工業蛋白質構效關系的計算生物學解析

陳琦，李春秀，鄭高偉，郁惠蕾，許建和

工業蛋白質構效關系的計算生物學解析

陳琦，李春秀，鄭高偉，郁惠蕾，許建和

華東理工大學 生物工程學院，上海 200237

工業催化用酶已經成為現代生物制造技術的核心“芯片”。不斷設計和研發新型高效的酶催化劑是發展工業生物技術的關鍵。工業催化劑創新設計的科學基礎是對酶與底物的相互作用、結構與功能關系及其調控機制的深入剖析。隨著生物信息學和智能計算技術的發展，可以通過計算的方法解析酶的催化反應機理，進而對其結構的特定區域進行理性重構，實現酶催化性能的定向設計與改造，促進其工業應用。聚焦工業酶結構-功能關系解析的計算模擬和理性設計，已成為工業酶高效創制改造不可或缺的關鍵技術。本文就各種計算方法和設計策略以及未來發展趨勢進行簡要介紹和討論。

工業蛋白質，酶，結構-功能關系，分子模擬，理性設計

酶催化為大宗化學品、精細化學品和新型材料等產品提供了一種可持續的綠色合成策略，已經成為現代生物制造產業的核心“芯片”，也是國際知識產權爭奪的焦點。天然環境中獲得的酶催化性能一般較差，難以滿足工業應用對其催化活力、穩定性、溶劑耐受性、底物譜等各個方面的性能要求，需要進行進一步分子改造。因此，不斷設計和研發新型、高效的酶催化劑是發展工業生物技術的關鍵所在。

工業催化劑創新設計的科學基礎是對酶與底物的相互作用、結構與功能關系及其調控機制的深入剖析。對蛋白質特定區域或位點特征的計算研究主要集中在：活性位點的構象、動態變化規律、突變效應和反應環境的影響；底物結合和產物釋放；底物傳遞；輔因子結合和釋放；催化機制和過渡態途徑等。相關的計算手段主要有分子動力學模擬(Molecular dynamics simulation, MD)[1]、量子力學模擬(Quantum mechanics, QM)、混合量子力學和分子力學(Quantum mechanics/molecular mechanics, QM/MM) 模擬等[2]。

分子動力學模擬以經典牛頓力學為理論基礎，模擬獲取體系內所有原子隨時間運動的軌跡，通過分析軌跡文件中整個體系的結構或原子之間相互作用變化，來解析整個體系的動力學性質。通過分子動力學模擬或其他采樣方法分析酶的構象靈活性，可以闡明活性位點和突變位點對酶催化活性的調控作用。混合量子力學和分子力學用量子力學方法計算生物大分子活性部位，用分子力學、分子動力學或自由能微擾理論計算體系中其他原子，這樣就可得到生物大分子活性部位的電子結構，通過能量分析，研究底物的結合模式及酶的催化機理等性質[3]。QM/MM能夠在計算能量分布和能壘、獲得催化機理信息、反應途徑、反應速率等方面提供準確性更高的解析。

除了常規的計算方法，研究者不斷開發其他或有針對性的計算策略深入研究蛋白質的結構功能關系。結合計算模擬和實驗分析，不僅可以揭示酶分子催化反應背后的結構機理，同時可以指導酶的分子改造，促進其工業應用[4-5]。Baker課題組開發了RosettaDesign和RosettaReModel工具來進行蛋白質的結構和靈活性設計[6]。JANUS通過分析多序列比對的結果來預測結構相關但功能不同的酶改造所需的突變[7]。基于Web服務器的HotSpot Wizard可以用于自動識別酶結構中的“熱點”氨基酸，指導針對底物特異性、催化活力或對映選擇性的設計改造，以及蛋白質結構的注釋[8]。POCKETOPTIMIZER針對活性口袋進行設計，可用于對酶的活性位點殘基進行替換，提高其對小分子底物的結合能力[9]。CAVER和POVME2可用于分析通過MD模擬所獲得的軌跡中底物口袋和通道的形態和大小，有針對性地指導活性口袋和底物通道的結構改造[10-11]。荷蘭Janssen課題組開發的CASCO工具可以用于突變體的設計，通過高通量的MD模擬對設計的突變進行排序，以指導酶的立體選擇性改造實驗[12]。FRESCO方法通過預測折疊自由能、增加二硫鍵、剔除不合理突變等步驟來設計小巧型突變體文庫，理性指導酶的熱穩定性改造[13]。

1 基于計算生物學的酶分子理性設計

1.1 解析酶的催化機理

多尺度的分子動力學模擬和QM/MM模擬已被廣泛地用于多種類型的酶分子催化反應機理的解析[14-18]。

針對二氫葉酸還原酶ecDHFR催化循環中的關鍵問題，即Met20環在化學氫化物轉移步驟中是否采用閉合構象，Major等使用QM/MM模擬研究了野生和突變型ecDHFR酶的Met20環在反應中的構象。研究表明，盡管Met20環的構象對氫化物轉移速率和供體-受體距離的相關性不明顯，但它對活性位點水合的有序性具有十分顯著的影響[19]。劉永軍課題組利用QM/MM探索來源于熱帶假絲酵母的烯酰基硫酯還原酶Etr1p催化烯酰硫酯為酰基硫酯的催化機制。計算結果表明穩定的共價烯加合物的形成遵循邁克爾加成機理。同時，結晶水分子雖然不參與催化反應，但通過形成氫鍵網絡在氫化物轉移和質子轉移過程中起關鍵作用[20]。Loll等解析了典型的二萜合酶CotB2催化反應的化學機制。隨著陽離子沿著反應路徑的變化，CotB2活性中的三維結構也隨之改變，作者確定了活性中心通用的結構特征，可用于其他來源的萜烯合酶生成大環化合物的理性設計[21]。Leys獲得了合成單萜的芳樟醇合成酶和1,8-桉樹腦合成酶與氟化底物類似物的復合物晶體結構。模擬表明這些單萜合酶在反應中不會發生顯著的構象變化，這樣有助于利用基于結構的蛋白質工程手段，將這些酶的催化范圍擴展到其他單萜底物[22]。

