工業酶結構與功能的構效關系

張錕，曲戈，劉衛東，孫周通

工業酶結構與功能的構效關系

張錕*，曲戈*，劉衛東，孫周通

中國科學院天津工業生物技術研究所，天津 300308

工業酶是綠色生物制造的“芯片”，支撐著下游數十倍甚至百倍的產業。解析工業酶結構與功能關系是對其設計改造并應用于工業生產的基礎。近年來隨著蛋白結構解析技術和計算模擬技術的發展，酶結構與功能的構效關系得到更加深刻的認識，使得酶理性設計，甚至是從頭設計成為可能。文中圍繞酶結構的可塑性及其催化功能的多樣性，綜述工業酶結構與功能構效關系的研究進展及應用，并展望該領域的未來發展前景。

工業酶，結構與功能，結構可塑性，生物催化

作為生物催化劑，酶催化具有反應條件溫和、專一性高及環境友好等優勢。天然酶已形成無數錯綜復雜的結構，來行使類型多樣的催化反應[1]。酶的結構決定其功能，對絕大多數酶來說，其催化功能 (如底物特異性、催化效率) 通常依賴于酶催化口袋中的一小部分氨基酸殘基[2]，但其他特性如熱穩定性等可能涉及遠端氨基酸殘基[3]。隨著越來越多的晶體結構得到解析，以及通過隨機突變、(半)理性設計[4]等定向進化技術獲得大量的催化特性優化的工業酶[5]，人們可以更好地理解酶結構與功能之間的關系。近年來基于晶體結構解析與計算分析，科學家們可以更加深入地了解酶的催化機制及對應的結構特征，為促進其工業應用奠定了基礎。基于該領域的最新進展，本文首先著重介紹酶結構的可塑性及相應催化特性的多樣性，之后介紹酶結構對催化特性的影響和構效關系研究方法，最后探討展望該領域的發展前景。

1 酶結構的可塑性

酶能夠在溫和條件下催化特異化學反應，能否與底物選擇性結合是酶執行催化功能的主要決定因素。酶結構的特定空間排列，是形成酶-底物過渡態復合物的前提條件。氨基酸彼此之間通過酰胺鍵連接在一起形成多肽鏈骨架，并卷曲折疊成有規則的二級結構，包括α-螺旋、β-折疊、β-轉角及無規卷曲等。多個二級結構借助非共價力，如疏水相互作用、氫鍵、離子鍵和范德華力，進一步折疊組裝形成有功能的三級結構(圖1)。由于非共價鍵相對較弱，三級結構容易受到外界環境的影響(如溫度、pH、底物誘導等) 發生構象變化，因此酶結構具有可塑性，進而影響其催化功能和分子特性。

圖1 蛋白質結構組裝：從左到右分別為一級序列、二級結構和三維結構

1.1 酶骨架可塑性

酶骨架的構象不是剛性、靜止的，而是柔性、動態的。酶與底物分子相互作用時酶構象有時發生輕微改變，有時則發生劇烈變構，酶骨架的可塑性保障了功能的有效實施。以羧酸還原酶為例，它能催化羧酸到醛的還原反應，來源于賽格尼氏桿菌的羧酸還原酶SrCAR的晶體結構表明，腺苷化結構域和硫酯化結構域存在大尺度的變構效應，以實現利用同一個催化口袋先后催化腺苷化及硫酯化反應[6-7]。曲戈等的進一步研究表明，SrCAR的K629和K528分別在腺苷化和硫酯化階段扮演著重要角色：在腺苷化階段，K629位于腺苷化結構域催化口袋中心；而硫酯化階段發生了變構，K629移出催化口袋，K528取而代之并負責催化硫酯化反應 (圖2A)。將這兩個位點突變為丙氨酸后，突變體K629A和K528A均喪失了對模式底物的催化能力[8]。此外，結構域或拓撲結構發生大尺度變構在酶催化功能演變中發揮重要作用[9]。例如鹵代鏈烷酸脫鹵素酶 (Haloalkanoicaciddehalogenase，HAD) 超家族根據功能不同分為磷酸酯酶、ATP酶、脫鹵素酶和糖磷酸酶，其不同成員之間Cap結構域 (Cap domain) 的差異造成了功能和底物的特異性(圖2B)[10]。

圖2 酶骨架可塑性對其催化功能的影響.(A)SrCAR從腺苷化階段變構到硫酯化階段. 虛線箭頭表示腺苷結構域(A domain)與硫酯結構域(T domain) 的變構方向，源自文獻[8]. (B) 經典HAD結構域示意圖：黃色，含有催化殘基Asp的鏈；藍色，在所有HAD超家族成員中保守的核心鏈；灰色，在祖先酶結構中可能沒有發生的結構元素；綠線，C1 Cap域的插入點；橙色線，C2 Cap域插入點。虛線，表示不完全存在于HAD超家族所有成員中的二級結構元素。源自文獻[10]. (C) TmCel12A E134C突變體和底物纖維二糖的晶體結構，其A鏈與其他已知的GH12-家族酶疊加，紅色顯示，表明TmCel12A具有獨特loop (A3-B3)源自文獻[11].

