石墨烯量子點的光熱和光動力效應在殺菌中的應用

吳 穎,郭昱良,章澤飛,桂 馨

(同濟大學生命科學與技術學院,上海200092)

自從中國科學院黃慶課題組首次發現石墨烯(graphene oxide,GO)具有抗菌作用以來,石墨烯及其衍生物的抗菌研究引起了學者們的廣泛關注[1-3].單層石墨烯的厚度僅為0.35 nm,是目前世界上已知最薄的2維材料.巨大的比表面積可以讓石墨烯和更多的細菌接觸,良好的熱/化學穩定性可以使其持續地抑制細菌生長[4-5].

石墨烯量子點(graphene quantum dots,GQDs)可以通過切割大尺寸的石墨烯得到,因此GQDs的粒徑更小,從而獲得了比石墨烯更大的比表面積,在相同質量下可以裝載更多的藥物；而且不同于最常見的石墨烯和氧化石墨烯,GQDs不僅能夠高效地將光能轉換為熱能,同時還能產生活性氧(reactive oxygen species,ROS).但是,過量的ROS會破壞細胞膜、蛋白質以及DNA從而殺傷細胞[6-7].可見GQDs無需裝載光敏劑即可達到光熱和光動力的協同殺傷效果,而這2種效應的協同可以更大程度地殺傷細胞[8-9].因此GQDs將是一種性能優異、應用前景較好的殺菌材料.

本工作將GQDs的光熱效應和光動力效應聯合,達到協同殺傷細菌的效果,進一步推動GQDs在殺菌領域的研究.

1 材料和方法

1.1 實驗材料

蛋白胨、酵母提取粉購自Oxide公司(美國)；瓊脂購自沃凱化學試劑有限公司(上海)；大腸桿菌(Escherichia coli)菌種干粉購自中國工業微生物菌種保藏中心(CICC,上海)；石墨粉購自上海南球碳素合作公司(上海)；活性氧檢測試劑盒購自碧云天生物技術有限公司(江蘇)；氯化鐵、濃氨水、高錳酸鉀、濃硫酸、氯化鋇、無水乙醇、氯化鈉等試劑均購自國藥集團上海化學試劑有限公司(上海).

1.2 實驗方法

1.2.1 GQDs合成及形貌表征

本工作首先通過改良的Hummers法合成氧化GO[10-11],基本步驟如下：在冰水浴條件下,把1 g石墨粉緩慢加入到攪拌中的25 mL濃硫酸溶液,持續攪拌12 h；維持低溫,緩慢加入6 g高錳酸鉀,轉入40°C油浴中,攪拌30 min；加入20 mL去離子水,將油浴溫度提高到90°C,攪拌2 h；加入95 mL去離子水,將油浴溫度提高到105°C,攪拌40 min；使用溫水將整個體系稀釋到160 mL,再加入10 mL 10%的H2O2,趁熱過濾,得到濾餅；用5%HCl洗滌濾餅,直至濾液中檢測不到SO42-(氯化鋇溶液檢測)；將濾餅從濾紙上取下,超聲分散在500 mL去離子水中,得到約2 mg/mL GO水懸液.

取100 mL約0.2 mg/mL GO水懸液,加入2 mL H2O2(30%),80°C油浴下劇烈攪拌,緩慢滴加4 mL氯化鐵溶液(2 mg/mL),繼續攪拌約4 h直至溶液變為黃亮色；冷卻后,裝入截留分子量為1 000的透析袋中透析,直至透析外液中檢測不到Fe3+(濃氨水檢測)；之后冷凍干燥得到GQDs粉末；在透射電鏡下觀察GQDs形貌.

1.2.2 655 nm激光誘導GQDs的光熱轉換

將制備的GQDs粉末分散在蒸餾水中,得到質量濃度為0.6 mg/mL的GQDs水溶液,取200 μL于透明的玻璃小管中,封口膜密封管口,以低功率密度(0.25 W/cm2)的655 nm的激光束垂直照射玻璃小管中的樣品,采用紅外熱成像儀實時檢測樣品的溫度變化.以200 μL蒸餾水在同樣功率激光照射下的升溫測試作為對照,每組樣品在各時間點進行3次重復實驗.

1.2.3 LB培養基的配置

稱取氯化鈉10 g、酵母提取粉5 g、胰化蛋白胨10 g,溶解于1 000 mL去離子水中,121°C高壓滅菌20 min,4°C保存備用.實驗中所需的平板固體培養基,需要在上述的培養基配方中加入20 g瓊脂粉,高壓滅菌后趁熱倒至平板,待冷卻凝固后于4°C保存備用.

1.2.4 大腸桿菌的培養及菌液的制備

在35 mL預熱的液體LB(luria-bertani)培養基中加入少許大腸桿菌干粉粉末,于37°C,220 r/min搖床上培養過夜；待菌液的600 nm吸收值(OD600)為0.5左右時,取0.1 mL菌液加入新鮮的35 mL的LB培養基中,相同條件過夜振蕩培養；然后,10 000 g離心10 min,取沉淀,用滅菌的蒸餾水將菌液OD600調整至0.5后備用.大腸桿菌OD600為0.5時的菌體濃度為5×108個/mL.

