溫敏多柔比星納米凝膠栓塞微球的評價與處方優(yōu)化*

陳艷，謝委，肖政

(1.武漢市第四醫(yī)院，華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬普愛醫(yī)院消化內科，武漢 430035；2.華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬同濟醫(yī)院藥學部，武漢 430030；3.武漢市第四醫(yī)院，華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬普愛醫(yī)院急診科，武漢 430035)

以經導管動脈化學治療(化療)栓塞(transcatheter arterial chemoembolization，TACE)為代表的介入治療是20世紀80年代發(fā)展起來的一種非手術腫瘤治療方法，其操作簡單易行、安全可靠，對患者創(chuàng)傷小，治療費用較低，近期療效顯著，已經被公認為中晚期肝癌非手術療法的首選方案，是肝癌患者姑息治療及術前、術后輔助治療的有效手段[1]。栓塞材料是決定治療效果的關鍵因素，傳統(tǒng)栓塞劑如明膠海綿、淀粉微球、聚乙烯醇(polyving akohol，PVA)等大小不等，形狀不一，不易達到末梢栓塞的目的，一定程度上影響了介入治療的效果[2]。而藥物緩釋微球(drug-eluting beads，DEB)栓塞劑具有標準的外形尺寸及局部緩釋藥物優(yōu)勢，能夠栓塞末梢小動脈，維持時間較長，不易形成側支循環(huán)；栓塞后能夠在數天甚至數周內以較高濃度將藥物緩慢釋放到腫瘤血管內，用于肝癌的栓塞化療取得很好的效果，因此受到越來越多的關注[3-4]。筆者在本實驗中根據聚N-異丙基丙烯酰胺納米凝膠的理化性質特點[5-6]，構建溫敏納米凝膠載藥栓塞微球，通過溫度誘導的相變形成栓塞，能夠填充各種形狀的血管，栓塞效果好，適用于末端血管栓塞，有望成為一種理想的載藥栓塞微球。

1 儀器與試藥

1.1儀器 AUW 220D型雙量程分析天平(日本Shimadzu公司，感量：0.1 mg/0.01 mg)；DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器(河南予華儀器有限公司)；GXZ-9240 MBE型鼓風干燥箱(上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠)；科偉數顯電熱恒溫水浴鍋；美國Labconco公司FreeZone 6L型臺式凍干機；英國Malvern公司Nano-ZS 90型激光粒度儀；荷蘭FEI公司Tecnai G220型透射電子顯微鏡(TEM)；日本Hitachi公司F-4500型熒光分光光度計；美國Millipore公司Milli-Q超純水系統(tǒng)。

1.2試藥N-異丙基丙烯酰胺(N-isopropy-lacrylamide，NIPAM)和N，N′-亞甲基雙丙烯酰胺(N，N′-methylene bisacrylamide，MBA)均購自梯希愛(上海)化成工業(yè)發(fā)展有限公司，批號：I0401，E1086，使用前用環(huán)己烷和甲醇重結晶；丙烯酸(acrylic acid，AA)購自國藥集團化學試劑有限公司，批號：20170323，使用前重蒸；十二烷基硫酸鈉(sodium dodecyl sulfate，SDS)、過硫酸鉀(potassium persulfate，KPS)等使用前未做進一步純化。多柔比星(doxorubicin，DOX)購自浙江海正藥業(yè)股份有限公司，批號：170401，含量≥99.5%。實驗用水均為Milli-Q超純水。

2 方法與結果

2.1聚(N-異丙基丙烯酰胺-co-丙烯酸)納米凝膠的制備 稱取共聚單體NIPAM 1.13 g、AA 0.08 g、交聯(lián)劑MBA 0.08 g、乳化劑SDS 0.06 g于500 mL四口燒瓶，加水190 mL，攪拌使溶解。通氮氣(N2)至液面以下，驅盡燒瓶內空氣后升溫至70 ℃。加入2 mg· mL-1引發(fā)劑KPS溶液10 mL，在N2氛圍下反應5 h，得P(NIPAM-co-AA)納米凝膠(記為PNA)，透析除去未反應的單體和其他小分子物質，凍干。