細胞色素P450酶的底物譜非常廣泛，Houk課題組綜合使用DFT計算和MD模擬分析酶分子的構象變化和結合機制，解析酶催化機制和過渡態[23]。另外，P450過氧化酶OleTJE使用H2O2作為氧化劑，催化脂肪酸轉化為烯烴而無需額外的電子傳遞。Faponle等同樣綜合利用DFT和QM/MM研究，針對OLeTJE進行蛋白質工程改造以提高產品的選擇性[24]。德國Reetz課題組獲得細胞色素P450-BM3單加氧酶可以有效生物催化生成對苯二酚。計算研究證實P450-BM3突變體對苯酚選擇性氧化，導致在環氧化物中間體C3=C4雙鍵上產生區域選擇性[25]。

Moliner等開展了關于甘氨酸N-甲基轉移酶和3種突變體催化SN2反應實現甲基轉移的QM / MM理論研究，驗證實驗觀察到的速率恒定還原和反向次級α-3H動力學同位素效應的變化是否應該歸因于甲基供體與受體間距離的變化，計算獲得的活化自由能和實驗數據非常一致[26]。同樣的，Damborsky等對鹵代烷脫鹵素酶DhaA31催化水解1,2,3-三氯丙烷所涉及的主要步驟進行了全面的計算研究。研究發現底物從通道進入活性中心并結合是一個相對快速的過程，碳-鹵鍵的裂解為反應中的限速步驟。突變體中可催化的構象數目增加且SN2的反應能壘降低，使得突變體中限速步驟的效率顯著增強。最終通過對DhaA31的突變實驗和對中間突變體的動力學分析證實了理論觀察的結果[27]。

分子氧的活化機制是金屬酶研究中的核心問題，Shaik課題組針對非血紅素羥乙基膦酸酯雙加氧酶HEPD和甲基膦酸合酶MPnS這兩種特殊C-H加氧酶進行QM/MM模擬研究，結果顯示MPnS中的O2活化是由活性位點中的相鄰賴氨酸Lys28介導的，證實了在金屬酶的氧活化機制中存在不尋常的質子穿梭機制[28]。Faber等解析了金屬依賴型異乳清酸脫羧酶IDCase催化-芳香雜環化合物區域選擇性羧化的反應機制和底物特異性機理。結果表明天然底物5-羧基尿嘧啶的脫羧是通過親電芳香取代反應進行的，且雜環底物與周圍的氨基酸殘基形成獨特的氫鍵作用，使得IDCase顯示出較高的底物特異性[29]。

1.2 提高酶的催化效率

基于催化反應機理的計算解析的催化機理，可以全面揭示蛋白質的結構-功能關系，并針對性地對蛋白質結合口袋和活性位點進行理性設計改造。例如，大位阻的底物對結合位點的構象動力學具有更高的依賴性，通過突變可以調節結合口袋的靈活性(如結合口袋的體積)，以形成更適合特定底物識別和穩定的構象狀態[30-31]。

通過在活性位點附近的位置引入單突變，孔旭東等將來源于巨大芽孢桿菌的環氧水解酶EH底物范圍擴大到更具空間要求的環氧化物底物[32]。英國Turner課題組對來自黑曲霉的單胺氧化酶MAO-N野生酶進行研究，設計獲得了一系列突變體能夠催化各種大位阻的手性胺底物。這些突變位點不僅位于酶的疏水口袋，其中一部分還位于遠離酶催化活性中心的遠端位置[33-34]。Klinman課題組通過計算手段理性推測得到大豆脂氧合酶SLO-1從溶液到酶活性位點的氧分子通道，結合定點突變方法，最終確定氧通道中兩個關鍵氨基酸的調控機制，并計算出相應突變體的氧分子通道模型[35]。Shin等開展()-構型選擇性轉氨酶OATA的晶體結構及計算模擬分析，從分子機制角度解釋了酶催化的反應機理，所獲得的雙點突變體對3種酮底物的催化活力均有顯著提高[36]。Kaila等對FeII/α-酮戊二酸依賴性的雙加氧酶AsqJ催化喹諾酮生物堿的多步合成進行研究。發現底物的甲基化對活性位點內π-堆積相互作用進行微調，對AsqJ的催化反應必不可少。為了對AsqJ進行理性設計，作者擴大了活性位點內的相互作用，最終獲得的工程酶對非甲基化替代物具有顯著增強的催化活性[37]。根據對底物結合模式的分析，Mattevi對5-羥甲基糠醛氧化酶HMFO氧化5-甲酰基-2-呋喃甲酸生成2,5-呋喃二甲酸進行理性設計改造，兩個關鍵突變增加底物結合親和力并促進酶與底物醛基以正確結合姿勢結合[38]。類似的策略同樣被用于設計改造禾谷鐮刀菌殼寡糖氧化酶的底物譜，使其對乙酰-D-葡糖胺的底物特異性發生改變，成功實現對其他非天然底物的高效催化[39]。

針對來源于光滑假絲酵母的野生型羰基還原酶KR1的底物適用性不夠廣泛、催化活性不夠高的缺陷，鄭高偉等通過分子動力學模擬分析發現位于該酶底物通道loop上的92位苯丙氨酸與175位催化酪氨酸形成π-π堆積作用，阻礙底物與催化殘基的結合。基于結構分析尋找到了兩個位點進行突變驗證，最終獲得一種活性顯著提高的突變體對28種結構多樣性的羰基底物的催化活性均得到顯著提高，可成功用于多種藥物手性中間體的擴大制備(圖1)[40]。除此之外，課題組分析了羧酸酯酶rPPE的野生型和有益突變體中底物結合模式的區別，揭示了突變體酶的催化活力、熱穩定性和對映選擇性提高的結構機理。綜合分析酶的底物結合模式、氨基酸位置及序列保守性來尋找潛在敏感的關鍵氨基酸，預測候選氨基酸突變對蛋白質穩定性和酶活力的影響程度。虛擬篩選出兩個潛在的突變體經試驗驗證催化活力較母本均有顯著提高，大幅度改善了酶促合成藥物關鍵中間體的催化效率[41]。針對胺脫氫酶底物譜較窄的問題，許建和課題組采用計算機輔助的蛋白質工程技術，確定了酶活性口袋中影響酶與大位阻底物結合的關鍵殘基，通過將其突變成分子最小的甘氨酸，實現了對口袋的“裁剪”，拓展了活性口袋的“體積”。將酶催化的底物范圍由最長6個碳鏈的脂肪酮拓展至長達10個碳鏈的脂肪酮(如2-庚酮、2-辛酮、2-壬酮)，顯著地拓寬了該酶催化的底物范圍。此外，這兩個關鍵氨基酸殘基的突變在另外兩個同源胺脫氫酶的改造中也具有類似的效果，為其他胺脫氫酶的底物譜拓展提供了有益的參考(圖2)[42]。

