在疫苗生產和醫(yī)療行業(yè)中不同物品同載進行脈動真空滅菌的效果驗證

王艦兵 金鑫 張可明

[摘要]目的 驗證在疫苗生產和醫(yī)療行業(yè)中不同種物品同載進行脈動真空滅菌的效果。方法 用專業(yè)溫度探頭、生物指示劑通過化學和物理方法對同載的不同物品進行脈動真空滅菌。首先進行脈動真空滅菌器空載保壓試驗和布維-狄克（B-D）試驗及熱穿透試驗，確認滅菌器性能合格后將疫苗生產中常用的硅膠管道、敷料包、橡膠栓、過濾器、超聲破碎儀、玻璃吸管、無菌服、止血鉗及器械等同芽孢指示劑一起按照規(guī)定的點位放入滅菌器內進行132℃、8 min挑戰(zhàn)試驗，共3次。最后進行生物挑戰(zhàn)試驗和無菌試驗。結果 脈動真空滅菌器保壓程序停止900 s后，初始壓力仍≤-93 kPa，泄露率≤2 kPa，保壓試驗合格;在空載條件下脈動上限+75 kPa、脈動下限-75 kPa、滅菌溫度132℃、滅菌時間4 min，完成滅菌操作后，取出測試包并打開觀察B-D指示圖呈現色列條變化均勻與對照圖設計的顏色一致，滅菌器真空性能試驗合格;在滅菌過程中的任何相同時間不同位置間的溫度差別（均一性）均≤2℃，且滅菌器溫度控制探頭與監(jiān)控記錄儀記錄的溫度差值均≤1℃，空載熱分布試驗合格;按著規(guī)定的裝載方式且達到滿負荷裝載后選擇132℃、8 min、脈動±75 kPa滅菌程序進行試驗，所有的測試各點標準滅菌時間（F0）≥15 min，滿載熱穿透試驗合格;被滅菌后的生物指示劑管內顏色呈現紫色，與說明書判定合格顏色一致，為培養(yǎng)陰性（-），同時55～56℃培養(yǎng)24 h后無細菌生長，微生物挑戰(zhàn)試驗合格;物品的淋洗水在接種培養(yǎng)基中放置在35℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 h后，培養(yǎng)基中沒有菌落生長，無菌試驗合格。結論 疫苗生產和醫(yī)療行業(yè)中常用的多種不同物品可以用脈動真空滅菌器同時進行132℃、8 min滅菌，且能達到國家藥典規(guī)范的要求。

[關鍵詞]脈動真空;布維-狄克試驗;驗證效果;微生物挑戰(zhàn)試驗;無菌保證水平

[中圖分類號] R953? ? ? ? ? [文獻標識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1674-4721（2019）8（c）-0172-04

[Abstract] Objective To verify the effect of pulsating vacuum sterilization of different species in the vaccine manufacturing and medical industries. Methods The pulsating vacuum sterilization of different articles on the same load were carried out by chemical and physical methods with professional temperature probe and biological indicator. Firstly， no-load pressure holding test and B-D test of pulsating vacuum sterilizer and thermal penetration test were carried out to confirm that the performance of sterilizer was qualified， and then the silica gel pipes， dressing bags， rubber bolts， filters， ultrasonic crushers， glass pipettes， aseptic clothes， hemostatic forceps and other spore indicators commonly used in vaccine production were identified， challenge tests at 132℃ and 8 min were carried out in the sterilizer at the prescribed locations for three times. Finally， microbial challenge test and aseptic test were carried out. Results The initial pressure of pulsating vacuum sterilizer was still ≤-93 kPa and the leakage rate was ≤2 kPa after 900 seconds of the pressure-holding procedure of pulsating vacuum sterilizer， the pressure-holding test was qualified. Under no-load condition， the upper limit of pulsation +75 kPa， the lower limit of pulsation -75 kPa， sterilization temperature 132℃， sterilization time 4 min. After sterilization operation， the test kit was taken out and the B-D indicator chart was opened to observe that the change of Israel strip was uniform and the color of the control chart was the same， the vacuum performance test of the sterilizer was qualified. The temperature difference （homogeneity） between different locations at the same time during sterilization was less than 2℃， and the temperature difference recorded by the sterilizer temperature control probe and the monitoring recorder was less than 1℃， and the no-load heat distribution test was qualified. According to the prescribed loading mode and after full load loading， the sterilization procedure of 132℃， 8 min and pulsation±75 kPa was selected to carry out the test. The standard sterilization time （F0）≥15 min at all test points， and the full load heat penetration test was qualified. After sterilization， the color in the tube of the bio-indicator was purple， which was consistent with the qualified color determined by the instructions. It was negative for culture （-）. At the same time， there was no bacterial growth after incubation at 55-56℃ （-） for 24 hours， and the microbial challenge test was qualified. The leaching water of the product was placed in the incubator at 35℃ （-） for 3 hours， but not in the culture medium. Colony growth， sterility test was qualified. Conclusion Various kinds of different articles commonly used in vaccine production and medical industry can be sterilized simultaneously by pulsating vacuum sterilizer at 132℃ for 8 minutes， and can meet the requirements of the national pharmacopoeia.

