蛋白質工程：從定向進化到計算設計

曲戈，朱彤，蔣迎迎，吳邊，孫周通

蛋白質工程：從定向進化到計算設計

曲戈1*，朱彤2*，蔣迎迎1，吳邊2，孫周通1

1 中國科學院天津工業生物技術研究所，天津 300308 2 中國科學院微生物研究所，北京 100101

定向進化通過建立突變體文庫與高通量篩選方法，快速提升蛋白的特定性質，是目前蛋白質工程最為常用的蛋白質設計改造策略。近十年隨著計算機運算能力大幅提升以及先進算法不斷涌現，計算機輔助蛋白質設計改造得到了極大的重視和發展，成為蛋白質工程新開辟的重要方向。以結構模擬與能量計算為基礎的蛋白質計算設計不但能改造酶的底物特異性與熱穩定性，還可從頭設計具有特定功能的人工酶。近年來機器學習等人工智能技術也被應用于計算機輔助蛋白質設計改造，并取得矚目的成績。文中介紹了蛋白質工程的發展歷程，重點評述當前計算機輔助蛋白質設計改造方面的進展與應用，并展望其未來發展方向。

蛋白質工程，計算設計，結構模擬，能量函數，人工智能

地球生命歷經40億年的自然進化，孕育了無數功能豐富、結構復雜的蛋白質，但天然的蛋白質在穩定性、耐受性、選擇性等方面往往無法滿足工業生產的需求，促使人類探索高效的蛋白質改造方法。蛋白質的三維結構決定其生物學功能，而三維結構又由其內在的氨基酸序列決定。蛋白質的序列空間極為龐大，以一條100個氨基酸長度的蛋白質為例，每個位點可以突變成20種天然氨基酸，它的序列空間達到20100(約10130)，這一數字甚至超過了宇宙中所包含原子的總和[1]。因此，自然界需要花費數百萬年來進化得到具有新功能的蛋白質，人類要想獲得性能優異的酶還得依靠自身的智慧[2]。

20世紀80年代，聚合酶鏈式反應 (Polymerase chain reaction, PCR) 技術的出現為人類改造蛋白質結構提供了高效的分子操作手段，蛋白質工程應運而生。研究者運用PCR技術在基因特定位點引入突變，從而改變蛋白質對應位置的氨基酸殘基種類。最初的蛋白質設計案例中，由于彼時缺少蛋白結構與機理研究，突變位點的選擇完全依靠研究人員的經驗，因此是一種初級理性設計策略，適用性較窄[3]。在此背景下，定向進化 (Directed evolution) 策略誕生，該技術通過對蛋白質進行多輪突變、表達和篩選，引導蛋白質的性能朝著人們需要的方向進化，從而大幅縮短蛋白質進化的過程[4]。在這之后，定向進化與理性設計結合，形成了半理性設計 (Semi-rational design) 策略，旨在構建“小而精”的突變體文庫，進一步提高效率。近年來，隨著結構生物學、計算生物學及人工智能技術的迅猛發展，計算機輔助蛋白質設計 (Computer-assisted protein design, CPD) 策略為蛋白質工程領域注入了新的學術思想和技術手段，出現了基于結構模擬與能量計算來進行蛋白質設計的新方法，以及使用人工智能 (Artificial intelligence, AI) 技術指導蛋白質改造的新思路。總體來看，蛋白質工程經歷了從初級理性設計、定向進化、半理性設計，再到計算設計的發展歷程 (圖1)。

圖1 蛋白質工程發展歷程

1 定向進化與半理性設計

1.1 定向進化

為了加速蛋白質的進化，定向進化這一策略在20世紀80–90年代被開發出來，通過位點飽和突變(Saturation mutagenesis, SM)、易錯PCR (Error-prone polymerase chain reaction, epPCR) 及DNA重組 (DNA shuffling) 等技術，可有效產生序列多樣性的隨機突變體文庫，表達并篩選特定性狀提高的目標突變體。將這一過程重復數輪，通過連續積累有益突變，最終可成功獲得性能改進或具有新功能的蛋白質[3]。定向進化是一種工程化的改造思路，不需要事先了解結構信息及催化機制，通過迭代有益突變，實現蛋白質性能的飛躍。2018年諾貝爾化學獎得主Frances H. Arnold團隊在這一領域作出了杰出貢獻，其團隊通過使用隨機突變及單點飽和突變策略改造P450氧化酶，實現了 碳-硅成鍵[5]、碳-硼成鍵[6]、烯烴反馬氏氧化[7]、卡賓及氮賓的碳-氫鍵插入[8-9]等一系列令人矚目的成果。