圖1 羰基還原酶CgKR1對多種羰基底物的催化活性均顯著提高[40]

1.3 立體選擇性設計

具有對映選擇性的酶作用于一些前手性底物上，可以精確地生成所需的光學純的對映體產物。生物催化劑的立體選擇性是由底物結合、反應能壘等多種因素組合而產生的。通過對酶分子構象的研究可以發現，酶的底物結合口袋呈現出一種穩定構象，使得其僅適應生成一種特定的對映體。另一方面，可以通過引入突變改變酶的能量圖景，使其能更優先形成所需的對映體，實現立體選擇性的逆轉[43]。

圖2 胺脫氫酶的底物結合口袋改造前后結構對比[42]

QM/MM和MD模擬可以從分子水平上分析調控酶對映選擇性的關鍵因素[44]。大多數的計算研究都是分析在整個MD模擬過程中，底物分子和關鍵催化氨基酸之間的距離和角度，從而定量分析底物分子在催化中心形成可催化的pro-() 或者pro-() 構象的頻率[45-46]。van der Kamp等模擬解析了酮還原酶Ⅱ型聚酮合成酶actKR和兩個關鍵突變體中影響立體選擇性的3種潛在因素：利用經典分子動力學評估形成pro-或pro-反應姿勢的頻率；采用MM/PBSA自由能方法比較pro-或pro-朝向的結合親和力；通過QM/MM MD模擬與傘形采樣評估它們生成-1-decalol反應能壘的差異[47]。檸檬烯環氧水解酶LEH突變體可以催化環戊烯氧化物和環己烯氧化物等環氧化物的水解不對稱化，不同突變體具有不同的(,)-或()-立體選擇性。Reetz等解析了相關突變體對不同底物的特異選擇性和立體選擇性催化的分子機制。根據計算出的各種途徑的活化能，作者發現了有利反應的潛在立體化學機制。由于活性口袋具有顯著的靈活性，親核水分子和環戊烯氧化物之間無法形成催化構象。相反，在催化環己烯氧化物的立體選擇性反應時卻容易形成反應構象[48]。相關的研究證明了酶催化中立體選擇性的復雜性以及基于原子的模擬方法在分析這類問題中的重要作用，同時研究結果也為立體選擇性的理性設計提供了理論基礎。

設計具有立體選擇性的酶的一種途徑是降低它們的活性位點體積，使底物只能以特定的方向結合。亦有研究表明，利用MD模擬進行酶結構靈活性分析可用于識別底物結合口袋附近的關鍵環結構[49]。通過調節這些環結構的構象動力學也可以實現酶分子對映選擇性的逆轉[50]。Janssen和Baker通過計算與MD模擬相結合的手段設計了環氧化物水解酶的活性位點，成功地獲得對映選擇性增強的有益突變[12]。針對環氧水解酶EH1和EH2在催化對硝基苯乙烯類氧化物的水解過程中立體選擇性不夠完善，造成環氧對映體匯聚反應沒有達到100%的理論收率的問題。郁惠蕾等在解析EH2高分辨的酶分子及其與底物復合物晶體結構的基礎上，借助于計算機模擬準確鎖定了酶分子中控制底物結合構象的關鍵氨基酸位點。通過建立了一個小巧型突變體酶庫成功靶向到調控酶催化不同對映體區域選擇性反應的關鍵位點。并且發現該位點的調控作用具有一定程度的普適性，這為同源環氧水解酶的區域選擇性改造提供了新思路和新方向(圖3)[51]。

圖3 綠豆環氧水解酶區域選擇性改造后實現近乎完美的對映匯聚[51]

1.4 提高酶的熱穩定性

工業過程所需的酶催化劑需要承受在其自然環境中通常不會遇到的反應條件，例如高溫、極端pH、高鹽、高底物濃度、存在有機溶劑等。酶的穩定性依賴于通過一定的分子內相互作用使其能維持特定功能結構。提高蛋白質的內部結構穩定性可以提高蛋白質的熱穩定性、溶劑耐受性等。

B-FIT方法針對蛋白質晶體結構中B因子較大的靈活氨基酸殘基，通過穩定這些靈活的氨基酸來穩定整個蛋白質的結構。利用B-FIT方法，Reetz等獲得了來自枯草芽孢桿菌的脂肪酶A (LipA)的突變體，其解鏈溫度m增加了45 ℃，進一步研究發現穩定化提高與整個蛋白分子上增加的氫鍵網絡以及新的帶電氨基酸殘基相關[52]。Bommarius將基于結構的共義性分析方法和B-FIT方法結合起來，成功地將來源于野油菜黃單胞菌的氨基酯水解酶的m值提高了8 ℃，d,obs值提高了13倍[53]。FRESCO方法將可能的單點突變庫減少到1 634個，對突變庫進行人工檢查后，將突變減少到64個進行后續實驗篩選。最終獲得紅色紅球菌的檸檬烯環氧化物水解酶的最優突變體在35 ℃時m為85 ℃，同時動力學穩定性增加了250倍[13]。許建和課題組利用突變作用的加和性和協同性同時提高了羰基還原酶CR的熱穩定性和催化活性。突變殘基主要位于靠近活性中心的靈活loop環上，熱穩定性提高的突變體中引入了新的氫鍵，并提高了蛋白內部的疏水作用力，從而增強了活性口袋周圍靈活loop環的剛性。分子對接結果表明，活性提高的突變點雖然與底物沒有直接接觸，卻導致酶和底物之間氫鍵作用的增加，從而提高了酶對底物的親和性，穩定了蛋白與底物結合的作用力。此外，熱穩定性提高的突變和活性提高的突變位于兩個獨立的區域，證實突變作用的加和性為熱穩定性和活性的同時提高提供了可能。最終作者成功將反應放大，實現了阿托伐他汀前體6-氰基-3,5-二羥基己酸叔丁酯的規模生物制備(圖4)[54]。