[Key words] Pulsating vacuum; Bowie-Dick test; Verification effect; Microbial challenge test; Sterility assurance level

高壓滅菌是使物品滅菌后達到最終無菌的要求，是藥品生產及相關行業(yè)中的一個基本保證[1]，是控制染菌的有效措施之一[2]。被滅菌的物料及器械由于材質、包裝、體積、耐熱系數等各不相同，同載滅菌時在相同的滅菌溫度和滅菌壓力下是否出現滅菌不徹底的現象，給生產和醫(yī)療帶來染菌的后果。為了保證高壓蒸汽滅菌物品的滅菌質量[3]，根據被滅菌物品的特性采用—種或多種方法組合滅菌。滅菌后還要采取適當方法進行滅菌效果的驗證[4]，高壓滅菌效果驗證是最關鍵的步驟，同時在藥品生產、醫(yī)療行業(yè)發(fā)展過程中，用驗證的方法是每個國家檢驗質量管理體系穩(wěn)定運行和發(fā)展的重要手段[5]，同時也是質量管理規(guī)范（GMP）不斷發(fā)展創(chuàng)新的可靠保證。驗證是更加安全和更加先進的質量保證方法[6]?，F在多數制藥行業(yè)已放棄了老式的下排汽高壓蒸汽滅菌器，采用了安全可靠、滅菌速度快、干燥效果好、智能程度高的脈動真空滅菌器進行無菌保障。本文以脈動真空濕熱滅菌器驗證為基礎，根據制藥生產企業(yè)和醫(yī)療單位對無菌保障的要求，開展多種不同物品同時用脈動真空滅菌器進行滅菌的效果驗證，現報道如下。

1材料與方法

1.1材料和試劑

滅菌對象是疫苗生產中常用的硅膠管道、敷料包、橡膠栓、過濾器、超聲破碎儀、玻璃吸管、無菌服、止血鉗及器械等。采用XG1.DTF-1.5B型脈動真空滅菌器（山東新華醫(yī)療器械股份有限公司），設備自帶溫度/壓力記錄儀。后安裝的SR10000型溫度曲線自動記錄儀（日本橫河電機株式會社）。

滅菌驗證效果所用的器材包括EB110型無線溫度記錄器（德國頤貝隆公司）;Ebro溫度驗證記錄儀（德國頤貝隆公司）;Ebro壓力驗證記錄儀（德國頤貝隆公司）;132℃高壓滅菌指示條和布維-狄克（B-D）真空試驗測試圖（山東新華醫(yī)療器械股份有限公司）;自含菌為嗜熱脂肪芽孢桿菌孢子（≥10-6）的脈沖指示管（美國MesalabsEZTest公司）;實驗用硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基（長春生物制品研究所有限公司，批號：20181205）;DH3600BⅡ型35℃恒溫培養(yǎng)箱（天津泰斯特儀器有限公司）。

