶介導的基因組編輯技術在生物技術領域的應用(參考文獻[85]修改)

3) 非同源末端重組介導的基因表達調控 (圖2C)：在沒有外源同源重組DNA片段存在的情況下，核酸酶切割產生的DSB主要經由細胞內源非同源末端重組 (NHEJ) 系統進行修復，引入插入或缺失隨機突變，當靶向基因啟動子區時，能夠引起編輯基因的差異表達，形成多性狀突變庫，從而為工業微生物突變育種提供了新策略。本實驗室基于TALENs特異性識別修飾真核啟動子區保守序列TATA框與GC框之間的關鍵區域，引起不同基因的差異表達，形成多性狀菌體庫，在釀酒酵母中建立了TALENs介導的多位點基因組編輯技術，并輔助酵母脅迫抗性進化育種，提高了工業菌株耐受高溫和高滲的性能[88-89]。

4) 堿基編輯 (圖2D)：將CRISPR/Cas9 (或Cpf1) 系統中的核酸酶失活或突變為切口酶，并融合胞嘧啶或腺苷酸脫氨酶，利用CRISPR系統的定位功能與脫氨酶的堿基編輯功能，可在染色體靶位點實現C到T或A到G的編輯，實現堿基突變，當堿基位于基因編碼區時則有可能造成氨基酸突變，當靶向基因編碼區中編碼精氨酸的CGA、編碼谷氨酰胺的CAG和CAA中的C突變為T時，分別會產生TGA、TAG和TAA終止密碼子，從而造成基因失活。最近，在重要工業平臺微生物谷氨酸棒桿菌中開發的多元自動化基因組編輯方法MACBETH (Multiplex automated corynebacterium glutamicum base editing method)[90]，結合CRISPR/Cas9系統的定位功能與胞嘧啶脫氨酶 (AID) 的堿基編輯功能，可在染色體靶位點實現C到T的編輯，效率高達90%。MACBETH可同時在多個基因中生成提前的終止密碼子，以失活靶基因。同時借助自動化平臺，可實現從質粒構建、基因組編輯、獲取正確突變株和表型驗證的全流程自動化操作，編輯能力可達到每月數千突變株，為將谷氨酸棒桿菌改造為通用的微生物底盤提供強大的技術支持。

2.5 基因組適應性進化

對于遺傳基礎復雜難以確定的性狀改造，基因組適應性進化也是一種行之有效的方法，同時通過蛋白、轉錄和基因組學技術解析在適應性進化過程中發生的響應與調控機制，再通過反向代謝工程等手段，進一步穩定或增強這種特性以達到獲得優良性狀的目的。借助于基因組適應性進化，一些大腸桿菌、釀酒酵母、谷氨酸棒桿菌、腸膜明串珠菌等細胞工廠的工業生產效率和脅迫耐受性都得到了很大的提升[91-92]。系列傳代和連續培養是適應性進化的兩種經典設計，針對特定的工業性狀育種目標，施加單一的或多重的或變化的環境篩選壓力，使得突變在全基因組尺度上廣泛積累，然后通過特定的生理指標檢測篩選目標突變體[93]。值得一提的是，相關自動化設備以及高通量的突變體分離和篩選方法已被大量開發和應用，從而節省適應性進化實驗的人力成本并提高篩選效率[91, 93]。本實驗室設計了一款自動化程序控制、培養體積小且可并行運行多種篩選培養條件的微生物適應性進化培養設備[94]。該設備包括中央控制系統與若干執行單元 (培養條件控制單元、培養瓶單元、原料儲罐及培養物收集罐單元)，具有程序編輯與控制模塊以及若干個蠕動泵。培養條件控制單元由一個培養溫度控制的循環水槽和一組磁力攪拌器組成；培養瓶單元包括帶刻度的瓶體、瓶蓋及與之相連的管線及監測部件，培養瓶單元放置于循環水槽中，磁力攪拌器轉子置于所述培養瓶，培養瓶通過其管路與蠕動泵連接；原料儲罐與培養物收集罐單元具有若干個培養基原料儲罐及培養物排出液收集罐，培養瓶通過其管路與培養基原料儲罐及培養物排出液收集罐相連接。該設備能夠用來進行細菌、酵母、真菌等微生物及可懸浮培養細胞的系列傳代培養工作，適用于生物、醫藥、農業等科研或工廠實驗室中，并用來替代目前常用的傳統的適應性進化培養實驗工作，節省人力成本并實現實驗過程的標準化高效運行。利用該設備，我們通過耐高溫馴化和/或模擬工業發酵條件對工業釀酒酵母菌株進行適應性進化，獲得一系列適應性進化菌株，同時利用基因組重測序揭示了進化菌株中積累的非同義突變和大片段缺失[95]。相較于普通產乙醇工業酵母發酵生產乙醇，進化菌株的乙醇產量均明顯提高，能夠耐受高溫、高濃醪和抑制物等多重脅迫，解決高溫濃醪發酵淀粉生產酒精中酵母細胞多重脅迫耐性不足的缺陷。在高溫下發酵生產乙醇，可大幅度降低工業用水的用量，從而減少能量消耗，降低乙醇生產成本，而且進化菌株能夠利用工業用水進行大規模發酵生產乙醇，進一步降低了乙醇的生產成本，在大規模工業生產中具有很大的潛力。