定向進化技術在工業化應用領域也扮演了重要角色。例如美國Codexis公司通過對羰基還原酶和鹵醇脫鹵酶進行定向改造，實現降膽固醇藥物立普妥關鍵手性砌塊的產業化生產[10]；Codexis聯合默克公司 (現已合并) 對轉氨酶進行多輪定向進化，實現不對稱氨化合成Ⅱ型糖尿病治療藥物西他列汀的工業化應用[11]；近年來，華東理工大學許建和團隊通過基因挖掘及定向進化羰基還原酶，實現了 ()-硫辛酸的綠色制造工藝[12]。

1.2 半理性設計

全隨機突變策略是以隨機的方式引入突變，它的瓶頸在于突變體文庫的規模非常大，不利于篩選。借助蛋白質保守位點及晶體結構分析，通過非隨機的方式選取若干個氨基酸位點作為改造靶點，并結合有效密碼子的理性選用，構建“小而精”的突變體文庫是克服這一瓶頸的有效方式，這種方式被稱為半理性設計。20世紀90年代，Manfred T. Reetz教授在酶的不對稱催化改造工作中發現影響手性選擇的氨基酸位點主要集中在底物結合口袋區域，在此基礎上開發了組合活性中心飽和突變策略(Combinatorial active-site saturation test, CAST) 及迭代飽和突變技術 (Iterative saturation mutagenesis, ISM)，廣泛應用于酶的立體/區域選擇性、催化活力、熱穩定性等酶參數的改造[10-15]。例如通過CAST/ISM策略對P450-BM3單加氧酶進行改造，并與醇脫氫酶或過氧化物酶偶聯，使其成功應用于高附加值手性二醇及衍生物的不對稱催化合成[16-17]。最近，Reetz教授與吳起團隊合作，在有效密碼子的選取方面作了改進，提出Focused Rational Iterative Site-specific Mutagenesis (FRISM) 策略，并應用于南極假絲酵母脂肪酶B (CALB) 的不對稱催化，成功獲得了雙手性中心底物所對應的全部4種異構體，且選擇性均在90%以上[18]。

在CAST基礎上，孫周通等通過理性選擇 3種氨基酸密碼子作為飽和突變的構建單元，開發了三密碼子飽和突變技術TCSM (Triple code saturationmutagenesis)，進一步降低了篩選工作 量[19-20]。除此之外，Gjalt W. Huisman團隊基于統計學方法開發的ProSAR (Protein sequence activity relationships)[21]及Miguel Alcalde團隊基于序列同源性開發的MORPHING (Mutagenic organized recombination process by homologousgrouping)[22]工具也廣泛應用于蛋白酶的設計改造。其他半理性設計策略及應用已在前文進行過評述[23]。基于筆者經驗，半理性設計是建立在已有知識(如保守序列、晶體結構、催化機制、通量篩選方法、前期實驗數據等)的基礎上，對目標蛋白進行再設計。因此，前期基礎的豐富程度直接影響到半理性設計的成功與否。

2 計算機輔助蛋白質設計

2.1 概述

隨著計算機運算能力持續提升、先進算法相繼涌現，以及蛋白質序列特征、三維結構、催化機制之間關系不斷被挖掘和解析，計算機輔助蛋白質設計策略得到前所未有的重視和發展，人類迎來了蛋白質從頭設計的時代[24-25]。蛋白質計算設計一般以原子物理、量子物理、量子化學揭示的微觀粒子運動、能量與相互作用規律為理論基礎，也有部分研究以統計能量函數為算法依據。研究者在計算機的輔助下，通過運用分子對接 (Molecular docking)、分子動力學模擬 (Molecular dynamic simulations)、量子力學 (Quantum mechanics) 方法、蒙特卡羅 (Monte Carlo) 模擬退火 (Simulated annealing) 等一系列計算方法 (相關方法及使用已有文章綜述[26])，預測并評估數以千計的突變體在結構、自由能、底物結合能等方面的變化?；谟嬎憬Y果，從中篩選可能符合改造要求的突變體并進行實驗驗證(如突變體能否正常表達、折疊及行使預期功能等)；再根據實驗結果制定下一輪計算方案，循環往復直到獲得符合需求的酶 (圖2)。與定向進化相比，蛋白質計算設計可提供明確的改造方案，大幅降低建立、篩選突變體文庫所需的工作量，目前已在蛋白質從頭設計、酶的底物選擇性與熱穩定性設計等方面取得了眾多成果，更有部分成果達到了工業應用水平[27-28]。