1.2驗證方法及評價標準

1.2.1滅菌器性能驗證? 具體操作步驟如下。①真空保壓試驗：確認空載狀態(tài)下在滅菌器腔室內放置1個壓力探頭，啟動脈動真空滅菌器保壓程序，參數設定如下。保壓限度-93 kPa，時間900 s，泄露限度≤2 kPa。結果判定，若900 s后初始壓力≤-93 kPa、泄露率≤2 kPa/15 min，則視為設備保壓合格。②B-D試驗：滅菌器在無負載的初始狀態(tài)下將B-D測試包置放于排氣口上方20～30 cm處，并根據標記放置。設定B-D測試參數，脈動上下限±75 kPa，脈動3次，滅菌溫度132℃，滅菌時間為4 min，在完成滅菌操作程序后，取出測試包并打開觀察B-D指示圖。結果判定，若B-D指示圖上的色列條變化均勻，與對照圖設計的顏色一致提示脈動真空滅菌器能夠排除冷空氣99%以上，滅菌器真空性能合格。③空載熱分布試驗：滅菌器在無負載的初始狀態(tài)下，將經過校準合格并處在有效期內的14個Ebro自動溫度、壓力監(jiān)控記錄儀，以幾何分布的方式放置在滅菌器的內室中，保證14個監(jiān)控記錄儀的每個位置都不小于距離滅菌器內室四壁5 cm的距離（圖1）。在輸水口處至少放置一個壓力溫度監(jiān)控儀，并設定監(jiān)控儀的讀取記錄頻次為10 s/次。同時必須保證設備和14個監(jiān)控記錄儀同時開啟和結束;選擇132℃、8 min、脈動±75 kPa滅菌程序進行試驗。滅菌操作完成后讀取并記錄每個點位的溫度數值。結果判定，若在滅菌過程中同一時間不同點位間的溫度差別（均一性）≤2℃，且滅菌器主控溫度探頭與監(jiān)控記錄儀記錄的溫度數值差值均≤1℃，提示滅菌室內的溫度分布可確定為均勻（但是在14個溫度監(jiān)控記錄儀所監(jiān)控的點位也有相對的冷點，將其標明，在下面的挑戰(zhàn)試驗中密切觀察）;否則視為有“最冷點”并判定此次空載試驗失敗。④滿載熱穿透試驗：滅菌器裝載不同的待滅菌物品必須按預先設計的規(guī)定位置擺放（此后也要嚴格執(zhí)行），待達到滿負荷裝載后，將14個監(jiān)控記錄儀按空載試驗放置同上，必須保證設備和14個監(jiān)控記錄儀同時開啟和結束。選擇132℃、8 min、脈動±75 kPa滅菌程序進行試驗。滅菌程序結束后進行結果判定，若所有測試點標準滅菌時間（F0）≥15 min，提示滅菌器在規(guī)定的裝載方式且滿載的條件下滿足滅菌要求。

1.2.2生物挑戰(zhàn)試驗驗證? 滅菌器裝載材質、包裝、體積、耐熱系數等各不相同的待滅菌物品時必須按預先設計的規(guī)定位置擺放（此后也要嚴格執(zhí)行），待達到滿負荷裝載后，將經過校準合格并處在有效期內的嗜熱脂肪芽孢桿菌孢子按著滿載熱分布試驗所測試的每個點位的不同物品中放置1份生物指示劑并在滅菌器外留有一份陽性對照。按照設定的滅菌程序（132℃、8 min、脈動±75 kPa）進行滅菌操作，結束后將經過挑戰(zhàn)的生物指示劑和陽性對照同時在55～56℃下培養(yǎng)24 h。結果判定，經滅菌挑戰(zhàn)后的嗜熱脂肪芽孢桿菌孢子指示劑管內顏色呈現紫色，（說明書給定滅菌后的合格顏色）即為培養(yǎng)陰性（-），且陽性對照管內的生物指示劑顏色不變（黃色），可判定滅菌效果合格并達到滅菌驗證要求同時需在質量控制（QC）實驗室進行培養(yǎng)，證明無菌生長。若被挑戰(zhàn)的生物指示劑有1支或多支指示劑的管內培養(yǎng)液仍為黃色，則判定滅菌效果驗證失敗。

1.2.3無菌試驗? 在滅菌效果驗證合格的滅菌物品中，再分別抽取硅膠管道、敷料包、橡膠栓、過濾器、超聲破碎儀、玻璃吸管、無菌服、止血鉗及器械等樣品在百級潔凈環(huán)境下由QC人員用無菌水沖洗物品并收集淋洗水。采用硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基培養(yǎng)淋洗水的方法進行檢測，在35℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 h。結果判定，所有接種培養(yǎng)基的淋洗水樣品在3次培養(yǎng)中均無菌生長，則判定無菌驗證通過，若有1例樣品長菌則視為驗證失敗。

2結果

2.1保壓試驗結果

脈動真空滅菌器保壓程序停止900 s后，初始壓力仍≤-93 kPa、泄露率≤2 kPa，保壓試驗合格。

2.2 B-D試驗結果

在空載條件下脈動上限+75 kPa、脈動下限-75 kPa、滅菌溫度132℃、滅菌時間4 min、在完成滅菌操作后，取出測試包打開觀察B-D指示圖呈現色列條變化均勻與對照圖設計的顏色一致，則脈動真空滅菌器能夠排除冷空氣99%以上，滅菌器的真空性能試驗合格。

