三七葉總皂苷抗老年焦慮癥的作用及機制研究

杜瑤 李欣 張桂仙 袁婭金 周寧娜

[摘要] 目的 探討三七葉總皂苷（tSPNL）抗老年焦慮癥的作用及其作用機制。 方法 12月齡雄性小鼠75只按照隨機數字表法分為群養（n = 15，正常對照組）和孤養（n = 60），4周后孤養動物隨機分為模型組（溶媒）、地西泮（BDZ）組、tSPNL高劑量組（500 mg/kg tSPNL）及tSPNL低劑量組（100 mg/kg tSPNL），每天灌胃給藥1次，連續給藥14 d后用高架十字迷宮（EPM）進行行為學測定;行為學實驗結束后，采用酶聯免疫吸附法檢測海馬內γ-氨基丁酸（GABA）、腦源性神經營養因子（BDNF）的含量。另取12月齡雄性小鼠135只孤養，4周后隨機分為模型組（溶媒）、BDZ組、氟西汀組、tSPNL高劑量組，每天灌胃給藥1次，連續灌胃給藥14 d后腦室內注射BDNF受體TrkB阻斷劑K252a、GABAA受體阻斷劑荷包牡丹堿（Bic），1 h后EPM進行行為學檢測。 結果 與模型組比較，tSPNL高劑量組小鼠開臂時間百分比（OT%）增加，差異有高度統計學意義（P < 0.01）;海馬BDNF、GABA水平增加，差異有統計學意義（P < 0.05或P < 0.01）。tSPNL組腦室內同時注射K252a及Bic后OT%降低，差異有統計學意義（P < 0.05）。 結論 tSPNL具有抗老年焦慮癥的作用，其抗焦慮作用與BDNF-GABA信號通路有關，可能通過增加BDNF水平改善GABA能神經的可塑性，從而降低老齡小鼠焦慮易感性。

[關鍵詞] 老年焦慮癥;三七葉總皂苷;BDNF-GABA信號通路;γ-氨基丁酸能神經可塑性

[中圖分類號] R284.2? ? ? ? ? [文獻標識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1673-7210（2019）08（a）-0007-04

[Abstract] Objective To explore the effect and mechanism of total saponins of Panax notoginseng leaves （tSPNL） on late-life anxiety. Methods Fifty aging male mice （12 months） were reared in group （n = 15， normal control group） or isolation （n = 60） according to the random number table method. After 4 weeks， the isolated rearing animal were then randomly divided into model group （vehicle）， Diazepam （BDZ） group， tSPNL 500 group （500 mg/kg tSPNL） and tSPNL 100 group （100 mg/kg tSPNL）. All mice were intragastrically administered desired compounds once a day for consecutive 14 days. The anxiety-like behaviors were evaluated by elevated plus maze （EPM）， and levels of GABA and BDNF in hippocampus were determined by enzyme linked immunosorbent assay after the behavior test. In another set， aging male mice （n = 135） were rearing isolated for 4 weeks and were then randomly divided into model （vehicle）， BDZ group， fluoxetine group， tSPNL 500 group. After administration of desired compounds intragastrically once a day for 14 days， animals underwent intraventricular injection of either BDNF receptor TrkB antagonist K252a or GABAA receptor antagonist Bicuculline （Bic）， and the anxiety-like behaviors were measured by EPM 1 hour later. Results Compared with model group， the percentage of open arm time （OT%） increased significantly in tSPNL 500 group （P < 0.01）， and the levels of BDNF and GABA also increased in hippocampus significantly （P < 0.05 or P < 0.01）. After intraventricular injection of K252a and Bic， OT% in tSPNL 500 group decreased significantly （P < 0.05）. Conclusion tSPNL can alleviate the anxiety-like behaviors in aging mice， and the mechanism is involved in BDNF-GABA signaling pathway， which may restore the GABAergic plasticity by increasing BDNF levels， thereby reducing the anxiety susceptibility of aging mice.