圖2 計算機輔助蛋白質設計流程

2.2 蛋白質從頭設計

蛋白質的從頭設計于2016年被雜志列入年度十大科學突破[29]，其目標是創造自然界不存在的、可成功折疊的蛋白質并賦予其特定功能，在開發新型病毒疫苗[30-32]、進行腫瘤治療[33]等領域發揮作用。1997年，Stephen L. Mayo團隊提出了包括設計、模擬、實驗和分析四步的蛋白質設計策略PDA (Protein design automation) 并開發了相應的軟件，以鋅指結構域為模板成功設計了一個由28個氨基酸組成的ββα蛋白，其核磁檢測結構與預測結構高度一致[34]。2003年，華盛頓大學的David Baker團隊設計并構建了一個非天然結構模板[35]，為蛋白質設計領域開辟了新的方向，其開發的Rosetta軟件如今已發展為集蛋白質從頭設計、酶活性中心設計、配體對接、生物大分子結構預測等功能為一體的生物大分子計算建模與分析軟件組合[36]。目前該程序中最常用的工具包括用于設計蛋白質骨架氨基酸序列的Rosetta Design，以及用于評估序列變化對蛋白質穩定性影響的Rosetta DDG等[37-38]。

表1總結了最近十年蛋白質從頭設計的部分案例。大部分案例采用了基于Rosetta的設計策略，其中最具代表性的便是Baker團隊提出的“Inside- out”設計策略，該策略的主體流程如下：在催化機理完全明確的前提下，研究者首先運用量子化學方法設計酶的活性中心，確定酶的關鍵催化基團與底物形成的過渡態構象 (Theozyme)；然后使用RosettaMatch搜索蛋白質結構數據庫，嘗試將theozyme與已有蛋白質結構匹配，篩選能維持theozyme構象的蛋白質骨架結構；接下來使用Rosetta Design設計位于活性中心但不直接參與催化的氨基酸，運用基于蒙特卡羅的模擬退火算法進行多輪采樣，獲得經過優化的完整酶結構；最后制定評分標準，依據過渡態能量、配體位置取向等多項參數評估設計結果，挑選排名靠前的結構開展活性驗證實驗[39-40]。運用這套策略，Baker團隊成功從頭設計了多種酶，其中Retro-Aldol反應酶催化的C-C鍵斷裂反應速率比無酶反應體系高出4個數量級[41]；Kemp消除反應酶催化的消除反應速率比無酶反應體系高出5個數量級[42]；Diels-Alder反應酶可催化兩個底物發生[4+2]雙烯環加成反應，形成具有兩個手性碳原子的產物，對映選擇性達到97%[43]。

表1 最近十年計算機輔助的蛋白質局部與全局設計的部分案例

蛋白質序列從頭設計的主要困難是計算模型的精度不夠，導致設計成功率低。大量天然蛋白質的已知序列結構數據可用來改善模型精度，乃至建立精度更高的新計算模型。中國科學技術大學劉海燕團隊發展了蛋白質序列設計的統計能量模型ABACUS (A backbone based amino acid usage survey)。用其對不同折疊類型的天然蛋白質骨架進行從頭序列設計，實驗證明這些序列全自動設計的蛋白質能夠可溶性表達并正確折疊，對Dv_1ubq、D_1cy5_M2兩個蛋白分子的結構解析結果表明其與設計目標高度吻合[67]。之后程序算法進一步優化，加入了范德華能量函數，設計準確率再度提高，原本需要其他策略輔助提高折疊成功率的1r26蛋白分子，也能應用新一代程序一步設計到位[68]。