通過定向進化發現的熱穩定的酶也具有增加的有機溶劑穩定性，如果糖二磷酸醛縮酶[55]、枯草芽孢桿菌脂肪酶A[56]、葡萄糖脫氫酶等[57]。繪制T50與C50的關系圖發現溫度穩定性和有機溶劑穩定性之間存在較強的相關性[58]。方柏山等利用基因工程手段構建了甲酸脫氫酶超分子自組裝體系，組裝的功能片段和融合蛋白形成三維層狀結構。將其用于輔酶再生系統時表現出比未組裝結構更高的結構穩定性和NAD (H)再循環效率。利用分子動力學模擬研究超分子組裝的構型演變，發現FDH的C末端的結構在蛋白質聚合物的形成中起著重要作用[59]。另外一方面，熱容變化是解釋酶催化反應速率的溫度依賴性的重要參數，對酶動力學、熱適應性和進化等方面研究都具有重要意義。Arcus等結合計算和實驗手段對類固醇異構酶二聚體和α-葡糖苷酶分別進行熱容的計算分析，研究發現活性位點周圍loop環結構的固定、酶的能量波動的變化以及遠離活性位點的遠端區域對熱容變化都具有重要的影響。相關研究證實可以通過原子水平的分子動力學模擬預測催化反應的活化熱容變化，為理性改造酶的最適反應溫度提供可行的思路[60]。

圖4 羰基還原酶LbCR的熱穩定性和催化活性同時提高[54]

1.5 輔酶依賴性反轉

還原酶的催化需要輔酶NADPH的參與，然而額外添加昂貴的輔酶NADPH，會導致生產成本過高，限制了工業化應用。因此，基于將昂貴NADPH替換成相對廉價NADH的目的，研究者們試圖通過蛋白質工程手段改造還原酶的輔酶依賴性。

目前有多種方法被成功用于反轉還原酶的輔因子特異性，如：使用結構信息或使用不同輔酶依賴性的酶同源序列進行多序列比對，來尋找有益突變。Turner課題組基于結構和序列比對的方法，在ADH中成功構建了突變體G198D可以將輔助因子由NADP+到NAD+約1 353倍的反轉。最終利用NADH依賴型的最優突變體成功實現了將外消旋仲醇高效地轉化生成手性胺[61]。針對輔酶依賴性反轉的改造通常會導致酶的催化效率整體下降。2018年諾貝爾化學獎獲得者Arnold團隊開發了一種計算工具(CSR-SALAD) 來尋找輔酶結合關鍵位點，可用于簡化酶的輔酶NAD+或NADP+依賴性逆轉的過程，該策略同時可以設計出恢復催化活力的半理性突變庫。該方法被成功用于4種結構不同的NADP依賴性的酶(乙醛酸還原酶、肉桂醇脫氫酶、木糖還原酶和含鐵醇脫氫酶) 的輔酶特異性反轉，輔酶依賴性的反轉變化達33?4 900倍，證實了該策略的有效性[62]。

針對改變羥甾脫氫酶7-HSDHs輔酶偏好性的研究，李春秀等提出了一種輔酶特異性反轉-小巧突變庫的設計策略(CSR-SaSLiD)，理性地設計了一個包含5個突變子的小巧定點突變庫，快速地篩選到輔酶偏好性反轉且活性較高的突變體。相較于母本，突變體實現了輔酶偏好性由NADPH到NADH約953 000倍的反轉，活性提高223倍。最后，作者利用分子動力學模擬揭示了輔酶偏好性反轉及活性提高的分子機制，并將CSR-SaSLiD策略成功應用于另外兩個7-HSDHs的輔酶偏好性反轉和活性提升，表明CSR-SaSLiD是一種有效的改造策略(圖5)[63]。

2 新的研究方法

2.1 基于定量構效關系的研究

定量構效關系(QSAR) 方法被廣泛應用于藥物設計領域，目前利用QSAR研究底物結構-功能關系的方法已經逐漸延伸到生物催化領域，成為新的研究熱點。酶催化不同底物時將具有不同的催化活力，可以利用定量構效關系方法對酶催化底物譜進行分析，構建合理的酶催化活力的定量構效關系模型，揭示不同底物結構與相應催化活力的關系。

Tomic′課題組提出根據實驗數據利用3D-QSAR方法構建描述符，實現了底物專一性常數cat/m值的定量預測，并利用這一方法成功實現了來源于洋蔥伯克霍爾德菌酯酶立體選擇性的量化預測[64]。Paier課題組構建3D-QSAR模型分析的環氧化物酶催化反應的立體選擇性，分別采用了CoMFA和 CoMSIA兩種統計算法，兩種方法得到的預測結果顯示它們都具有較好的預測準確性[65]。Braiuca小組利用實驗測得的cat/m數據構建回歸模型，模型能夠準確快速地預測出青霉素酰胺酶的選擇性[66]。于洪巍課題組利用分子對接和定量構效關系相結合的方法，構建了具有較高準確性的南極假絲酵母脂肪酶B (CALB) 立體選擇性的量化預測模型，分別考慮了酰基供體以及5個因素(立體、靜電、疏水、氫鍵供體和受體) 對模型的影響，證實了酰基供體的重要性[67]。郁惠蕾等采用3D-QSAR方法構件了羰基還原酶YtbE的定量構效關系模型。通過分子力場輪廓圖考察了底物分子取代基團對活力的影響，證實靜電作用和疏水作用在分子力場中起到重要作用。進一步地利用該模型對ZINC15小分子數據庫進行虛擬篩選，最終成功地篩選到了具有催化活力的化合物，拓展了酶的底物譜[68]。

圖5 CSR-SaSLiD策略改變羥甾脫氫酶7β-HSDHs的輔酶偏好性[63]

2.2 基于氨基酸殘基網絡的研究

氨基酸殘基網絡理論將每個氨基酸定義為一個結點、殘基間的互相關系數為邊。結合網絡拓撲參數、氨基酸相互作用、底物結合能等分析，對酶分子整體結構和動態變化進行分析，可以實現酶分子結構-功能關系的解析。該方法已被成功用于疾病相關蛋白的特異性識別、蛋白質熱穩定性等方面的研究。