3 工業微生物細胞水平氧還平衡的全局擾動

輔因子對NADH/NAD+和NADPH/NADP+在所有生物有機體中起著重要的電子供體或受體的作用，驅動大量的分解和合成代謝反應，參與細胞的一系列生理功能，包括調節能量代謝、細胞內氧化還原狀態、控制碳流量、提高線粒體的功能和活性、調節細胞生命周期和細胞毒力等。工業微生物工程改造所改變或引入的代謝途徑，特別是涉及消耗、生成或轉化輔因子的代謝途徑，往往會引起氧化還原狀態的波動，從而嚴重阻礙細胞代謝，導致細胞生長和生物合成能力的下降。因此，除了途徑改造外，氧化還原平衡也是工程改造細胞利用特定底物生產目標產物的重要考慮因素。通過輔因子工程，維持胞內氧化還原平衡，增加目標產物生物合成途徑的代謝通量，提高生產效率，是較早發展起來的系統改造手段之一，廣泛應用于提高酶、藥物、生物燃料、大宗化學品等細胞工廠的生產性能。一些綜述文獻總結了輔因子工程的相關策略和應用[96-101]，4種基本策略包括 (圖3)：

1) 調節內源輔因子系統，改善自平衡，比如輔因子競爭途徑的消除或阻斷，輔因子生成途徑的加強，以及微調氧化還原相關轉錄調控因子等。例如，NADPH是一些高附加值化學品生物合成途徑所需的重要輔因子。細胞能否有足夠的NADPH是構建這類細胞工廠的限制因素之一。大腸桿菌轉錄調控因子HdfR，其功能缺失能夠提高細胞內NADPH的含量，從而提高3-羥基丙酸的產量[102]。

2) 在宿主中增補異源的輔因子再生系統，比如增加NAD與NADP之間轉化的酶或途徑，增強NAD合成等，反之亦然。Ng 等基于運動發酵單胞菌的Entner-Doudoroff (ED) 途徑，對其進行理性設計，并引入到大腸桿菌中，將NADPH產生效率提高了25倍[103]。

3) 替換具有特定輔因子特異性的酶或改造酶的輔因子特異性。最近，Arnold實驗室開發了一個將酶對NADP依賴性逆轉為NAD依賴性的在線工具 (Cofactor specificity reversal-structural analysis and library design，CSR-SALAD)，基于蛋白結構分析和半理性設計，成功將4種結構不同的NADP依賴酶 (乙醛酸還原酶、肉桂醇脫氫酶、木糖還原酶和含鐵醇脫氫酶) 的輔因子特異性逆轉為NAD依賴[104]。

4) 創建合成的輔因子系統，比如利用人工的輔因子類似物。基于氧化還原反應的生物轉化對于工業生物制造具有潛在的吸引力，但需要依賴于不穩定且昂貴的輔因子。Knaus等鑒定了一些人工合成的輔因子類似物，其催化活性甚至比NAD(P)H還好[105]。另外，這些策略的組合也具有可行性和有效性。

圖3 細胞內氧化還原平衡的改造示意圖(參考文獻[97]修改)