“Inside-out”設計策略針對的是酶的活性中心以及催化的反應類型，而酶的骨架結構仍采用自然界已有的蛋白質結構，若骨架結構也能從頭設計，便能獲得完全由人類設計而非自然進化形成的酶[69]。目前，主鏈骨架設計還更多依賴于基于“規則”的啟發式方法，通用計算方法仍在發展之中。在此方面，劉海燕團隊提出了建立氨基酸序列待定、只依賴于主鏈結構的統計能量模型的設計方法，他們已發表的TetraBASE (Tetrahedron- based backbone statistical energy) 驗證了這條途徑原理上是可能的[70]。進一步，他們已發展了基于神經網絡統計能量項的SCUBA (Sidechain unspecialized backbone arrangement) 模型，能在序列待定情況下進行主鏈骨架的全柔性設計和連續采樣，這類方法的發展將極大拓寬可選蛋白質骨架結構范圍。

2.3 酶的底物選擇性與熱穩定性設計

酶對底物的特異選擇性一方面避免了各種副反應的發生，但另一方面限制了酶的底物譜。從自然界中挖掘新酶的速度并不能滿足生物技術產業快速增長的需求，因此改變酶的底物特異性是蛋白質計算設計的重要應用方向[39]。Baker團隊對鳥嘌呤脫氨酶進行改造，運用同源建模和量子化學計算方法設計以三聚氰酸酰胺為底物的活性中心結構，確定關鍵側鏈基團的位置后優化殘基所在的loop區序列以保證新活性中心結構的穩定，在刪除2個、突變4個氨基酸殘基后使得酶對新底物的活性提高約100倍[71]。在另一項工作中，Baker團隊使用Rosetta Design與Foldit改造苯甲醛裂解酶的結合口袋，使其催化3分子甲醛聚合形成二羥丙酮反應的活性提高近100倍，為實現核心生物代謝分子磷酸二羥丙酮合成途徑的重構打下基礎[72]。中國科學院微生物研究所吳邊團隊則使用Rosetta Design與高通量分子動力學模擬方法對天冬氨酸酶的活性中心進行設計，得到一系列突變體，分別能高效催化巴豆酸、(E)-2-戊烯酸、富馬酸單酰胺、(E)-肉桂酸的β-加氨反應，其中巴豆酸β-加氨合成β-氨基丁酸的反應底物濃度可達300 g/L，反應轉化率大于99%，立體選擇性大于99%，已具有工業生產的潛力[28]。

工業酶時常需要在高溫環境下發揮功能，因此提升酶的熱穩定性在工業生產方面具有重要意義。荷蘭格羅寧根大學的Dick Janssen團隊提出了一種運用計算方法提升酶熱穩定性的FRESCO策略 (Framework for rapid enzyme stabilization by computational libraries)，主要流程如下：研究者首先使用Rosetta DDG、FoldX、動態二硫鍵挖掘、保守序列分析等計算軟件或方法，預測能提高蛋白質熱穩定性的單點突變；然后通過分子動力學模擬分析單點突變對酶的影響，刪除化學角度上不合理或可能提高蛋白質結構靈活度的突變方案；接下來對剩余單點突變方案進行實驗驗證，表達、純化突變后的酶并測定熔融溫度與催化活性，篩選出熱穩定性提高的突變體；最后將一部分單點突變疊加，獲得熱穩定性大幅提高的多點突變體[73]。該策略指導下的酶改造過程中，需要表達、純化的單點突變體不超過200個，單點預測成功率大于10%，酶的熔融溫度一般可提升20–35 ℃[74]。Janssen團隊運用該策略成功地提升了檸檬烯環氧化物水解酶[73]、鹵代醇脫鹵酶[75]、鹵代烷脫鹵酶[76]等多種酶的熱穩定性，其中以檸檬烯環氧化物水解酶為代表，該酶的熔融溫度從50 ℃提升至85 ℃，55 ℃下的半衰期延長250倍，催化活性提高的同時仍保留反應的立體選擇性。吳邊團隊同樣運用FRESCO策略，將一種木聚糖酶的熔融溫度提升了14 ℃，改造后的酶在70 ℃下反應5 h的產物量相比野生型提高了10倍，為其應用于工業生產打下基礎[77]。