酶骨架的可塑性同時賦予了催化功能的混雜性(Promiscuity)。來自南極假絲酵母的脂肪酶B (lipase B, CALB) 同時具有甘油三酯水解和催化Aza-Michael加成反應功能[12]。同時，骨架可塑性也會影響酶的熱穩定性，通過對來源于海棲熱袍菌的纖維素酶TmCel12A與同家族其他糖苷水解酶的晶體結構比較可以發現，該酶含有兩個較長且高度扭轉的β-鏈B8和B9，以及特有的環結構A3-B3 (圖2C)。該環包含R60和Y61，這兩個氨基酸通過氫鍵和堆疊作用力穩定底物，這些結構特征影響了該酶的高熱穩定性[13]。

1.2 酶催化口袋的可塑性

相對于整個蛋白骨架，酶催化口袋大多包含loop結構，因此口袋的可塑性更強，方便我們利用 (半) 理性設計技術，通過重塑催化口袋來調控酶的催化功能。

檸檬烯環氧水解酶LEH可不對稱催化1,2-環氧己烷合成手性1,2-環己二醇。野生型 (Wild type, WT) LEH的立體選擇性較差，傾向于 (,) 選擇性。孫周通等經定向進化重塑酶催化口袋，獲得的立體選擇性提高及反轉的最優突變體SZ348和SZ529，值分別達到99% (,) 和97% (,)；晶體結構解析顯示WT和兩個突變體之間的整體結構差異非常小，但突變體SZ529和SZ348相對于WT的催化口袋構型發生了明顯變化，尤其是手性反轉的口袋構型變化比較明顯(圖3A)[14-15]，并通過計算解析闡明了催化口袋的形狀變化對其底物特異性和立體選擇性的控制機制，并為LEH及相關工業用酶針對特異底物和不對稱催化的定向設計改造提供了重要的理論基礎[16]。

酶催化口袋氨基酸殘基變構可影響催化活性。以嗜熱厭氧菌來源的醇脫氫酶TbSADH為例，基于其晶體結構，分別在30 ℃和60 ℃下對該酶進行分子動力學 (Molecular dynamics, MD) 模擬，結果表明催化口袋內的A85、I86、L294及C295位點的運動自由度較差[17]。經虛擬突變分析，鎖定85及86位點為重點改造對象，通過在這兩個位點引入合適突變，最優突變體 (A85G/I86L) 相應loop區域柔性增強，相較WT，突變體催化口袋明顯變大(圖3B)，進而實現了非天然前手性酮 (如重要醫藥中間體 (4-氯苯基) 吡啶-2-甲酮) 的不對稱還原[17-18]。

圖3 酶催化口袋的可塑性. (A)重塑LEH突變體催化口袋，源自文獻[15].(B) TbSADH WT (灰色)和突變體T15 (青色) 催化小口袋的快照，源自文獻[17].

另外，酶催化口袋loop區域的可塑性影響酶催化功能的混雜性。里氏木霉可分泌纖維二糖水解酶TrCel7A和內切葡聚糖酶TrCel7B，盡管這兩個酶具有大約50%的氨基酸序列一致性且三維結構高度相似，然而兩者功能相差很大，主要由覆蓋其底物結合區域的loop環結構不同所造成[19]。

2 酶結構對其催化特性的影響

2.1 酶結構對穩定性的影響

酶的穩定性包括熱穩定性、抗氧化穩定性、pH穩定性和非水相溶劑耐受性等[20]。其中，二硫鍵、離子相互作用、氫鍵網絡、極性相互作用等對酶的穩定性有重要影響 (圖4)。

二硫鍵對酶的穩定性具有重要影響。來源于瘤胃厭氧真菌新美絲桿菌GH11家族的木聚糖酶，其整體結構為典型的GH11 β-jelly-roll折疊。催化區域N端的11個氨基酸為該酶特有結構，此片段通過氫鍵、芳香環堆疊作用及一個二硫鍵 (C4/C172) 固定在催化口袋。截短實驗證明這11個氨基酸的存在與該酶的活性及熱穩定性直接相關，并且C4和C172位點之間的二硫鍵是維持此片段結構的關鍵因素 (圖4A)[21]。