4 展望

開發和改進工業微生物的魯棒性和適配性，比如高產和脅迫抗性，是發展生物產業的基礎。然而這些性狀是由多層次的復雜調控網絡控制，僅僅基于對模式生物和非工業環境所開展的研究尚不能全面解析相關的遺傳調控機理。未來依然需要借助于系統生物學的分析手段，加大對工業微生物的基因組學和功能基因組學分析，揭示重要工業微生物遺傳操作的限制修飾系統，分析工業環境下高產性狀的分子機制，挖掘高產性狀相關的特殊遺傳標記與基因，構建基因組規模的代謝網絡以及調控網絡模型，最終為實現可預測、可控制的工業微生物提出更為全面可靠的理性設計改造方案。同時，由于傳統單一基因、單一途徑、單一策略的代謝工程改造對于復雜性狀提升的空間有限，需要借助合成生物學的工程改造手段，對工業微生物開展全基因組水平的、系統的、全局的工程改造擾動，同時結合自動化和高通量分析手段，多次迭代，從而縮短育種周期，獲得工業生產所需的優良工業微生物。另外，人工創制生物在工業應用時涉及到轉基因的問題，如何加強人工創制生物的安全性管控和策略以及提高民眾對轉基因生物的認知也至關重要。

[1] Steensels J, Gallone B, Voordeckers K, et al. Domestication of industrial microbes. Curr Biol, 2019, 29(10): R381–R393.

[2] Kitano H. Biological robustness. Nat Rev Genet, 2004, 5(11): 826–837.

[3] Stelling J, Sauer U, Szallasi Z, et al. Robustness of cellular functions. Cell, 2004, 118(6): 675–685.

[4] Zhu LJ, Zhu Y, Zhang YP, et al. Engineering the robustness of industrial microbes through synthetic biology. Trends Microbiol, 2012, 20(2): 94–101.

[5] Gong ZW, Nielsen J, Zhou YJ. Engineering robustness of microbial cell factories. Biotechnol J, 2017, 12(10): 1700014.

[6] Adrio JL, Demain AL. Recombinant organisms for production of industrial products. Bioeng Bugs, 2010, 1(2): 116–131.

[7] Lee SY, Kim HU. Systems strategies for developing industrial microbial strains. Nat Biotechnol, 2015, 33(10): 1061–1072.

[8] Gustavsson M, Lee SY. Prospects of microbial cell factories developed through systems metabolic engineering. Microb Biotechnol, 2016, 9(5): 610–617.

[9] Friedman DC, Ellington AD. Industrialization of biology. ACS Synth Biol, 2015, 4(10): 1053–1055.

[10] Calero P, Nikel PI. Chasing bacterial chassis for metabolic engineering: a perspective review from classical to non-traditional microorganisms. Microb Biotechnol, 2019, 12(1): 98–124.

[11] Steensels J, Snoek T, Meersman E, et al. Improving industrial yeast strains: exploiting natural and artificial diversity. FEMS Microbiol Rev, 2014, 38(5): 947–995.

[12] Casti?eiras TS, Williams SG, Hitchcock AG, et al.strain engineering for the production of advanced biopharmaceutical products. FEMS Microbiol Lett, 2018, 365(15): fny162, doi: 10.1093/femsle/fny162.

[13] Nielsen J, Larsson C, van Maris A, et al. Metabolic engineering of yeast for production of fuels and chemicals. Curr Opin Biotechnol, 2013, 24(3): 398–404.

[14] Palazzotto E, Tong YJ, Lee SY, et al. Synthetic biology and metabolic engineering of actinomycetes for natural product discovery. Biotechnol Adv, 2019, 37(6): 107366.

[15] Liu YF, Liu L, Li JH, et al. Synthetic biology toolbox and chassis development in. Trends Biotechnol, 2019, 37(5): 548–562.

[16] Zhu Q, Jackson EN. Metabolic engineering offor industrial applications. Curr Opin Biotechnol, 2015, 36: 65–72.

[17] Nikel PI, Martínez-García E, de Lorenzo V. Biotechnological domestication of pseudomonads using synthetic biology. Nat Rev Microbiol, 2014, 12(5): 368–379.

[18] Weinstock MT, Hesek ED, Wilson CM, et al.as a fast-growing host for molecular biology. Nat Methods, 2016, 13(10): 849–851.

[19] Peralta-Yahya PP, Keasling JD. Advanced biofuel production in microbes. Biotechnol J, 2010, 5(2): 147–62.

[20] Meadows CW, Kang A, Lee TS. Metabolic engineering for advanced biofuels production and recent advances toward commercialization. Biotechnol J, 2018, 13(1), doi: 10.1002/biot.201600433.