蒲雪梅等發現單點突變導致β2AR蛋白結構中部分螺旋、loop區及整體結構運動相關性的強弱發生變化，同時也改變了底物結合口袋和信號傳導通路的密度，特別是催化氨基酸所在的通路，進而影響藥物作用[69]。Osuna課題組對一逆醛縮酶活性位點附近和遠離活性中心的氨基酸突變所引起的構象變化進行了系統分析和評估。研究表明，酶的構象狀態在不同突變體中發生了顯著改變，一些較遠距離的氨基酸突變會顯著影響酶的催化活力[70]。利用氨基酸殘基相互作用網絡分析酯酶Est1母本和突變體結構穩定性。許建和課題組研究發現突變體中形成更多的氫鍵、范德華、π-π堆積等相互作用，氨基酸間相互作用的增加穩定了酶的結構的穩定性。基于機理分析，結合氨基酸保守性、氨基酸殘基相關性和氨基酸間相互作用，對酶的活力、選擇性、熱穩定性進行了一系列的理性設計和改造研究[71]。付偉課題組采用動態網絡分析方法解析了纖維素酶Cel12A突變體熱穩定顯著提高的結構機理，并找到與突變點具有強相關性的關鍵氨基酸殘基，提出了酶熱穩定性改造的新策略[72]。

2.3 基于機器學習的方法

機器學習技術可以用來識別所有特征變量中的關鍵特征量，并構建預測模型精確地預測目標參數。研究結果表明機器學習方法能顯著提高蛋白質工程中的篩選通量及有益突變的序列空間的質量和多樣性[73]。

Umetsu等提出將分子進化與機器學習相結合的蛋白質改造方法。利用第一輪的突變文庫構建機器學習模型來指導第二輪的突變。該方法被成功用于綠色熒光蛋白的改造[74]。Arnold課題組利用已發表的GB1結合蛋白的大量數據分析，證實基于機器學習的定性進化方法可以比其他方法發現更優的突變體。利用這一策略，作者成功地對雙加氧酶NOD催化新型卡賓Si-H插入反應生成兩種對映體產物進行改造，僅通過兩輪突變就找到了優勢突變體[75]。Tidor等提出了將機器學習與路徑采樣相結合的新策略來理性尋找影響催化性能的重要區域，并成功地用于酮酸還原異構酶KARI的研究。作者利用計算統計方法，對過渡態采樣來模擬反應的動力學，并將其與機器學習方法相結合。確定了與反應性能相關的重要特征并構建了反應軌跡的預測模型。研究發現，利用單一的描述符就可以準確地預測催化活力，準確度超過85%。除此以外，研究發現酶-底物復合物中會存在一個重要區域，當這個區域的構象增多時反應性能大幅增加。相關研究不僅證實了在酶-底物復合物的構象空間中存在能促進反應性能的區域，同時開發了用于鑒定和驗證這些特別區域的方法，這將大大提高酶分子設計改造的速率[76]。

2.4 從頭設計及人工智能的方法

從頭設計的思路是針對一些天然酶無法催化的化學反應，設計全新的蛋白質，使之具有特定的空間結構和預期的功能。從頭設計的原則是通過計算獲得具有特定空間結構中最低自由能狀態下的氨基酸序列。

美國華盛頓大學David Baker團隊開發的Rosetta算法平臺能夠從期望的功能反向推測出合適的結構，再計算出最合理的氨基酸序列。利用這一方法，Baker課題組已成功地實現從頭創制逆-醛縮酶[77]以及催化Kemp消除反應[78]和Diels-Alder反應的酶[79]。近期該課題組從頭設計了熒光蛋白β桶結構[80]、自組裝螺旋狀蛋白纖維[81]、IL2和IL15受體激動蛋白[82]、抗癌蛋白Neo-2/15[83]、pH環境變化響應蛋白[84]、通過誘導構象改變來調節功能的開關蛋白質[85]等多個復雜的功能蛋白。利用從頭設計獲得全新的蛋白質為合成生物學和細胞工程的研究提供了新穎的催化元件。

除此之外，谷歌公司DeepMind推出新的人工智能項目AlphaFold，利用經過訓練的深度神經網絡，可以從基因序列出發預測蛋白質的物理性質和三維結構[86]。基于深度學習的AlphaFold大大縮短了傳統計算機模擬計算蛋白質折疊的時間。隨著深度學習和人工智能技術的進步，這些技術未來可用于更高效的新酶發掘、更深入的蛋白質結構-功能關系分析及更快速的新藥虛擬篩選。

3 總結

越來越多的計算分析方法被用于酶的催化反應機理解析，基于酶分子的結構功能關系的深入解析，對結構中特定區域進行理性重構，可以實現高效的定向設計與改造，推動酶的工業應用。理性設計方法用計算替代部分實驗室工作，降低了實驗的成本和工作量，目的性更強，更加迅速有效。

針對計算本身具有的局限性，發展更快、更高效、更準確的計算方法是未來的技術發展趨勢。合理地應用這些計算方法，將有助于提高工業酶的開發效率，推動生物制造產業的發展。

[1] Privett HK, Kiss G, Lee TM, et al. Iterative approach to computational enzyme design. Proc Natl Acad Sci USA, 2012, 109(10): 3790–3795.

[2] Verma R, Mitchell-Koch K.studies of small molecule interactions with enzymes reveal aspects of catalytic function. Catalysts, 2017, 7(7): 212.

[3] van der Kamp MW, Mulholland AJ. Combined quantum mechanics/molecular mechanics (QM/MM) methods in computational enzymology. Biochemistry, 2013, 52(16): 2708–2728.

[4] Grajciar L, Heard CJ, Bondarenko AA, et al. Towards operando computational modeling in heterogeneous catalysis. Chem Soc Rev, 2018, 47(22): 8307–8348.

[5] Zhu CR, Gao DQ, Ding J, et al. TMD-based highly efficient electrocatalysts developed by combined computational and experimental approaches. Chem Soc Rev, 2018, 47(12): 4332–4356.

[6] Huang PS, Ban YEA, Richter F, et al. RosettaRemodel: a generalized framework for flexible backbone protein design. PLoS ONE, 2011, 6(8): e24109.

[7] Addington TA, Mertz RW, Siegel JB, et al. Janus: prediction and ranking of mutations required for functional interconversion of enzymes. J Mol Biol, 2013, 425(8): 1378–1389.

[8] Bendl J, Stourac J, Sebestova E, et al. HotSpot Wizard 2.0: automated design of site-specific mutations and smart libraries in protein engineering. Nucleic Acids Res, 2016, 44(W1): W479–W487.

[9] Malisi C, Schumann M, Toussaint NC, et al. Binding pocket optimization by computational protein design. PLoS ONE, 2012, 7(12): e52505.