2.4 人工智能技術在計算設計中的應用

得益于計算速度的大幅提升以及海量數據集的出現，當前人工智能技術的發展如火如荼。在人工智能領域，機器學習 (Machine learning) 已經成為開發計算機視覺、語音識別、自然語言處理、機器人操控和其他應用范疇的首選方法[78]。近年來，機器學習等人工智能方法也被應用于蛋白質工程，包括Frances H. Arnold、Manfred T. Reetz等定向進化先驅所領導的實驗室均涉足機器學習領域，利用其指導蛋白質設計改造[79-80]。

蛋白質突變體及其對應的實驗數據本身是無法被機器學習算法直接識別的，其序列、結構、功能等特征 (Feature) 信息必須以向量或數組的形式展現出來，才能構建被機器學習算法識別的模型。模型的好壞取決于特征提取。以氨基酸在蛋白序列上的位置信息為特征，是比較常見的處理方式；另外，氨基酸殘基位點的理化性質 (如帶電性、親疏水性、側鏈空間體積等) 或所處的二級結構信息均可作為特征。問題在于應優先選取哪些特征，以及這些特征能在多大程度上決定蛋白質擬改造性能是需要進行考量的[81]。目前已經有一些蛋白質/氨基酸特征工具箱可供參考，包括AAIndex[82]、ProFET[83]等。一旦特征提取之后，將交付機器學習算法進行學習并生成可以描述數據模型的目標函數，并對蛋白質序列進行虛擬進化，通過訓練和測試評估效能，最終給出預測結果 (圖3)。

圖3 機器學習指導的蛋白質設計改造流程

作為人工智能領域常用技術，機器學習基于大量的數據進行訓練，通過各種算法解析數據并從中學習，然后對處理任務作出決策。機器學習包括3種：1) 有監督學習 (Supervised learning)，向計算機提供原始數據及其所對應的結果 (或稱標簽，labels)，最終計算機給出定性(分類，classification) 或定量(回歸，regression) 的預測；2) 無監督學習 (Unsupervised learning)，只給計算機訓練數據而不提供結果，最終得到聚類 (Clustering) 的學習結果；3) 半監督學習 (Semi-supervised learning)，其訓練數據一部分是有對應的結果，另一部分則無結果。由于蛋白質設計改造過程中可產出大量的突變體實驗數據，因此有監督學習應用在該領域最為普遍[81]。

目前尚未有任何一種普適的學習算法，可以應對所有的學習任務，在蛋白質設計改造領域亦是如此。因此，科研工作者需要在相應的情況下，通過測試比對等方式選用合適的算法進行設 計[84]。常見算法包括線性模型(Linear models)、隨機森林(Random forests)、支持向量機(Support vector machines)、高斯過程(Gaussian processes) 等。以Frances H. Arnold團隊近期改造一氧化氮雙加氧酶 (NOD) 立體選擇性的工作為例，先后通過K最近鄰、線性模型、決策樹、隨機森林等多個算法構建NOD的立體選擇性催化模型，將76% ()-ee初始突變體提升至93% ()-ee及反轉至79% ()-ee[85]。此外，表2列舉了近十幾年來機器學習指導蛋白質設計的應用實例，涉及蛋白質的熱穩定性、催化活性、對映體選擇性、光敏性及可溶性等多個方面。從中不難看出，機器學習的可應用性非常強，各常用算法均可覆蓋某些蛋白質性能的改造。

表2 機器學習指導蛋白質設計應用

除了上述傳統機器學習方法，自2006年以來，深度學習(Deep learning)成為機器學習中的一個新興領域，如2018年DeepMind團隊開發的AlphaFold在Critical Assessment of protein Structure Prediction (CASP) 全球競賽中獲勝，總計43個蛋白質結構的預測結果中，有25個獲得了最高分數。

深度學習通過訓練深度神經網絡，學習由低到高的特征層次，進而對輸入數據進行分層抽象處理，原始特征數據能夠被映射成更高層次和更抽象的數據表示，能有效增強辨別能力和減輕無關因素的影響，因此深度學習深刻變革了機器學習領域[113-114]。相比之下，傳統的學習技術 (如支持向量機、高斯回歸和人工神經網絡等) 則強烈依賴于人工提取的特征，由于它們明確的特征編碼原理，這些方法可能會丟失隱藏在輸入數據中的敏感特征。現在已有利用卷積神經網絡 (Convolutional neural networks, CNN) 和循環神經網絡 (Recurrent neural network, RNN) 進行蛋白質結合親和力的預測報道[104,106]。相信深度學習未來可以在蛋白質設計改造領域扮演更加重要的角色。