[21] Zhou YJ, Buijs NA, Zhu ZW, et al. Production of fatty acid-derived oleochemicals and biofuels by synthetic yeast cell factories. Nat Commun, 2016, 7: 11709, doi: 10.1038/ncomms11709.

[22] Xiao Y, Bowen CH, Liu D, et al. Exploiting nongenetic cell-to-cell variation for enhanced biosynthesis. Nat Chem Biol, 2016, 12(5): 339–344.

[23] Ekas H, Deaner M, Alper HS. Recent advancements in fungal-derived fuel and chemical production and commercialization. Curr Opin Biotechnol, 2019, 57: 1–9.

[24] Kim HM, Chae TU, Choi SY, et al. Engineering of an oleaginous bacterium for the production of fatty acids and fuels. Nat Chem Biol, 2019, 15(7): 721–729.

[25] Larroude M, Rossignol T, Nicaud JM, et al. Synthetic biology tools for engineering. Biotechnol Adv, 2018, 36(8): 2150–2164.

[26] Wohlbach DJ, Kuo A, Sato TK, et al. Comparative genomics of xylose-fermenting fungi for enhanced biofuel production. Proc Natl Acad Sci USA, 2011, 108(32): 13212–13217.

[27] Riley R, Haridas S, Wolfe KH, et al. Comparative genomics of biotechnologically important yeasts. Proc Natl Acad Sci USA, 2016, 113(35): 9882–9887.

[28] Dunn B, Sherlock G. Reconstruction of the genome origins and evolution of the hybrid lager yeast. Genome Res, 2008, 18(10): 1610–1623.

[29] Marsit S, Mena A, Bigey F, et al. Evolutionary advantage conferred by an eukaryote-to-eukaryote gene transfer event in wine yeasts. Mol Biol Evol, 2015, 32(7): 1695–1707.

[30] Pérez-Ortín JE, Querol A, Puig S, et al. Molecular characterization of a chromosomal rearrangement involved in the adaptive evolution of yeast strains. Genome Res, 2002, 12(10): 1533–1539.

[31] Strope PK, Skelly DA, Kozmin SG, et al. The 100-genomes strains, anresource that illuminates its natural phenotypic and genotypic variation and emergence as an opportunistic pathogen. Genome Res, 2015, 25(5): 762–774.

[32] Gallone B, Steensels J, Prahl T, et al. Domestication and divergence ofbeer yeasts. Cell, 2016, 166(6): 1397–1410.e16.

[33] Cavanagh D, Fitzgerald GF, McAuliffe O. From field to fermentation: the origins ofand its domestication to the dairy environment. Food Microbiol, 2015, 47: 45–61.

[34] Keasling JD. Manufacturing molecules through metabolic engineering. Science, 2010, 330(6009): 1355–1358.

[35] Woolston BM, Edgar S, Stephanopoulos G. Metabolic engineering: past and future. Annu Rev Chem Biomol Eng, 2013, 4: 259–288.

[36] Nielsen J, Keasling JD. Engineering cellular metabolism. Cell, 2016, 164(6): 1185–1197.

[37] Guan NZ, Li JH, Shin HD, et al. Microbial response to environmental stresses: from fundamental mechanisms to practical applications. Appl Microbiol Biotechnol, 2017, 101(10): 3991–4008.

[38] Takagi H, Kitagaki H. Stress Biology of Yeasts and Fungi: Applications for Industrial Brewing and Fermentation. New York: Springer, 2015: 1–218.

[39] Wendisch VF, Brito LF, Gil Lopez M, et al. The flexible feedstock concept in industrial biotechnology: Metabolic engineering of,,,and yeast strains for access to alternative carbon sources. J Biotechnol, 2016, 234: 139–157.

[40] Fu Y, Chen L, Zhang W. Regulatory mechanisms related to biofuel tolerance in producing microbes. J Appl Microbiol, 2016, 121(2): 320–332.

[41] Teixeira MC, Mira NP, Sá-Correia I. A genome-wide perspective on the response and tolerance to food-relevant stresses in. Curr Opin Biotechnol, 2011, 22(2): 150–156.

[42] Kitichantaropas Y, Boonchird C, Sugiyama M, et al. Cellular mechanisms contributing to multiple stress tolerance instrains with potential use in high-temperature ethanol fermentation. AMB Express, 2016, 6: 107, doi: 10.1186/s13568-016-0285-x.