[10] Chovancova E, Pavelka A, Benes P, et al. CAVER 3.0: a tool for the analysis of transport pathways in dynamic protein structures. PLoS Comput Biol, 2012, 8(10): e1002708.

[11] Durrant JD, Votapka L, S?rensen J, et al. POVME 2.0: an enhanced tool for determining pocket shape and volume characteristics. J Chem Theory Comput, 2014, 10(11): 5047–5056.

[12] Wijma HJ, Floor RJ, Bjelic S, et al. Enantioselective enzymes by computational design andscreening. Angew Chem Int Ed, 2015, 54(12): 3726–3730.

[13] Wijma HJ, Floor RJ, Jekel PA, et al. Computationally designed libraries for rapid enzyme stabilization. Protein Eng Des Sel, 2014, 27(2): 49–58.

[14] Park SB, Bae DW, Clavio NAB, et al. Structural and biochemical characterization of the curcumin-reducing activity of CurA from. J Agric Food Chem, 2018, 66(40): 10608–10616.

[15] Ren WW, Pengelly R, Farren-Dai M, et al. Revealing the mechanism for covalent inhibition of glycoside hydrolases by carbasugars at an atomic level. Nat Commun, 2018, 9(1): 3243.

[16] Fan FF, Chen NH, Wang YH, et al. QM/MM and MM MD simulations on the pyrimidine-specific nucleoside hydrolase: a comprehensive understanding of enzymatic hydrolysis of uridine. J Phys Chem B, 2018, 122(3): 1121–1131.

[17] Kulkarni YS, Liao QH, Petrovi? D, et al. Enzyme architecture: modeling the operation of a hydrophobic clamp in catalysis by triosephosphate isomerase. J Am Chem Soc, 2017, 139(30): 10514–10525.

[18] Schrepfer P, Buettner A, Goerner C, et al. Identification of amino acid networks governing catalysis in the closed complex of class I terpene synthases. Proc Natl Acad Sci USA, 2016, 113(8): E958–E967.

[19] Mhashal AR, Vardi-Kilshtain A, Kohen A, et al. The role of the Met20loop in the hydride transfer indihydrofolate reductase. J Biol Chem, 2017, 292(34): 14229–14239.

[20] Ling BP, Li H, Yan LJ, et al. Conversion mechanism of enoyl thioesters into acyl thioesters catalyzed by 2-enoyl-thioester reductases from. Phys Chem Chem Phys, 2019, 21(19): 10105–10113.

[21] Driller R, Janke S, Fuchs M, et al. Towards a comprehensive understanding of the structural dynamics of a bacterial diterpene synthase during catalysis. Nat Commun, 2018, 9: 3971.

[22] Karuppiah V, Ranaghan KE, Leferink NGH, et al. Structural basis of catalysis in the bacterial monoterpene synthases linalool synthase and 1,8-Cineole synthase. ACS Catal, 2017, 7(9): 6268–6282.

[23] Haatveit KC, Garcia-Borràs M, Houk KN. Computational protocol to understand P450 mechanisms and design of efficient and selective biocatalysts. Front Chem, 2019, 6: 663.

[24] Faponle AS, Quesne MG, De Visser SP. Origin of the regioselective fatty-acid hydroxylation versus decarboxylation by a cytochrome P450 peroxygenase: what drives the reaction to biofuel production? Chemistry, 2016, 22(16): 5478–5483.

[25] Zhou HY, Wang BJ, Wang F, et al. Chemo-and regioselective dihydroxylation of benzene to hydroquinone enabled by engineered cytochrome P450 monooxygenase. Angew Chem Int Ed, 2019, 58(3): 764–768.

[26] ?widerek K, Tu?ón I, Williams IH, et al. Insights on the origin of catalysis on glycine-methyltransferase from computational modeling. J Am Chem Soc, 2018, 140(12): 4327–4334.

[27] Marques SM, Dunajova Z, Prokop Z, et al. Catalytic cycle of haloalkane dehalogenases toward unnatural substrates explored by computational modeling. J Chem Inf Model, 2017, 57(8): 1970–1989.

[28] Wang BJ, Cao ZX, Rovira C, et al. Fenton-derived OH radicals enable the MPnS enzyme to convert 2-hydroxyethylphosphonate to methylphosphonate: insights fromQM/MM MD simulations. J Am Chem Soc, 2019, 141(23): 9284–9291.

[29] Sheng X, Plasch K, Payer SE, et al. Reaction mechanism and substrate specificity of-orotate decarboxylase: a combined theoretical and experimental study. Front Chem, 2018, 6: 608.

[30] Behiry EM, Ruiz-Pernia JJ, Luk L, et al. Isotope substitution of promiscuous alcohol dehydrogenase reveals the origin of substrate preference in the transition state. Angew Chem Int Ed, 2018, 57(12): 3128–3131.

[31] Liu J, Wu SK, Li Z. Recent advances in enzymatic oxidation of alcohols. Curr Opin Chem Biol, 2018, 43: 77–86.

[32] Kong XD, Yuan SG, Li L, et al. Engineering of an epoxide hydrolase for efficient bioresolution of bulky pharmaco substrates. Proc Natl Acad Sci USA, 2014, 111(44): 15717–15722.

[33] Herter S, Medina F, Wagschal S, et al. Mapping the substrate scope of monoamine oxidase (MAO-N) as a synthetic tool for the enantioselective synthesis of chiral amines. Bioorg Med Chem, 2018, 26(7): 1338–1346.

[34] Li GY, Yao PY, Gong R, et al. Simultaneous engineering of an enzyme’s entrance tunnel and active site: the case of monoamine oxidase MAO-N. Chem Sci, 2017, 8(5): 4093–4099.

[35] Collazo L, Klinman JP. Control of the position of oxygen delivery in soybean lipoxygenase-1 by amino acid side chains within a gas migration channel. J Biol Chem, 2016, 291(17): 9052–9059.

[36] Han SW, Kim J, Cho HS, et al. Active site engineering of ω-transaminase guided by docking orientation analysis and virtual activity screening. ACS Catal, 2017, 7(6): 3752–3762.

[37] Mader SL, Br?uer A, Groll M, et al. Catalytic mechanism and molecular engineering of quinolone biosynthesis in dioxygenase AsqJ. Nat Commun, 2018, 9(1): 1168.