1.2.5 655 nm激光誘導GQDs產生活性氧

取6 mL上述OD600值為0.5的大腸桿菌水溶液,加入6 μL活性氧檢測試劑盒中的探針DCFH-DA,37°C孵育20 min后用滅菌水洗滌3次,得到6 mL裝載了探針的大腸桿菌水溶液；將制備的GQDs粉末分散到3 mL大腸桿菌水溶液中,獲制3 mL質量濃度為0.6 mg/mL的GQDs和大腸桿菌混合液以及3 mL裝載了探針的大腸桿菌水溶液；取200 μL GQDs和大腸桿菌混合液加入到96孔板中,以低功率密度的655 nm的激光束垂直照射樣品孔,在不同時間點用酶標儀檢測樣品的DCF(2,7-dichlorofluorescein)熒光值；以200 μL大腸桿菌水溶液在同樣功率激光照射下的DCF熒光值作為對照,每組樣品各時間點進行3次重復實驗.

1.2.6 GQDs對大腸桿菌生長的影響

將0.1 mL上述OD600值為0.5的大腸桿菌水溶液加入到15 mL培養基中,加入紫外照射滅菌處理后的GQDs,調整其質量濃度為1 mg/mL,在上述條件下進行培養；設置未加GQDs的對照組,培養2 h后,每隔1 h取0.1 mL菌液檢測OD600的值用于繪制大腸桿菌的生長曲線,直至菌液的吸收值不再明顯增長為止.每組實驗重復3次.

1.2.7 655 nm激光誘導GQDs對大腸桿菌的殺傷作用

取0.2 mL的上述活菌液置于2 mL離心管中,分別加入GQDs形成濃度梯度,采用655 nm的近紅外激光在管壁正上方5 cm處照射20 min,設置未加GQDs的菌液進行相同激光處理作為對照；照射結束后采用梯度稀釋涂板法(103倍、104倍及105倍)對菌液內活菌數目進行記數,并取無GQDs菌液的菌數為標準計算活菌抑制率.每組實驗重復3次.

取0.2 mL的上述活菌液置于2 mL的離心管中,加入GQDs使其最終質量濃度為0.6 mg/mL,分別用655 nm近紅外激光在管壁正上方處照射不同時間,形成時間梯度；照射結束后使用梯度稀釋涂板法(103倍、104倍及105倍)對菌液內活菌數目進行記數,并取未進行激光照射的菌液的菌數為標準計算活菌抑制率.每組實驗重復3次.

1.2.8 數據分析

采用IBM SPSS Statistics 22提供的單因素方差分析法分析樣本各組間差異性,P＜0.05(*)表示具有統計學差異,P＜0.01(**)表示具有顯著的統計學差異,P＜0.001(***)表示具有極顯著的統計學差異.

2 實驗結果和討論

如圖1所示,本工作的整體實驗思路是利用655 nm激光誘導GQDs產生大量的熱量和活性氧,達到協同殺傷大腸桿菌的目的.

2.1 GQDs在655 nm激光照射下的光熱效應

圖2為制備的GQDs的透射電鏡照片和粒徑分布.結果顯示,該GQDs在溶液中的分布均勻,粒徑大小主要集中在8～14 nm,說明制備的GQDs是一種可以均勻分散的納米材料.

圖1 實驗示意圖Fig.1 Schematic illustration of experiment

圖2 GQDs的表征Fig.2 Characterizations of GQDs

在655 nm激光照射下的GQDs水溶液可以產生大量的熱量.圖3顯示了GQDs水溶液和單純的蒸餾水在655 nm激光照射下的升溫情況.圖中紅外熱成像儀檢測到200 μL 0.6 mg/mL的GQDs水溶液在被激光照射0.5 min后,就從最初的25.3±0.3°C上升到了31.8±0.7°C；5 min時,GQDs水溶液的溫度已經到達了儀器可檢測到的上限50.5°C,平均升溫幅度超過25°C.而相同體積的蒸餾水激光照射20 min后,僅上升到了29.0±0.2°C,平均升溫幅度僅為4°C左右.由此可見,GQDs是一種高效的光熱轉化材料.

2.2 GQDs在655 nm激光照射下的光動力效應

在655 nm激光照射下的GQDs可以產生數量可觀的活性氧.將GQDs和大腸桿菌水溶液混合,使混合溶液體積為200 uL,GQDs質量濃度為0.6 mg/mL.圖4顯示了0.6 mg/mL的GQDs經655 nm激光照射不同時間后的活性氧水平.圖中,酶標儀檢測到在被655 nm激光照射5 min后,相對活性氧水平從最初的2.6±0.9上升到18.5±6.2；隨著照射時間的增加,活性氧水平持續上升,照射20 min后達到了95.3±12.2,表明GQDs是一種性能較好的光動力材料.