2.2納米凝膠的形貌 取PNA納米凝膠粉末適量，加水溶解并稀釋制成0.1 mg·mL-1溶液，搖勻，取2滴于碳膜覆蓋的400目銅網上，10 mg·mL-1磷鎢酸染色后室溫下晾干，透射電子顯微鏡觀察，加速電壓200 kV，結果見圖1。凝膠顆粒形貌近似較均一微球，粒徑約100 nm。

圖1 PNA納米凝膠的TEM圖

2.3納米凝膠微球的溫敏性 取PNA納米凝膠粉末約50 mg，加水10 mL使溶解，置于25～40 ℃恒溫水浴，參照“粒度和粒度分布測定法”(《中華人民共和國藥典》2015年版通則0982第三法)，使檢測器遮光率8%～20%，測定不同溫度下溶液中納米凝膠微球的粒徑，每個測量溫度下樣品至少平衡5 min，結果見圖2。PNA納米凝膠微球具有明顯溫敏性，25 ℃時粒徑約150 nm，高于TEM測定的結果。隨著溫度升高，微球粒徑逐步降低，35 ℃后基本穩(wěn)定，約50 nm。

圖2 不同溫度下納米凝膠微球的粒徑(n=3)

Fig.2Particlesizeofnanogelsmicrospheresatdifferenttemperature(n=3)

2.4溫敏納米凝膠微球的載藥 吸取上述PNA溶液4 mL于透析袋(截留相對分子質量=14 000)，扎緊袋口，放入裝有0.5 mg·mL-1DOX溶液40 mL的錐形瓶，避光攪拌24 h。PNA納米凝膠含羧基，可以通過離子鍵與DOX中氨基結合，即通過靜電吸附作用負載藥物。該過程可以自發(fā)完成，見圖3，載藥前DOX主要位于透析袋外溶液，載藥完成后，透析袋內充滿溶液，且顏色顯著深于袋外，表明透析袋外DOX基本被袋內PNA吸附。將透析袋取出，置純化水中透析1周，除去未吸附的游離DOX，凍干。

圖3 溫敏納米凝膠微球載藥照片

Fig.3Photographsofdrug-loadingtemperaturesensitivenanogelsmicrospheres

2.5溫敏納米凝膠微球載藥量的測定

2.5.1DOX標準曲線的繪制 精密稱取DOX適量，用0.2 mg· mL-1納米凝膠溶液溶解并定量稀釋，制成40 μg·mL-1溶液，搖勻；精密移取1 mL于100 mL量瓶，0.2 mg· mL-1納米凝膠溶液稀釋至刻度，搖勻，作為DOX貯備液。分別精密移取DOX貯備液1.0，2.5，5.0，7.5 mL于10 mL量瓶，用0.2 mg· mL-1納米凝膠溶液稀釋至刻度，搖勻，參照“熒光分光光度法”(《中華人民共和國藥典》2015年版通則0405)，在激發(fā)波長505 nm、發(fā)射波長558 mn處測定供試品溶液的熒光強度[7]。以熒光強度(A)對濃度(C)線性回歸，得標準曲線方程C=23.84A-26.15(r=0.999 2)，表明DOX納米凝膠溶液在0.04～0.4 μg· mL-1范圍內線性關系良好。

2.5.2測定法 精密稱取溫敏納米凝膠載藥微球(W納米凝膠)約5 mg置于25 mL量瓶，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻。精密量取1 mL置于100 mL量瓶，加水稀釋至刻度，搖勻，作為供試品溶液。同法測定供試品溶液的熒光強度，用DOX標準曲線回歸方程計算供試品溶液濃度(C供)，則溫敏納米凝膠微球的載藥量按公式(1)計算[8]。

2.5.3重復性實驗 按“2.5.2”項方法平行制備6份供試品溶液，依法測定并計算溫敏納米凝膠微球載藥量。結果顯示，載藥量9.21%，6份供試品溶液日內精密度RSD為0.79%(n=6)，日間精密度RSD為1.34%(n=6)，均符合方法學要求。