[43] Shui WQ, Xiong Y, Xiao WD, et al. Understanding the mechanism of thermotolerance distinct from heat shock response through proteomic analysis of industrial strains of. Mol Cell Proteom, 2015, 14(7): 1885–1897.

[44] Xiao WD, Duan XX, Lin YP, et al. Distinct proteome remodeling of industrialin response to prolonged thermal stress or transient heat shock. J Proteome Res, 2018, 17(5): 1812–1825.

[45] Wang Z, Qi Q, Lin YP, et al. QTL analysis reveals genomic variants linked to high-temperature fermentation performance in the industrial yeast. Biotechnol Biofuels, 2019, 12: 59, doi: 10.1186/s13068-019-1398-7.

[46] Lanza AM, Alper HS. Using transcription machinery engineering to elicit complex cellular phenotypes//Weber W, Fussenegger M, Eds. Synthetic Gene Networks. New York: Humana Press, 2012, 813: 229–248.

[47] Alper H, Moxley J, Nevoigt E, et al. Engineering yeast transcription machinery for improved ethanol tolerance and production. Science, 2006, 314(5805): 1565–1568.

[48] El-Rotail AAMM, Zhang L, Li YR, et al. A novel constructedmutagenesis library ofby using gTME technique for enhanced ethanol production. AMB Express, 2017, 7: 111, doi: 10.1186/s13568-017-0400-7.

[49] Liu HM, Yan M, Lai CG, et al. gTME for improved xylose fermentation of. Appl Biochem Biotechnol, 2010, 160(2): 574–582.

[50] Liu HM, Liu K, Yan M, et al. gTME for improved adaptation ofto corn cob acid hydrolysate. Appl Biochem Biotechnol, 2011, 164(7): 1150–1159.

[51] Qiu ZL, Jiang RR. Improvingethanol production and tolerance via RNA polymerase II subunit Rpb7. Biotechnol Biofuels, 2017, 10: 125, doi: 10.1186/s13068-017-0806-0.

[52] Li PS, Fu XF, Li SZ, et al. Engineering TATA-binding protein Spt15 to improve ethanol tolerance and production in. Biotechnol Biofuels, 2018, 11: 207, doi: 10.1186/s13068-018-1206-9.

[53] Alper H, Stephanopoulos G. Global transcription machinery engineering: a new approach for improving cellular phenotype. Metab Eng, 2007, 9(3): 258–267.

[54] Huang L, Pu Y, Yang XL, et al. Engineering of global regulator cAMP receptor protein (CRP) infor improved lycopene production. J Biotechnol, 2015, 199: 55–61.

[55] Chong HQ, Geng HF, Zhang HF, et al. Enhancingisobutanol tolerance through engineering its global transcription factor cAMP receptor protein (CRP). Biotechnol Bioeng, 2014, 111(4): 700–708.

[56] Wei LN, Zhu LW, Tang YJ. Succinate production positively correlates with the affinity of the global transcription factor Cra for its effector FBP in. Biotechnol Biofuels, 2016, 9: 264, doi: 10.1186/s13068-016-0679-7.

[57] Zhu LW, Xia ST, Wei LN, et al. Enhancing succinic acid biosynthesis inby engineering its global transcription factor, catabolite repressor/activator (Cra). Sci Rep, 2016, 6: 36526, doi: 10.1038/srep36526.

[58] Zhang F, Qian XH, Si HM, et al. Significantly improved solvent tolerance ofby global transcription machinery engineering. Microb Cell Fact, 2015, 14: 175, doi: 10.1186/s12934-015-0368-4.

[59] Gao XX, Yang XF, Li JH, et al. Engineered global regulator H-NS improves the acid tolerance of. Microb Cell Fact, 2018, 17: 118, doi: 10.1186/s12934-018-0966-z.

[60] Klein-Marcuschamer D, Stephanopoulos G. Assessing the potential of mutational strategies to elicit new phenotypes in industrial strains. Proc Natl Acad Sci USA, 2008, 105(7): 2319–2324.

[61] Tan FR, Wu B, Dai LC, et al. Using global transcription machinery engineering (gTME) to improve ethanol tolerance of. Microb Cell Fact, 2016, 15: 4, doi: 10.1186/s12934-015-0398-y.