3 結論及展望

自20世紀80年代以來，蛋白質工程經歷了輝煌發展的30多年，兩次獲得諾貝爾化學獎 (1993年授予Michael Smith教授及2018年授予Frances H. Arnold教授)。從定向進化、半理性設計到理性設計，每個階段均涌現了一系列廣泛應用的改造策略和技術，同時對計算技術的依賴也逐漸加深。定向進化不依賴蛋白質晶體結構及催化機制等信息，但存在篩選瓶頸；半理性設計兼顧了序列空間多樣性和篩選工作量；而理性設計則可以構建自然界不存在的新酶新反應。在開展具體的蛋白質工程案例時，應充分考慮到上述因素，基于改造目的靈活選用合適的改造策略[115–116]。

如今，數據驅動的人工智能技術正在全球范圍內蓬勃興起，為蛋白質設計改造注入了新動能。蛋白質的智能化計算設計是未來發展新趨勢，目前在國內外基本上都處在起步階段。因此，這是我國在蛋白質設計改造領域比肩世界先進水平的難得機會。期待我們能夠把握好這一發展機遇，處理好人工智能在蛋白質設計改造領域的應用，通過開發具有自主知識產權的蛋白質計算設計新技術，解決“卡脖子”技術難題，滿足工業界綠色、節能、環保轉型升級需求，共同譜寫出該領域新的光輝篇章。

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Protein engineering: from directed evolution to computational design

Ge Qu1*, Tong Zhu2*, Yingying Jiang1, Bian Wu2, and Zhoutong Sun1

1 Tianjin Institute of Industrial Biotechnology, Chinese Academy of Sciences, Tianjin 300308, China 2 Institute of Microbiology, Chinese Academy of Sciences, Beijing 100101, China

By constructing mutant libraries and utilizing high-throughput screening methods, directed evolution has emerged as the most popular strategy for protein design nowadays. In the past decade, taking advantages of computer performance and algorithms, computer-assisted protein design has rapidly developed and become a powerful method of protein engineering. Based on the simulation of protein structure and calculation of energy function, computational design can alter the substrate specificity and improve the thermostability of enzymes, as well asdesign of artificial enzymes with expected functions. Recently, machine learning and other artificial intelligence technologies have also been applied to computational protein engineering, resulting in a series of remarkable applications. Along the lines of protein engineering, this paper reviews the progress and applications of computer-assisted protein design, and current trends and outlooks of the development.

protein engineering, computational design, simulation of structure, energy function, artificial intelligence

10.13345/j.cjb.190221

孫周通 博士，博士生導師，研究員。2012年博士畢業于中國科學院上海生命科學研究院；2012––2016年分別在新加坡南洋理工大學和德國馬普煤炭化學研究所/馬爾堡大學從事博士后研究；2016年至今，中國科學院天津工業生物技術研究所研究員，課題組長(PI)，主要從事酶分子工程與工業生物催化研究。申請中國發明專利12項，獲中國產學研創新成果獎一項，在國際主流期刊、、、、、、等發表SCI文章20余篇。

曲戈, 朱彤, 蔣迎迎, 等. 蛋白質工程：從定向進化到計算設計. 生物工程學報, 2019, 35(10): 1843–1856.

Qu G, Zhu T, Jiang YY, et al. Protein engineering: from directed evolution to computational design. Chin J Biotech, 2019, 35(10): 1843–1856.

May29, 2019;

July17, 2019

Supported by: CAS Pioneer Hundred Talents Program (No. 2016-053).

Zhoutong Sun. Tel/Fax: +86-22-84861981; E-mail: sunzht@tib.cas.cn

*These authors contributed equally to this study.

中國科學院率先行動“百人計劃”項目 (No. 2016-053) 資助。

2019-08-20

http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1998.Q.20190819.1802.002.html

(本文責編 陳宏宇)