[Key words] Late-life anxiety; Total saponins of Panax notoginseng leaves; GABA-BDNF signaling pathway; GABAergic plasticity

焦慮癥是一種以焦慮情緒為主的神經癥，在老年人群中的發病率逐年上升[1]，預計到2050年全球患焦慮癥的老年人數量將達到20億[2]。老年焦慮癥發病機制與一般焦慮癥不同，與其神經退行性病變有關。γ-氨基丁酸（γ-aminobutyricacid，GABA）是中樞神經系統中調節精神活動的主要神經遞質，其中GABA A受體（GABAA-R）是產生抗焦慮效應的主要功能受體[3-4]。腦源性神經營養因子（brain-derived neurotrophic factor，BDNF）是GABA能神經在海馬區的效應分子，對GABA能神經的可塑性起著關鍵作用。GABAA-R可激活BDNF-TrkB-ERK1/2信號通路，觸發BDNF釋放，上調BDNF表達水平;反之BDNF通過突觸前TrkB受體也可促進GABA的釋放并增加細胞面表GABAA-R的表達，參與情緒調節[5-7]。老年人腦內BDNF水平下降，導致GABA能神經可塑性障礙，焦慮易感性增加，認知功能受損[8]。因此通過增加腦內BDNF水平恢復GABA能神經可塑性可能是老年焦慮癥治療的新策略。

研究發現三七葉總皂苷（total saponins of Panaxnotoginseng leaves，tSPNL）可上調BDNF及其受體TrkB的表達而發揮抗抑郁作用[9-10]。因此，我們推測tSPNL可能通過增加BDNF水平改善GABA能神經可塑性治療老年焦慮癥。本研究主要通過觀察tSPNL對老年焦慮小鼠行為學的影響，探討其與BDNF-GABA信號通路相關的作用機制，為其進一步的實驗研究提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 動物

昆明種小鼠，SPF級，雄性，體重40～50 g，12月齡，由四川省醫學科學院實驗動物研究所提供，合格證號：0016699。本動物研究方案經云南中醫藥大學動物使用和護理委員會批準（許可證號：R-062014054）。

1.2 藥物與試劑

三七葉皂苷（云南紅云生物工程技術有限公司）;地西泮（BDZ，江蘇濟川制藥有限公司，批號：080411）;氟西汀（FXT，禮來蘇州制藥有限公司）;蛋白定量測定試劑盒（南京建成生物工程研究所，貨號：A045-2）;GABA酶聯免疫吸附試驗（ELISA）試劑盒（南京建成生物工程研究所，貨號：H168-96T）;BDNF ELISA試劑盒（南京建成生物工程研究所，貨號：H069-96T）;荷包牡丹堿（sigma公司，貨號：2076197）;K252a（abcam公司，貨號：ab120419）。

1.3 儀器

小鼠高架十字迷宮，西班牙Panlab;SMARTUPG V2.5小動物行為學記錄分析系統，西班牙Panlab;電子天平（精度0.1mg），余姚市金諾天平儀器有限公司;腦立體定位儀，深圳瑞沃德生命科技有限公司。

1.4 方法

75只12月齡雄性小鼠按照隨機數字表方分成孤養和群養。群養15只，作為正常對照組;孤養小鼠60只在不透明籠內單籠單只隔離飼養復制社會隔離焦慮癥模型，4周后隨機分為模型組、BDZ組（BDZ 2 mg/kg）、tSPNL高劑量組（tSPNL 500 mg/kg）及tSPNL低劑量組（tSPNL 100 mg/kg），每組15只，模型組給予等劑量溶媒，每天灌胃給藥1次，連續給藥14 d，于末次給藥后1 h進行小鼠行為學實驗。

1.4.1 小鼠高架十字迷宮實驗? 參照文獻[18]報道方法，第14天末次給藥1 h后，進行小鼠高架十字迷宮實驗。測試時將小鼠置于高架十字迷宮中央平臺區域，分析系統記錄分析5 min內動物進入開臂與閉臂的次數及在開臂與閉臂內的停留時間，計算進入開臂次數與總入臂次數的百分比（open arm entry，OE%）及在開臂內運動時間與開臂閉臂內的總時間的百分比（open arm time，OT%）。以OE%和OT%代表藥物抗焦慮作用指標，總入臂數作為動物的運動活性指標，每只小鼠測5 min。

1.4.2 小鼠腦內GABA、BDNF水平的測定? 行為學測試后1 d，頸椎脫臼處死，分離出海馬，海馬體重（g）與勻漿液（mL）=1∶9的比例在冰浴條件下機械勻漿，4℃離心15 min后，取上清液，考馬斯亮蘭法測定蛋白含量，調整待測樣品蛋白濃度，按試劑盒說明書進行小鼠腦內GABA、BDNF含量測定。