[62] Yang J, Kim B, Kim GY, et al. Synthetic biology for evolutionary engineering: from perturbation of genotype to acquisition of desired phenotype. Biotechnol Biofuels, 2019, 12: 113, doi: 10.1186/s13068-019-1460-5.

[63] Wang HH, Isaacs FJ, Carr PA, et al. Programming cells by multiplex genome engineering and accelerated evolution. Nature, 2009, 460(7257): 894–898.

[64] Singh V, Braddick D. Recent advances and versatility of MAGE towards industrial applications. Syst Synth Biol, 2015, 9(S1): 1–9.

[65] Carr PA, Wang HH, Sterling B, et al. Enhanced multiplex genome engineering through co-operative oligonucleotide co-selection. Nucleic Acids Res, 2012, 40(17): e132, doi: 10.1093/nar/gks455.

[66] Lajoie MJ, Gregg CJ, Mosberg JA, et al. Manipulating replisome dynamics to enhance lambda Red-mediated multiplex genome engineering. Nucleic Acids Res, 2012, 40(22): e170.

[67] Barbieri EM, Muir P, Akhuetie-Oni BO, et al. Precise editing at DNA replication forks enables multiplex genome engineering in eukaryotes. Cell, 2017, 171(6): 1453–1467.e13.

[68] Warner JR, Reeder PJ, Karimpour-Fard A, et al. Rapid profiling of a microbial genome using mixtures of barcoded oligonucleotides. Nat Biotechnol, 2010, 28(8): 856–862.

[69] Luan GD, Cai Z, Li Y, et al. Genome replication engineering assisted continuous evolution (GREACE) to improve microbial tolerance for biofuels production. Biotechnol Biofuels, 2013, 6: 137, doi: 10.1186/1754-6834-6-137.

[70] Wang XL, Wang Y, Liu J, et al. Enhanced methanol utilization in genetically engineeredby directed evolution. Biotech Bull, 2017, 33(9): 101–109 (in Chinese). 王曉璐, 王鈺, 劉嬌, 等. 利用定向進化提高基因工程大腸桿菌的甲醇利用能力. 生物技術通報, 2017, 33(9): 101–109.

[71] Chai MZ, Jia B, Li BZ, et al. Advances in synthetic genome and genome rearrangement. Chin Bull Life Sci, 2019, 31(4): 364–371 (in Chinese). 柴夢哲, 賈斌, 李炳志, 等. 人工基因組合成與重排研究進展. 生命科學, 2019, 31(4): 364–371.

[72] Huang YQ, Liu D, Jia B, et al. SCRaMbLE of synthetic yeast chromosomes and applications. Biotech Bus, 2019, (1): 62–66 (in Chinese). 黃耀慶, 劉奪, 賈斌, 等. 合成型釀酒酵母染色體重排技術及應用. 生物產業技術, 2019, (1): 62–66.

[73] Liu W, Luo ZQ, Wang Y, et al. Rapid pathway prototyping and engineering usingandsynthetic genome SCRaMbLE-in methods. Nat Commun, 2018, 9: 1936, doi: 10.1038/s41467-018-04254-0.

[74] Jia B, Wu Y, Li BZ, et al. Precise control of SCRaMbLE in synthetic haploid and diploid yeast. Nat Commun, 2018, 9: 1933, doi: 10.1038/s41467-018-03084-4.

[75] Blount BA, Gowers GF, Ho JCH, et al. Rapid host strain improvement byrearrangement of a synthetic yeast chromosome. Nat Commun, 2018, 9: 1932, doi: 10.1038/s41467-018-03143-w.

[76] Shen MJ, Wu Y, Yang K, et al. Heterozygous diploid and interspecies SCRaMbLEing. Nat Commun, 2018, 9: 1934, doi: 10.1038/s41467-018-04157-0.

[77] Luo ZQ, Wang LH, Wang Y, et al. Identifying and characterizing SCRaMbLEd synthetic yeast using ReSCuES. Nat Commun, 2018, 9: 1930, doi: 10.1038/s41467-017-00806-y.

[78] Choi JW, Yim SS, Kim MJ, et al. Enhanced production of recombinant proteins withby deletion of insertion sequences (IS elements). Microb Cell Fact, 2015, 14: 207, doi: 10.1186/s12934-015-0401-7.

[79] Annaluru N, Ramalingam S, Chandrasegaran S. Rewriting the blueprint of life by synthetic genomics and genome engineering. Genome Biol, 2015, 16: 125, doi: 10.1186/s13059-015-0689-y.