離子相互作用對酶結構穩定性也有重要作用。枯草芽孢桿菌酯酶esterase突變體BSE V4在30 ℃的半衰期較WT提高了5.6倍，同源建模和分子對接發現，突變體相較于WT形成了新的氫鍵和離子鍵(紅色虛線，圖4B)，有利于提高突變體的熱穩定性[22]。酶結構中的氫鍵網絡是維持結構穩定的重要因素。芽孢桿菌脂肪酶lipase R153H突變體的熱穩定性較WT提高了72倍，結構分析表明H153和R106形成了額外氫鍵 (圖4C)[23]。來源于長野芽孢桿菌的普魯蘭酶，在其穩定性改造實驗中，突變體D787C能夠在pH 4.0下保持90%活性。進一步分析發現D787C的氫鍵網絡相對于WT發生了重組，導致相近的α-螺旋和loop區變構，影響底物分子與酶催化口袋的相互作用。同時D787C所在的loop區變得更加剛性，增加了突變體在酸性條件下的穩定性[25]。

圖4 酶結構對其穩定性的影響. (A)源于Neocallimastix patriciarum GH11家族的木聚糖酶及底物的復合體晶體結構，兩個二硫鍵分別用DS1, DS2表示，源自文獻[21]. (B)BSE V4突變體模型及突變位點形成的氫鍵和離子鍵，源自文獻[22]. (C) 突變體R153H中形成的額外氫鍵，His153/O (粉紅色)與Arg106/NE和Arg106/NH 2 (青色)，源自文獻[23]. (D) 枯草芽孢桿菌脂肪酶A晶體結構展示。催化活性位點S77用綠色表示，其他氨基酸殘基用從疏水 (橙色)到親水 (藍色)著色，源自文獻[24].

酶特定位點氨基酸殘基的極性/非極性對其在非水相溶劑中的穩定性具有重要調節作用。基于分子動力學模擬枯草芽孢桿菌脂肪酶A (lipase A) 離子液體耐受性機制研究，發現在底物結合口袋處引入帶正電荷的氨基酸有利于提高其對15 vol%[Bmim] [TfO]離子液體的抗性，可能原因是帶正電的氨基酸阻礙了[Bmin]+離子在催化口袋的聚集。同時，將該酶蛋白表面的氨基酸突變為極性氨基酸可更好地穩定表面水分子網絡，進而提高其離子液體耐受性 (圖4D)[24]。

酶結構剛柔性對其活力和穩定性具有重要影響。B因子 (又稱為Debye-Waller因子，溫度因子或原子位移參數) 是描述由熱運動引起的X射線散射或相關中子散射的衰減的參數，能提供蛋白質分子局部的運動信息，反映蛋白質分子由于熱振動和構象變化而引起的振動程度，可用于鑒定原子、側鏈甚至整個區域的柔性[26]。借助B因子可研究生物大分子的內部運動和熱力學穩定性，近期研究表明，降低酶結構柔性，有利于提高其穩定性[27]；而增加催化口袋柔性可在一定程度上提高酶活 性[28]。近年來基于B因子開發的B-FIT定向進化策略，成功應用于熱穩定性等酶性能改造[29]。

2.2 酶結構對催化選擇性的影響

酶的立體/區域/化學選擇性是其相較于化學催化劑的突出優勢之一，酶的催化選擇性受酶的結構，尤其是其催化口袋幾何構象影響。

酶催化口袋的柔性對其立體選擇性具有重要的調節作用。來源于克非爾乳桿菌的短鏈醇脫氫酶A94F和Y190F突變體，通過誘導催化口袋的構象變化，擴大結合口袋，促進在該區域容納較大的硫原子并增強其催化3-硫代環戊酮還原的選擇性 (圖5A)[30]。

酶催化口袋氨基酸的位阻效應是決定其催化口袋形狀的重要因素，同樣可影響催化選擇性。通過引入小體積氨基酸，可以降低來源于谷氨酸棒桿菌蘇氨酸脫氨酶 (threonine deaminase，CgTD) 底物進入通道入口處氨基酸的位阻效應[31]。并且其突變體F114A/R229T催化3-苯基-L-絲氨酸脫氨活力相較于WT提高了18倍(圖5B)。與之相反，通過引入大位阻氨基酸，理性設計CALB的醇基結合口袋的A281和A282位點，能縮小CALB的醇基結合口袋體積，使得雙醇底物能夠進入，但不接受單酯底物，達到選擇性合成單酯的目的[32]。