1.4.3 腦室內注射受體阻斷劑阻斷BDNF-GABA信號通路? 氟西汀可通過增加腦內BDNF水平發揮抗焦慮作用，而地西泮則主要通過作用于腦內GABA受體發揮作用，為探討tSPNL抗焦慮作用是否通過BDNF-GABA信號通路，本研究選用FXT和BDZ進行對照。實驗另取135只12月齡雄性小鼠參照“1.4”項復制社會隔離焦慮癥模型，模型復制后將小鼠隨機分為模型組（生理鹽水，n = 15）、FXT組（FXT 10 mg/kg，n = 30）、BDZ組（BDZ 2 mg/kg，n = 30）和tSPNL 500 mg/kg（tSPNL 500，n = 60）組，模型組給予等劑量溶媒，連續灌胃給藥14 d。將各給藥組分為實驗組（n = 15）和tSPNL對照組（n = 15），末次給藥30 min后FXT組腦室注射K252a 0.5 μg/只（FXT+K252a），BDZ組腦室注射荷包牡丹堿（Bicuculline，Bic）0.5 μg/只（BDZ+Bic），tSPNL實驗組分為腦室注射K252a 0.5 μg/只（tSPNL+K252a）或Bic 0.5 μg/只（tSPNL+Bic）或同時注射K252a和Bic 0.5 μg/只（tSPNL+K252a+Bic）。FXT、BDZ組、tSPNL組對照組和模型組腦室內注射等劑量生理鹽水。注射方法：乙醚麻醉小鼠，將小鼠固定于手術臺，碘伏消毒小鼠頭部，剪開頭皮暴露前囟和矢狀縫，取前囟后0.25 mm，矢狀縫1.0 mm位置，用顱鉆將該位點頭骨打磨薄，將微量注射器緩慢進入腦內，深度2.5～3.0 mm，注射持續15 s。注射完成后留針5 min，緩慢旋轉出針，縫合傷口。腦室注射1 h后，進行行為學檢測。

1.5 統計學方法

采用GraphPad Prism 5.0統計學軟件進行數據分析，計量資料用均數±標準差（x±s）表示，非正態分布采用非參數檢驗，正態分布則進行方差齊性檢驗，方差齊采用One-way ANOVA Post-Hoc Tukey法進行多組間兩兩比較檢驗，方差不齊則采用秩和檢驗（Kruskal-Wallis檢驗）;計數資料用率表示，組間比較采用χ2檢驗。以P < 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 tSPNL對老齡小鼠行為學的影響

與正常對照組比較，模型組小鼠OE%和OT%明顯減少，差異有統計學意義（P < 0.05或P < 0.01）。與模型組比較，BDZ組小鼠OE%、OT%均明顯增加，差異有統計學意義（P < 0.05或P < 0.01）;tSPNL 500組小鼠OT%增加，差異有高度統計學意義（P < 0.01）;tSPNL 100組小鼠OE%、OT%均有升高的趨勢，但差異無統計學意義（P > 0.05）。提示tSPNL具有抗焦慮作用，在500 mg/kg劑量下作用明顯。見圖1。

2.2 tSPNL對小鼠大腦海馬GABA、BDNF水平的影響

與正常對照組比較，模型組小鼠海馬GABA、BDNF水平明顯降低，差異有統計學意義（P < 0.05或P < 0.01）。與模型組比較，BDZ組GABA、BDNF水平增加，差異有統計學意義（P < 0.05或P < 0.01）;tSPNL 500組GABA、BDNF水平均明顯升高，差異有統計學意義（P < 0.05或P < 0.01）;tSPNL 100組GABA、BDNF水平有升高的趨勢，但差異無統計學意義（P > 0.05）。提示在500 mg/kg劑量下tSPN能升高小鼠海馬內BDNF和GABA水平。見圖2。tSPNL具有升高老齡小鼠皮層BDNF、GABA的水平，但差異無統計學意義，在本文中未列出該數據圖表。