2.3空載熱分布試驗結果

在完成了一個滅菌周期（132℃、8 min、脈動±75 kPa）后讀取監(jiān)控記錄儀。數據顯示，在滅菌過程中的任何相同時間不同位置間的溫度差別（均一性）均≤2℃，且滅菌器溫度控制探頭與監(jiān)控記錄儀記錄的溫度差值均≤1℃，空載熱分布試驗合格。

2.4滿載熱穿透試驗結果

按著規(guī)定的裝載方式且達到滿負荷裝載后選擇132℃、8 min、脈動±75 kPa滅菌程序進行試驗。滅菌程序結束后讀取監(jiān)控記錄儀數據顯示，所有的測試點F0≥15 min，滿載熱穿透試驗合格。

2.5微生物挑戰(zhàn)試驗結果

芽孢指示劑按著滿載熱分布試驗所測試的每個點位的不同物品中布放，完成1個滅菌程序操作后，取出所有被挑戰(zhàn)的生物指示劑觀察顏色并同陽性一起在55～56℃下培養(yǎng)24 h。被滅菌后的生物指示劑管內顏色呈現紫色，與說明書判定合格顏色一致，為培養(yǎng)陰性（-），同時55～56℃培養(yǎng)24 h后無細菌生長，微生物挑戰(zhàn)試驗合格。

2.6無菌試驗結果

硅膠管道、敷料包、橡膠栓、過濾器、超聲破碎儀、玻璃吸管、無菌服、止血鉗及器械等物品的淋洗水在接種培養(yǎng)基中放置在35℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 h后，培養(yǎng)基中沒有菌落生長，無菌試驗合格。

3討論

本試驗首先通過了滅菌器的性能驗證、微生物挑戰(zhàn)試驗驗證和無菌試驗驗證，結合蒸汽滅菌的三大基本要素，即作用時間、滅菌溫度和飽和蒸汽的質量[7]，總結以上所有試驗結果提示脈動真空滅菌器在選擇132℃、8 min滅菌程序的條件下多種不同物品同載進行脈動真空滅菌驗證合格，且符合現行GMP關于對滅菌法的要求。同時不僅證明了本臺脈動真空滅菌器設備本身的可靠性，關鍵是對滅菌程序進行了驗證，保證了滅菌效果的有效性[8]。同時密切觀察在最冷點放置的生物指示劑是否通過微生物挑戰(zhàn)性試驗從而進一步證明滅菌的效果[9]。目前我國部分制藥企業(yè)和醫(yī)療單位仍沿用121℃、30 min;121℃、15 min以及116℃、40 min的程序進行滅菌[10]，存在滅菌品種單一、升溫緩慢、滅菌時間相對較長、干燥效果不理想等情況。本研究根據制藥企業(yè)和醫(yī)療行業(yè)中對滅菌物品多樣化的具體特點進行分析，采用了多種物品同時用脈動真空滅菌器（對于非液體類的）進行132℃、8 min滅菌程序試驗，試驗結果顯示，不僅安全性能得到保障，而且滅菌時間短、滅菌效果可靠、干燥效果好[11]，可以在制藥企業(yè)和及醫(yī)療行業(yè)中推廣應用。

單一品種物品的滅菌無論從滅菌過程還是滅菌程序的驗證都相對容易和簡單，但實際工作情況并非如此，大多數行業(yè)都是不同物品同時進行滅菌，這樣就要求必須要嚴格按著驗證過程中的包裝方式和裝載位置進行包裝和裝載。以保證滅菌的有效性和均一性[12]。如果包裝方式和裝載位置發(fā)生改變必須重新做滅菌效果驗證。如果遇到透氣效果不好、耐熱系數高的被滅菌物品可采用提高滅菌溫度和延長滅菌時間的方法來解決，但無論采用何種滅菌參數，都必須驗證所采用的滅菌工藝和監(jiān)控措施。在日常的工作過程中能確保物品滅菌后的無菌保證水平（SAL）≤10-6。驗證及操作人員應具備極強的責任心和專業(yè)理論水平[13]。

綜上所述，滅菌效果驗證是藥品生產企業(yè)和醫(yī)療行業(yè)中質量安全的必要條件和保障，設備的驗證和裝載方法的驗證要定期化和常態(tài)化并且符合設備驗證的工藝要求[14]，驗證后在日常生產中的每次滅菌也必須對各項參數和Fo值進行監(jiān)測[15]。也是對藥品生產質量和醫(yī)療工作的重要保障。

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（收稿日期：2019-01-31? 本文編輯：劉克明）