酶催化的選擇性也受其底物進入通道的影響，底物進入通道的形狀往往決定其催化選擇性[33]。例如，人胰脂肪酶的底物結合口袋在酶表面較淺的凹陷處，僅可容納鏈長約8個碳原子的脂肪酸[34]；而褶皺假絲酵母脂肪酶的底物結合口袋是22 ?長的隧道，能容納鏈長達17個碳原子的脂肪酸 (圖5C)[35]，這些延伸結合位點的大小差異與底物特異性有關，特別是與它們水解的脂肪酸鏈長相關。

酶催化口袋的氨基酸殘基與底物之間的相互作用也是影響催化選擇性的重要因素。通過拉伸分子動力學模擬計算解析腈水合酶立體選擇性，結果表明 ()-甘露腈必須打破和βHis37殘基之間的氫鍵才能進入腈水合酶的催化口袋，提高腈水合酶的 ()-選擇性[36]。通過分子動力學模擬TbSADH突變體I86A結構與功能的關系，發現該位點突變后，酶催化口袋的形狀發生明顯變化，底物與口袋非共價鍵相互作用增強 (綠色膜狀，圖5D)，從而反轉了TbSADH的立體選擇性[37]。

圖5 酶結構對催化選擇性的影響. (A)構象動力學解析醇脫氫酶催化3-硫代環戊酮還原的立體選擇性，源自文獻[30]. (B)CgTD WT和F114A/R229T突變體的底物進入通道，源自文獻[31]. (C) 人胰脂肪酶的底物結合口袋，源自文獻[3]. (D)底物與突變體TbSADH I86A結合口袋非共價鍵相互作用 (綠色膜狀)，源自文獻[37].

2.3 酶結構對催化活力的影響

酶的催化活性由其三維結構決定。來源于瘤胃厭氧真菌新美絲桿菌GH11家族的木聚糖酶具有高活性，有較好工業應用潛力。基于晶體結構解析，對該酶催化口袋關鍵位點進行突變，篩選獲得雙突變體W125F/F163W，其活力比WT提高了20%；此外，該酶在畢赤酵母系統中表達會比大腸桿菌中表達表現出更高的耐熱性和活性，研究發現N端的糖基化是造成這一差異的主要原因[38]。

酶結構同樣決定底物專一性。來自海棲熱袍菌的超嗜熱內切葡聚糖酶Cel5A，能催化以葡萄糖和甘露糖為主鏈的不同底物的多糖水解，被應用于木質纖維素生物燃料的合成。為研究該酶多重底物專一性，對其進行晶體結構解析，發現了Cel5A催化β-葡萄糖苷和β-甘露糖苷的高度保守的氨基酸殘基E253和E136，同時還發現了一個特殊的開放式活性區，該區域可容納具有支鏈的多糖底物，在這個開放活性區域中，底物葡萄糖或甘露糖的第2個碳上的氫氧基團不和活性區周圍的氨基酸產生空間位阻，因而使其對不同的底物均具有較好活力[39]。表1總結了近年來通過酶結構改造優化其催化性能的部分報道。

表1 酶結構改造優化催化性能部分實例

此外，酶結構改造還能夠使其具有天然酶所不具備的催化功能 (表2)。例如，定向進化來源于巨大芽孢桿菌的P450-BM3使其具有羥化苯酚生成對羥基苯酚活力，且產物區域選擇性>93%[60]；γ-內酰胺酶Sspg可定向進化為對苯基縮水甘油酸底物具有高立體選擇性的酯酶 (E值>300)[61]。

表2 酶結構改造賦予新功能部分實例

3 酶結構與功能關系研究方法

3.1 結構解析方法

常用的研究蛋白結構方法有X射線晶體衍射 (X-ray crystallography)、核磁共振 (Nuclear magnetic resonance，NMR) 以及冷凍電鏡 (Cyro-electron microscope，Cyro-EM) 3種[66]。X-射線晶體衍射技術通過研究蛋白質晶體的衍射圖譜，獲得相應的結構信息，是目前最常用的解析蛋白結構的技術手段。截止2019年5月，蛋白質結構數據庫PDB (Protein data bank) 共收錄了152 151個生物大分子晶體結構，其中有13.5萬個結構是通過X-射線衍射獲得，1.2萬個結構通過核磁共振獲得，另外0.3萬個結構則由冷凍電鏡技術獲得，這些海量晶體結構數據為研究酶的構效關系提供了很好的研究基礎。