2.3 阻斷BDNF-GABA通路對tSPNL抗老年焦慮作用的影響

與模型組比較，FXT組、BDZ組及tSPNL 500均可增加老齡小鼠OT%。各給藥組在給予相應的受體阻斷劑后：①BDZ組可顯著提高小鼠OT%，注射Bic后OT%降低，差異有統計學意義（P < 0.05）;②FXT組的OT%增加，注射K252a后OT%降低，差異有統計學意義（P < 0.05）;③tSPNL 500組的OT%增加，分別注射K252a或Bic后，其OT%有降低趨勢，但差異無統計學意義（P > 0.05）;同時注射K252a及Bic后OT%降低，差異有統計學意義（P < 0.05）。提示tSPNL抗焦慮作用與BDNF-GABA信號通路有關。見圖3。

3 討論

臨床上治療老年焦慮癥的藥物主要是苯二氮卓類（BDZ）和五羥色胺再攝取抑制劑（SSRIs）SSRIs兩類。但老年人對BDZ類藥物的不良反應敏感性增加，容易導致認知障礙、精神運動性障礙以及依賴性，使其應用受到限制[11]。SSRIs起效慢、治療初期有興奮和致焦慮的風險以及增加性功能障礙、誘發老年人缺血性腦卒中的危險[12-13]，實際上仍不能成為理想的抗老年焦慮藥。開發療效顯著、特異性針對老年焦慮癥的新型抗焦慮藥物至關重要。

腦內GABA能神經可塑性障礙是老年焦慮癥的重要發病機制之一[14]，本研究選用老齡小鼠焦慮模型研究tSPNL抗老年焦慮癥的作用，并探討其對GABA能神經可塑性障礙的影響。行為學結果顯示，與正常對照組比較，模型組動物在高架十字迷宮中的OT%及OE%減少，表現出明顯的焦慮行為。與模型組比較，BDZ組和tSPNL組小鼠OT%與OE%增加，提示tSPNL具有抗老年焦慮的作用，且在500 mg/kg的劑量下抗焦慮作用最佳。研究證明，BDNF通過GABAA-R調控GABA能神經的可塑性，其分泌減少導致GABA能神經受損可塑性降低[15-16]。給予外源性BDNF可促進神經再生、GABAA-R表達增加、焦慮癥狀減輕[17-18]，改善認知功能[19]。此外，近期研究[20]報道，利用具有神經保護作用的二甲雙胍可能過CREB/BDNF信號通路對抗甲基苯丙胺所致大鼠焦慮、抑郁、認知障礙和神經退行性變，提示藥理干預可通過BDNF信號通路發揮抗焦慮作用。本課題組前期研究發現老齡小鼠腦內BDNF、GABA水平下降，焦慮易感性增加，其焦慮水平與BDNF、GABA水平成正相關關系[8]。本研究結果顯示，tSPNL組老齡小鼠海馬內GABA、BDNF水平升高，與行為學結果一致，提示tSPNL抗焦慮作用與增加腦內GABA、BDNF水平有關。腦室注射分別注射TrKB阻斷劑K252a或GABAA-R阻斷劑Bic后，tSPNL抗焦慮作用降低，但差異無統計學意義，該結果提示BDNF-TrKB或GABAA-R通路可能不是其獨立的抗焦慮作用機制。細胞內信號通路并不是獨立的，各條信號通路之間存在交叉通信，BDNF和GABA都有其不同的上、下游通路。同時注射K252a及Bic后，可消除tSPNL的抗焦慮作用，OT%明顯降低，提示tSPNL抗老年焦慮的作用與BDNF-GABA信號通路有關。以上結果提示，tSPNL具有抗焦慮作用，可能通過增加BDNF水平恢復GABA能神經可塑性，從而減輕老年焦慮行為的易感性。

本研究結果為老年焦慮癥的治療提供了潛在的藥物靶點，即通過補充BDNF恢復GABA能神經可塑性從而改善老年焦慮癥癥狀;同時本研究結果也為老年焦慮癥的治療提供了潛在的候選藥物。但本研究也存在局限性：①未進行tSPNL與BDZ、SSRIs優勢作用的比較，如BDZ可引起認知功能障礙，tSPNL是否可改善認知功能;②使用受體阻斷劑后未進行相關分子生物學指標檢測。更多的機制尚需進一步研究。

[參考文獻]

[1]? Craske MG，Stein MB，Eley TC，et al. Anxiety disorders [J]. Nat Rev Dis Primers，2017，3：17024.