2.3 GQDs對大腸桿菌生長的影響

GQDs自身對細菌的毒性很低.GQDs經過紫外照射滅菌后,加到大腸桿菌培養液中,并且確保共培養溶液中的GQDs質量濃度為1 mg/mL(見圖5),不論是調整期(0～6 h)、對數生長期(8～10 h)還是穩定期(12 h后),大腸桿菌的總體數量以及生長速度和未加GQDs組均無顯著差異,其生長曲線基本重疊,說明GQDs是一種生物相容性較好的材料.

圖4 0.6 mg/mL的GQDs經655 nm激光照射不同時間后的ROS水平Fig.4 ROS level of GQDs with a concentration of 0.6 mg/mL under 655 nm laser irradiation at different time point

圖5 單獨的GQDs對大腸桿菌生長的影響(GQDs質量濃度為1 mg/mL)Fig.5 Effect of GQDs on the growth of Escherichia coli(GQDs concentration：1 mg/mL)

2.4 655 nm激光照射下GQDs對大腸桿菌的殺傷作用

在655 nm激光照射下的GQDs可以有效地殺傷細菌.圖6顯示了不同質量濃度的GQDs經20 min 655 nm激光照射后的抑菌效果(定性分析).圖中,當GQDs質量濃度為0.1 mg/mL時,激光照射20 min后,可以觀察到大腸桿菌生長被抑制的趨勢；隨著質量濃度增大到0.2 mg/mL時,發現大腸桿菌的生長受到了顯著的抑制；而質量濃度為0.5 mg/mL時,平板里的大腸桿菌菌落數量僅為2位數.更可喜的是,0.6 mg/mL GQDs在激光照射20 min后可以完全殺滅大腸桿菌,而單獨的激光照射對大腸桿菌的生長無明顯影響,證明一定質量濃度的GQDs輔以激光照射是一種有潛力的殺菌方法.

圖6 不同質量濃度的GQDs經20 min 655 nm激光照射后的抑菌效果(定性分析)Fig.6 Antibacterial effects of GQDs on Escherichia coli with different concentrations under 655 nm laser irradiation for 20 min(qualitative analysis)

接下來的定量檢測也證實了GQDs可以有效地殺傷細菌.圖7顯示了不同質量濃度的GQDs經20 min 655 nm激光照射后的抑菌效果(定量分析).圖中,GQDs的質量濃度為0.1 mg/mL時,激光照射20 min后,活菌數量和對照組(未加GQDs組)相比減少了10%；當質量濃度為0.2 mg/mL時,細菌數量和對照組相比減少了25%,2組之間的活菌數有著顯著的統計學差異(P＜0.05)；當質量濃度達到0.3 mg/mL時,實驗組的活菌數和對照組相比有著極顯著的差異(P＜0.001)；而當質量濃度為0.6 mg/mL時,活菌數為0.

根據上述實驗結果可以發現,激光照射下GQDs殺滅細菌的有效質量濃度為0.6 mg/mL,在此基礎上進一步考察GQDs殺滅細菌的有效時間.如圖8和9所示,激光照射僅3 min后,活菌數量就已明顯減少；照射5 min后,86%的細菌被殺死；照射15 min后,細菌完全被殺滅.可見,激光照射下0.6 mg/mL GQDs殺滅細菌的有效時間為15 min.如果提高GQDs的質量濃度,殺滅細菌的有效時間有希望進一步縮短.可見,在激光照射下的GQDs可以短時、高效、可控地殺滅細菌.

圖7 不同質量濃度的GQDs經20 min 655 nm激光照射后的抑菌效果(定量分析)Fig.7 Antibacterial eきciency of GQDs on Escherichia coli with different concentrations under 655 nm laser irradiation for 20 min(quantitative analysis)

圖8 0.6 mg/mL的GQDs經不同時間655 nm激光照射后的抑菌效果(定性分析)Fig.8 Antibacterial effects of GQDs with a concentration of 0.6 mg/mL on Escherichia coli under 655 nm laser irradiation at different time points(qualitative analysis)

3 結束語

綜上,本工作首次利用655 nm激光誘導GQDs產生的光熱效應和光動力效應用于殺菌的研究.結果表明,在較低的GQDs質量濃度和較短的激光照射條件下,能夠高效地抑制細菌生長,如在GQDs質量濃度僅為0.6 mg/mL和激光僅照射15 min的條件下,能夠將大腸桿菌完全殺滅,表現出了較好的殺菌性能.本工作的研究結果可以促進GQDs在生物醫學領域中的應用以及殺菌新方法的推廣.

圖9 0.6 mg/mL的GQDs經不同時間655 nm激光照射后的抑菌效果(定量分析)Fig.9 Antibacterial effects of GQDs with a concentration of 0.6 mg/mL on Escherichia coli under 655 nm laser irradiation at different time points(quantitative analysis)

致謝感謝同濟大學生命科學與技術學院儲茂泉教授提供的研究思路和實驗條件,并參與論文修改和有意義的討論.