3.2 構效關系的計算分析方法

保守性分析是研究蛋白質構效關系的有效方法。超蛋白家族中同源蛋白的比較分析能夠為酶結構與功能關系研究提供有價值信息。Mustguseal網絡服務器可根據公共數據庫中結構與序列的可用信息，自動構建功能多樣性酶家族的大量晶體結構[67]。通過結構比對分析，可分析進化上的遠親、保守性氨基酸殘基、亞家族特異性氨基酸殘基及共同進化的氨基酸殘基。以磷脂酶A2超蛋白家族為例，通過保守分析和氨基酸共進化網絡分析鑒定其重要氨基酸殘基，揭示了14個高度保守的位點和3組共進化的氨基酸殘基[68]。

分子動力學模擬是一種經典動力學模擬分子運動的方法，是研究構效關系的有利工具。它的最大優勢在于能揭示酶數據庫中存儲的靜態結構之外的信息，還可通過提供分子動態相互作用直接指導酶設計。借助于近似攻擊 (Near attach conformation, NAC) 理論，MD還可對突變體文庫進行虛擬篩選，通過評估NAC構象的出現頻率，對設計的突變體進行排名、選擇、識別和評估[69]。

此外，量子力學(Quantum mechanics，QM) 及量子力學/分子力學 (QM/MM) 組合方法通過計算分子鍵能、幾何構型、標準生成焓、偶極矩及電荷分布等性質，對酶的催化機制和反應過程進行計算解析，也是研究酶構效關系的主要應用方法[70-71]。

4 總結與展望

在自然界中經過數億年進化，酶分子形成了復雜的結構以行使功能。1965年，David Phillips首次解析了溶菌酶的晶體結構[72]，使科學家們能夠從結構的角度去理解酶的功能。1977年，McCammon首次將分子動力學模擬應用于生物大分子[73]，為酶結構內部運動對功能的影響研究提供信息。隨后，通過Frances H. Arnold、Manfred T. Reetz等定向進化領域先驅開發的一系列酶設計改造技術[74-79]，獲得了大量催化功能和特性優化的突變酶，為酶結構與功能關系研究提供了素材。近年來，依賴計算模擬技術的進步，以David Baker為代表的科學家們開始從頭設計蛋白質并賦予其新功能，已經取得了卓有成效的進展[80-81]。此外，基于酶的晶體結構解析，在計算機模擬技術協助下，開發高效進化策略，例如FRISM (Focused rational iterative site-specific mutagenesis) 技術[82]和機器學習[83-84]等，都是探究酶構效關系及設計改造的有利工具。

可以預見，隨著人們對酶結構與功能關系認識的不斷深入，設計滿足工業生產需求的工具酶將變得更為普遍(關于工業酶設計改造方面的相關進展，筆者已在他文進行過評述[85-87])。同時當今人工智能技術正蓬勃發展，如何把握這一歷史發展機遇，促使酶構效關系研究更加智能化、精準化，是未來本領域的一個重要研究方向。

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Structure-function relationships of industrial enzymes

Kun Zhang*, Ge Qu*, Weidong Liu, and Zhoutong Sun

,,300308,

Industrial enzymes are the “chip” of modern bio-industries, supporting tens- and hundreds-fold of downstream industries development. Elucidating the relationships between enzyme structures and functions is fundamental for industrial applications. Recently, with the advanced developments of protein crystallization and computational simulation technologies, the structure-function relationships have been extensively studied, making the rational design anddesign become possible. This paper reviews the progress of structure-function relationships of industrial enzymes and applications, and address future developments.

industrial enzymes, structure-function, structural flexibility, biocatalysis

10.13345/j.cjb.190222

劉衛東 博士，中國科學院天津工業生物技術研究所副研究員，主要從事酶類催化劑的機理研究及性能改造工作。利用X射線晶體學手段，對有潛在應用價值的酶類催化劑進行催化機制研究；在此基礎上，通過理性、半理性設計以改進酶的效能，如拓展底物譜、提高酶活、耐溫性能等，以增強工業應用潛能。在、等SCI期刊上發表研究論文20余篇。

張錕, 曲戈, 劉衛東, 等. 工業酶結構與功能的構效關系. 生物工程學報, 2019, 35(10): 1806–1818.

Zhang K, Qu G, Liu WD, et al. Structure-function relationships of industrial enzymes. Chin J Biotech, 2019, 35(10): 1806–1818.

May 29, 2019;

September 23, 2019

Supported by: CAS Pioneer Hundred Talents Program (No. 2016-053).

Weidong Liu. Tel: +86-22-24828704; E-mail: liu_wd@tib.cas.cn

*These authors contributed equally to this study.

中國科學院率先行動“百人計劃”項目 (No. 2016-053)資助。

2019-10-21

http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1998.Q.20191021.1128.001.html

(本文責編 郝麗芳)