[80] Juhas M, Reu? DR, Zhu BY, et al.andessential genes and minimal cell factories after one decade of genome engineering. Microbiology, 2014, 160(11): 2341–2351.

[81] Sasaki M, Kumagai H, Takegawa K, et al. Characterization of genome-reduced fission yeast strains. Nucleic Acids Res, 2013, 41(10): 5382–5399.

[82] Yu BJ, Kang KH, Lee JH, et al. Rapid and efficient construction of markerless deletions in thegenome. Nucleic Acids Res, 2008, 36(14): e84, doi: 10.1093/nar/gkn359.

[83] Wang L, Maranas CD. MinGenome: antop-down approach for the synthesis of minimized genomes. ACS Synth Biol, 2018, 7(2): 462–473.

[84] Komatsu M, Uchiyama T, ōmura S, et al. Genome-minimizedhost for the heterologous expression of secondary metabolism. Proc Natl Acad Sci USA, 2010, 107(6): 2646–2651.

[85] Komor AC, Badran AH, Liu DR. CRISPR-based technologies for the manipulation of eukaryotic genomes. Cell, 2017, 168(1/2): 20–36.

[86] Lian JZ, Bao ZH, Hu SM, et al. Engineered CRISPR/Cas9 system for multiplex genome engineering of polyploid industrial yeast strains. Biotechnol Bioeng, 2018, 115(6): 1630–1635.

[87] Lee HH, Ostrov N, Wong BG, et al. Functional genomics of the rapidly replicating bacteriumby CRISPRi. Nat Microbiol, 2019, 4(7): 1105–1113.

[88] Zhang GQ, Lin YP, Qi XN, et al. TALENs-assisted multiplex editing for accelerated genome evolution to improve yeast phenotypes. ACS Synth Biol, 2015, 4(10): 1101–1111.

[89] Gan YM, Lin YP, Guo YF, et al. Metabolic and genomic characterisation of stress-tolerant industrialstrains from TALENs-assisted multiplex editing. FEMS Yeast Res, 2018, 18(5): foy045, doi: 10.1093/femsyr/foy045.

[90] Wang Y, Liu Y, Liu J, et al. MACBETH: Multiplex automatedbase editing method. Metab Eng, 2018, 47: 200–210.

[91] Zhu ZM, Zhang J, Ji XM, et al. Evolutionary engineering of industrial microorganisms-strategies and applications. Appl Microbiol Biotechnol, 2018, 102(11): 4615–4627.

[92] Dragosits M, Mattanovich D. Adaptive laboratory evolution-principles and applications for biotechnology. Microb Cell Fact, 2013, 12: 64, doi: 10.1186/1475-2859-12-64.

[93] van den Bergh B, Swings T, Fauvart M, et al. Experimental design, population dynamics, and diversity in microbial experimental evolution. Microbiol Mol Biol Rev, 2018, 82(3): e00008–18, doi: 10.1128/MMBR. 00008-18.

[94] Wang QH, Wang BW, Ma YH. A programmed control equipment for adaptation, screening and cultivation: CN, 203373351U. 2014-01-01 (in Chinese).王欽宏, 汪保衛, 馬延和. 一種程序化控制的馴化篩選培養設備: CN, 203373351U. 2014-01-01.

[95] Wang QH, Lin YP, Qi XN, et al.and its breeding methods and applications in ethanol production by industrial fermentation: CN, 107603898A. 2018-01-19 (in Chinese).王欽宏, 藺玉萍, 齊顯尼, 等. 釀酒酵母及其育種方式及工業化發酵生產乙醇的應用: CN, 107603898A. 2018-01-19.

[96] Liu JH, Li HL, Zhao GR, et al. Redox cofactor engineering in industrial microorganisms: strategies, recent applications and future directions. J Ind Microbiol Biotechnol, 2018, 45(5): 313–327.

[97] Wang M, Chen BQ, Fang YM, et al. Cofactor engineering for more efficient production of chemicals and biofuels. Biotechnol Adv, 2017, 35(8): 1032–1039.

[98] Chen XL, Li SB, Liu LM. Engineering redox balance through cofactor systems. Trends Biotechnol, 2014, 32(6): 337–343.

[99] Zhao CH, Zhao QW, Li Y, et al. Engineering redox homeostasis to develop efficient alcohol-producing microbial cell factories. Microb Cell Fact, 2017, 16(1): 115, doi: 10.1186/s12934-017-0728-3.