[38] Dijkman WP, Binda C, Fraaije MW, et al. Structure- based enzyme tailoring of 5-hydroxymethylfurfural oxidase. ACS Catal, 2015, 5(3): 1833–1839.

[39] Ferrari AR, Lee M, Fraaije MW. Expanding the substrate scope of chitooligosaccharide oxidase fromby structure-inspired mutagenesis. Biotechnol Bioeng, 2015, 112(6): 1074–1080.

[40] Zheng GW, Liu YY, Chen Q, et al. Preparation of structurally diverse chiral alcohols by engineering ketoreductase CgKR1. ACS Catal, 2017, 7(10): 7174–7181.

[41] Chen Q, Luan ZJ, Cheng XL, et al. Molecular dynamics investigation of the substrate binding mechanism in carboxylesterase. Biochemistry, 2015, 54(9): 1841–1848.

[42] Chen FF, Zheng GW, Liu L, et al. Reshaping the active pocket of amine dehydrogenases for asymmetric synthesis of bulky aliphatic amines. ACS Catal, 2018, 8(3): 2622–2628.

[43] Maria-Solano MA, Serrano-Hervás E, Romero-Rivera A, et al. Role of conformational dynamics in the evolution of novel enzyme function. Chem Commun (Camb), 2018, 54(50): 6622–6634.

[44] Romero-Rivera A, Garcia-Borràs M, Osuna S. Computational tools for the evaluation of laboratory-engineered biocatalysts. Chem Commun (Camb), 2016, 53(2): 284–297.

[45] Wijma HJ, Marrink SJ, Janssen DB. Computationally efficient and accurate enantioselectivity modeling by clusters of molecular dynamics simulations. J Chem Inf Model, 2014, 54(7): 2079–2092.

[46] Maria-Solano MA, Romero-Rivera A, Osuna S. Exploring the reversal of enantioselectivity on a zinc-dependent alcohol dehydrogenase. Org Biomol Chem, 2017, 15(19): 4122–4129.

[47] Serapian SA, van der Kamp MW. Unpicking the cause of stereoselectivity in actinorhodin ketoreductase variants with atomistic simulations. ACS Catal, 2019, 9(3): 2381–2394.

[48] Sun ZT, Salas PT, Siirola E, et al. Exploring productive sequence space in directed evolution using binary patterning versus conventional mutagenesis strategies. Bioresour Bioprocess, 2016, 3: 44.

[49] Sun ZT, Wu L, Bocola M, et al. Structural and computational insight into the catalytic mechanism of limonene epoxide hydrolase mutants in stereoselective transformations. J Am Chem Soc, 2018, 140(1): 310–318.

[50] Yang B, Wang HJ, Song W, et al. Engineering of the conformational dynamics of lipase to increase enantioselectivity. ACS Catal, 2017, 7(11): 7593–7599.

[51] Li FL, Kong XD, Chen Q, et al. Regioselectivity engineering of epoxide hydrolase: near-perfect enantioconvergence through a single site mutation. ACS Catal, 2018, 8(9): 8314–8317.

[52] Reetz MT, Soni P, Acevedo JP, et al. Creation of an amino acid network of structurally coupled residues in the directed evolution of a thermostable enzyme. Angew Chem Int Ed Engl, 2009, 48(44): 8268–8272.

[53] Blum JK, Ricketts MD, Bommarius AS. Improved thermostability of AEH by combining B-FIT analysis and structure-guided consensus method. J Biotechnol, 2012, 160(3/4): 214–221.

[54] Gong XM, Qin Z, Li FL, et al. Development of an engineered ketoreductase with simultaneously improved thermostability and activity for making a bulky Atorvastatin precursor. ACS Catal, 2019, 9(1): 147–153.

[55] Hao JJ, Berry A. A thermostable variant of fructose bisphosphate aldolase constructed by directed evolution also shows increased stability in organic solvents. Protein Eng Des Sel, 2004, 17(9): 689–697.

[56] Reetz MT, Soni P, Fernández L, et al. Increasing the stability of an enzyme toward hostile organic solvents by directed evolution based on iterative saturation mutagenesis using the B-FIT method. Chem Commun, 2010, 46(45): 8657–8658.

[57] Vazquez-Figueroa E, Yeh V, Broering JM, et al. Thermostable variants constructed via the structure-guided consensus method also show increased stability in salts solutions and homogeneous aqueous-organic media. Protein Eng Des Sel, 2008, 21(11): 673–680.

[58] Bommarius AS. Biocatalysis: a status report. Annu Rev Chem Biomol Eng, 2015, 6: 319–345.

[59] Jiang W, Yang RN, Lin P, et al. Bioinspired genetic engineering of supramolecular assembled formate dehydrogenase with enhanced biocatalysis activities. J Biotechnol, 2019, 292: 50–56.

[60] van der Kamp MW, Prentice EJ, Kraakman KL, et al. Dynamical origins of heat capacity changes in enzyme-catalysed reactions. Nat Commun, 2018, 9: 1177.

[61] Thompson MP, Turner NJ. Two-enzyme hydrogen-borrowing amination of alcohols enabled by a cofactor-switched alcohol dehydrogenase. ChemCatChem, 2017, 9(20): 3833–3836.

[62] Cahn JKB, Werlang CA, Baumschlager A, et al. A general tool for engineering the NAD/NADP cofactor preference of oxidoreductases. ACS Synth Biol, 2017, 6(2): 326–333.

[63] You ZN, Chen Q, Shi SC, et al. Switching cofactor dependence of 7-Hydroxysteroid dehydrogenase for cost-effective production of ursodeoxycholic acid. ACS Catal, 2019, 9(1): 466–473.

[64] Tomi? S, Koji?-Prodi? BA. Quantitative model for predicting enzyme enantioselectivity: application tolipase and 3-(aryloxy)-1, 2-propanediol derivatives. J Mol Graph Model, 2001, 21(3): 241–252.

[65] Paier J, Stockner T, Steinreiber A, et al. Enantioselectivity of epoxide hydrolase catalysed oxirane ring opening: a 3D QSAR study. J Comput Aided Mol Des, 2003, 17(1): 1–11.

[66] Braiuca P, Boscarol L, Ebert C, et al. 3D-QSAR applied to the quantitative prediction of penicillin G amidase selectivity. Adv Synth Catal, 2006, 348(6): 773–780.