[2]? Blazer，DG. Depression in late life：review and commentary [J]. J Gerontol A Biol Sci Med Sci，2003，58（3）：249-265.

[3]? Nuss P. Anxiety disorders and GABA neurotransmission：a disturbance of modulation [J]. Neuropsychiatr Dis Treat，2015，11：165-175.

[4]? Duveau V，Laustela S，Barth L，et al. Spatiotemporal specificity of GABAA receptor-mediated regulation of adult hippocampal neurogenesis [J]. Eur J Neurosci，2011，34（3）：362-373.

[5]? Nikolaus S，Wittsack HJ，Beu M，et al. GABAergic Contyol of Nigrostriatal and Messolimbic Dopamine in the Rat Brain [J]. Front Behav Neurosci，2018，12：38.

[6]? Luscher B，Fuchs T，Kilpatrick CL. GABAA receptor trafficking-mediated plasticity of inhibitory synapses [J]. Neuron，2011，70（3）：385-409.

[7]? Porcher C，Hatchett C，Longbottom RE，et al. Positive feedback regulation between gamma-aminobutyric acid type A （GABA（A） receptor signaling and brain-derived neurotrophic factor （BDNF） release in developing neurons [J]. J Biol Chem，2011，286（24）：21 667.

[8]? Zhou NN，Zhu GB，Lin Q，et al. GABAergic dysfunction in late-life anxiety：the role of BDNF [J]. European Neuropsychopharmacology，2015，25（2）：S253.

[9]? 繆吉，雷濤，楊光顯，等.三七皂苷對運動性貧血大鼠海馬BDNF表達的影響[J].中國康復，2017，32（6）：484-487.

[10]? 張華林，李中，周中流，等.三七葉總皂苷對抑郁大鼠腦內單胺及神經因子的影響[J].現代食品科技，2015（12）：32-41.

[11]? Allain H，Bentue FD，Polard E，et al. Postural instability and consequent falls and hip fractures associated with use of hypnotics in the elderly：a comparative review [J]. Drugs Aging，2005，22（9）：749-765.

[12]? Nutt DJ. Overview of diagnosis and drug treatments of anxiety disorders [J]. CNS Spectr，2005，10（1）：49-56.

[13]? Tanguay Bernard MM，Luc M，Carrier JD，et al. Patterns of benzodiazepines use in primary care adults with anxiety disorders [J]. Heliyon，2018，4（7）：88.

[14]? 石安華，孫曉菲，周寧娜.老年焦慮癥GABA能神經可塑性障礙及BDNF的潛在治療作用[J].中華行為學與腦科學雜志，2016.25（6）：572-576.

[15]? Shinoda Y，Sadakata T，Nakao K，et al. Calcium-dependent activator protein for secretion 2 （CAPS2） promotes BDNF secretion and is critical for the development of GABAergic interneuron network [J]. Proc Natl Acad Sci U S A，2011，108（1）：373-378.

[16]? Zhu G，Sun X，Yang Y，et al. Reduction of BDNF results in GABAergic neuroplasticity dysfunction and contributes to late-life anxiety disorder [J]. Behav Neurosci，2019，133（2）：212-224.

[17]? Muller HD，Neder A，Sommer C，et al. Different postischemic protein expression of the GABA（A） receptor alpha2 subunit and the plasticity-associated protein MAP1B after treatment with BDNF versus G-CSF in the rat brain [J]. Restor Neurol Neurosci，2009，27（1）：27-39.

[18]? Casarotto PC，Bortoil VC，Correa FM，et al. Panicolytic-like effect of BDNF in the rat dorsal periaqueductal grey matter：the role of 5-HT and GABA [J]. Int J Neuropsychopharmacol，2010，13（5）：573-582.

[19]? Xu AH，Yang Y，Sun YX，et al. Exogenous brain-derived neurotrophic factor attenuates cognitive impairment induced by okadaic acid in a rat model of Alzheimer′s disease [J]. Neural Regen Res，2018，13（12）：2173-2181.

[20]? Keshavarzi S，Kermanshahi S，Karami L，et al. Protective role of metformin against metham-phetamine induced anxiety，depression，cognition impairment and neurodegeneration in rat：The role of CREB/BDNF and Akt/GSK3 signaling pathways [J]. Neurotoxicology，2019，72：74-84.

（收稿日期：2018-12-06? 本文編輯：任? ?念）