[100] Akhtar MK, Jones PR. Cofactor engineering for enhancing the flux of metabolic pathways. Front Bioeng Biotechnol, 2014, 2: 30, doi: 10.3389/fbioe.2014.00030.

[101] Wang YP, San KY, Bennett GN. Cofactor engineering for advancing chemical biotechnology. Curr Opin Biotechnol, 2013, 24(6): 994–999.

[102] Reynolds TS, Courtney CM, Erickson KE, et al. ROS mediated selection for increased NADPH availability in. Biotechnol Bioeng, 2017, 114(11): 2685–2689.

[103] Ng CY, Farasat I, Maranas CD, et al. Rational design of a synthetic Entner-Doudoroff pathway for improved and controllable NADPH regeneration. Metab Eng, 2015, 29: 86–96.

[104] Cahn JK, Werlang CA, Baumschlager A, et al. A general tool for engineering the NAD/NADP cofactor preference of oxidoreductases. ACS Synth Biol, 2017, 6(2): 326–333.

[105] Knaus T, Paul CE, Levy CW, et al. Better than nature: nicotinamide biomimetics that outperform natural coenzymes. J Am Chem Soc, 2016, 138(3): 1033–1039.

Regulation and adaptive evolution of industrial microorganisms towards genetic and environmental disturbances

Yuping Lin, and Qinhong Wang

CAS Key Laboratory of Systems Microbial Biotechnology, Tianjin Institute of Industrial Biotechnology, Chinese Academy of Sciences, Tianjin 300308, China

Harnessing industrial microorganisms to utilize renewable feedstocks and meanwhile produce biofuels, bulk chemicals, food ingredients, nutraceuticals, pharmaceuticals, industrial enzymes, etc. is the basis for successful biological industries. Robust traits of industrial microorganisms including high yield and productivity as well as stress tolerance are controlled by sophisticated genetic regulatory networks. Engineering robustness of industrial microorganisms requires systematic and global perturbations at the genome-wide scale to accelerate the accumulation of diversified genotypic mutations, thus generating desirable phenotypes. We review heve the mechanisms of genetic regulation and stress response in robust industrial organisms, the global perturbations and multiplex accelerated evolution at the genome-wide scale, as well as the global perturbation of cellular redox balance. In the future, based on system biology and synthetic biology, more efforts should be further devoted to understanding the mechanisms behind robust traits in industrial microorganisms under industrial niches for modeling and prediction as well as systematic engineering.

genetic regulation, environmental stress, global genome perturbation, multiplex accelerated evolution

10.13345/j.cjb.190247

藺玉萍 博士，中國科學院天津工業生物技術研究所副研究員，碩士生導師。2010年畢業于中國科學院微生物研究所。2011年至2015年，加州大學伯克利分校從事博士后研究。2016年，入選天津市濱海新區“131”創新型人才培養工程第二層次人才。2017年，入選天津市創新人才推進計劃重點領域創新團隊“工業合成生物創新團隊”核心成員。2019年，瑞典查爾姆斯理工大學The division of Systems and Synthetic Biology公派訪問學者。主要從事酵母組學與基因組工程等研究工作。已在、、、等相關領域期刊發表SCI論文21篇，國內授權專利1項。

藺玉萍, 王欽宏. 工業微生物遺傳和環境擾動的調控和適應進化. 生物工程學報, 2019, 35(10): 1925–1941.

Lin YP, Wang QH. Regulation and adaptive evolution of industrial microorganisms towards genetic and environmental disturbances. Chin J Biotech, 2019, 35(10): 1925–1941.

June 12, 2019;

August 30, 2019

Supported by:National Natural Science Foundation of China (No. 31700077), Natural Science Foundation of Tianjin, China (No. 16JCYBJC43100), the Scientific Instrument Developing Project of the Chinese Academy of Sciences (No. YJKYYQ20170023).

Yuping Lin. Tel: +86-22-24828705; Fax: +86-22-84861950; E-mail: lin_yp@tib.cas.cn

國家自然科學基金 (No. 31700077)，天津市自然科學基金 (No. 16JCYBJC43100), 中國科學院科研儀器設備研制項目 (No. YJKYYQ20170023)資助。

2019-09-17

http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1998.Q.20190917.0947.002.html

(本文責編 陳宏宇)