[67] Gu JL, Liu J, Yu HW. Quantitative prediction of enantioselectivity oflipase B by combining docking simulations and quantitative structure-activity relationship (QSAR) analysis. J Mol Catal B: Enzym, 2011, 72(3/4): 238–247.

[68] Cheng Q, Chen Q, Xu JH, et al. A 3D-QSAR assisted activity prediction strategy for expanding substrate spectra of an aldehyde ketone reductase. Mol Catalys, 2018, 455: 224–232.

[69] Gao N, Liang T, Yuan Y, et al. Exploring the mechanism of F282L mutation-caused constitutive activity of GPCR by a computational study. Phys Chem Chem Phys, 2016, 18(42): 29412–29422.

[70] Romero-Rivera A, Garcia-Borràs M, Osuna S. Role of conformational dynamics in the evolution of retro-aldolase activity. ACS Catal, 2017, 7(12): 8524–8532.

[71] Chen Q, Yu HL, Cheng XL, et al. Structural investigation of the enantioselectivity and thermostability mechanisms of esteraseEst1. J Mol Graph Model, 2018, 85: 182–189.

[72] Lian P, Yuan CM, Xu Q, et al. Thermostability mechanism for the hyperthermophilicity of extremophile cellulaseCel12A: Implied from molecular dynamics simulation. J Phys Chem B, 2016, 120(30): 7346–7352.

[73] Yang KK, Wu Z, Arnold FH. Machine-learning-guided directed evolution for protein engineering. Nat Methods, 2019, 16(8): 687–694.

[74] Saito Y, Oikawa M, Nakazawa H, et al. Machine-learning-guided mutagenesis for directed evolution of fluorescent proteins. ACS Synth Biol, 2018, 7(9): 2014–2022.

[75] Wu Z, Kan SBJ, Lewis RD, et al. Machine learning-assisted directed protein evolution with combinatorial libraries. Proc Natl Acad Sci USA, 2019, 116(18): 8852–8858.

[76] Bonk BM, Weis JW, Tidor B. Machine learning identifies chemical characteristics that promote enzyme catalysis. J Am Chem Soc, 2019, 141(9): 4108–4118.

[77] Jiang L, Althoff EA, Clemente FR, et al. De novo computational design of retro-aldol enzymes. Science, 2008, 319(5868): 1387–1391.

[78] R?thlisberger D, Khersonsky O, Wollacott AM, et al. Kemp elimination catalysts by computational enzyme design. Nature, 2008, 453(7192): 190–195.

[79] Siegel JB, Zanghellini A, Lovick HM, et al. Computational design of an enzyme catalyst for a stereo selective bimolecular Diels-Alder reaction. Science, 2010, 329(5989): 309–313.

[80] Lu PL, Min DY, DiMaio F et al. Accurate computational design of multipass transmembrane proteins. Science, 2018, 359(6379): 1042–1046.

[81] Dou JY, Vorobieva AA, Sheffler W, et al.design of a fluorescence-activating β-barrel. Nature, 2018, 561(7724): 485–491.

[82] Shen H, Fallas JA, Lynch E, et al.design of self-assembling helical protein filaments. Science, 2018, 362(6415): 705–709.

[83] Silva DA, Yu S, Ulge UY, et al.design of potent and selective mimics of IL-2 and IL-15. Nature, 2019, 565(7738): 186–191.

[84] Boyken SE, Benhaim MA, Busch F, et al.design of tunable, pH-driven conformational changes. Science, 2019, 364(6441): 658–664.

[85] Langan RA, Boyken SE, Ng AH, et al.design of bioactive protein switches. Nature, 2019, 572(7768): 205–210.

[86] Evans R, Jumper J, Kirkpatrick J, et al.structure prediction with deep-learning based scoring//Thirteenth Critical Assessment of Techniques for Protein Structure Prediction (Abstracts). Iberostar, Paraiso, 2018.

Computational analysis of structure-activity relationship of industrial enzymes

Qi Chen, Chunxiu Li, Gaowei Zheng, Huilei Yu, and Jianhe Xu

School of Biotechnology, East China University of Science and Technology, Shanghai 200237, China

Industrial enzymes have become the core "chip" for bio-manufacturing technology. Design and development of novel and efficient enzymes is the key to the development of industrial biotechnology. The scientific basis for the innovative design of industrial catalysts is an in-depth analysis of the structure-activity relationship between enzymes and substrates, as well as their regulatory mechanisms. With the development of bioinformatics and computational technology, the catalytic mechanism of the enzyme can be solved by various calculation methods. Subsequently, the specific regions of the structure can be rationally reconstructed to improve the catalytic performance, which will further promote the industrial application of the target enzyme. Computational simulation and rational design based on the analysis of the structure-activity relationship have become the crucial technology for the preparation of high-efficiency industrial enzymes.This review provides a brief introduction and discussion on various calculation methods and design strategies as well as future trends.

industrial protein, enzyme, structure-activity relationship, molecular simulation, rational design

10.13345/j.cjb.190329

許建和 教授、博士生導師，華東理工大學長江學者特聘教授。2006–2017年擔任生物反應器工程國家重點實驗室主任，現任上海生物制造產業技術協同創新中心主任。長期從事生物催化、酶工程及合成生物技術研究。在、、、、等期刊發表SCI論文300余篇。授權中國發明專利50項、美國發明專利1項。國際期刊主編。榮獲全國優秀教師、談家楨生命科學創新獎、杜邦杰能科中國酶工程杰出貢獻獎、2018年上海市技術發明一等獎 (第一完成人)。

陳琦, 李春秀, 鄭高偉, 等. 工業蛋白質構效關系的計算生物學解析. 生物工程學報, 2019, 35(10): 1829–1842.

ChenQ, Li CX, Zheng GW, et al. Computational analysis of structure-activity relationship of industrial enzymes. Chin J Biotech, 2019, 35(10): 1829–1842.

July 23, 2019;

September 16, 2019

Supported by: Natural Science Foundation of Shanghai China (No. 19ZR1472900), National Natural Science Foundation of China (Nos. 31971380, 21536004, 21672063, 21776085).

Jianhe Xu.Tel/Fax: +86-21-54250840; E-mail: jianhexu@ecust.edu.cn

上海市自然科學基金 (No. 19ZR1472900)，國家自然科學基金 (Nos. 31971380, 21536004, 21672063, 21776085) 資助。

(本文責編 陳宏宇)