2.5.4準確度實驗 精密移取“2.5.3”項已準確測得載藥量的供試品溶液10 mL于20 mL量瓶，分別加入DOX貯備液4，5，6 mL，加0.2 mg· mL-1納米凝膠溶液稀釋至刻度，搖勻，每個濃度平行配制3份。分別依法測定熒光強度，用DOX標準曲線的回歸方程計算低、中、高濃度回收率，結果分別為(98.31±2.14)%，(101.11±2.61)%和(100.03±1.65)%，RSD分別為1.85%(n=3)、0.91%(n=3)和1.04%(n=3)，均滿足方法學要求。

2.6溫敏納米凝膠載藥微球的相變行為 取溫敏納米凝膠載藥微球20 mg于樣品瓶中，加水1 mL，攪拌過夜使凝膠完全溶解。將樣品瓶放入25～37 ℃恒溫水浴，觀察不同溫度下溶液相變情況，見圖4。室溫下，溶液流動相較好，但隨著溫度升高，溶液黏度增大，流動性變差，直至從可流動的溶液狀態(tài)變成不可流動的凝膠狀態(tài)。該性質是溫敏納米凝膠載藥微球可作為栓塞材料的基礎，當載藥微球溶液注射進入體內后，由于溫度升高，溶液在血管內發(fā)生相變，轉變?yōu)椴豢闪鲃拥哪z狀態(tài)，形成栓塞[9]。發(fā)生溶膠-凝膠轉變時的溫度，即為溫敏納米凝膠載藥微球的相變溫度。

圖4 溫敏納米凝膠載藥微球溶液的相變行為

Fig.4Phasetransitionbehaviorofdrug-loadedtemperaturesensitivenanogelsmicrospheres

2.7溫敏納米凝膠載藥栓塞微球的處方優(yōu)化

2.7.1正交設計實驗 溫敏納米凝膠載藥栓塞微球的載藥量與相變溫度是影響其栓塞性能和治療效果的關鍵因素，與其處方密切相關。本研究固定NIPAM的投料量為1.13 g，以AA、MBA和SDS的用量為考察因素(分別記為A、B、C)，每個因素選取3個水平，如表1所示，進行L9(34)正交實驗優(yōu)化納米凝膠的處方。

表1 溫敏納米凝膠載藥栓塞微球的處方優(yōu)化因素水平

Tab.1Factorsandlevelsofformulationoptimizationforembolizationmicrospheresofdrug-loadedtemperaturesensitivenanogelsg

因素水平AA用量(A)MBA用量(B)SDS用量(C)10.080.040.0420.160.080.0630.320.120.08

2.7.2正交實驗結果 以溫敏納米凝膠載藥栓塞微球的載藥量與相變溫度為考察指標，數據處理采用“歸一化法”，將每個指均轉化為0～100%之間的“歸一值”，并計算幾何平均數，得總評歸一值(overall desirability，OD)。計算公式如下，結果見表2。

D=(Vn-Vmin)/(Vmax-Vmin)②

OD=(D1×D2)1/2③

其中Vn為實測值，Vmin和Vmax分別指該指標在所有實驗中測得的最小值和最大值。

由正交實驗直觀分析結果可知，以綜合評分為優(yōu)化指標，各考察因素影響的重要性順序為AA用量>MBA用量>SDS用量，以正交設計助手Ⅱ軟件對實驗結果進行方差分析，結果見表3。

表2 正交實驗結果

表3 綜合評分方差分析

F0.05(2,2)=19.000

空列D為誤差項，方差分析結果表明，AA用量對溫敏納米凝膠載藥栓塞微球的載藥量與相變溫度具有顯著影響，而MBA用量和SDS用量對載藥量與相變溫度的影響不顯著。經優(yōu)化后，最佳處方為A3B1C2，即AA用量為0.32 g，MBA用量為0.04 g，SDS用量為0.06 g。

2.7.3優(yōu)化處方的驗證 按正交設計實驗篩選的最佳處方，制備3批溫敏納米凝膠載藥栓塞微球，并對其載藥量和相變溫度進行測定。結果表明，采用優(yōu)選處方制備的3批栓塞微球載藥量為(19.01±0.82)%，相變溫度為(36.6±2)℃，表明正交設計實驗優(yōu)化的處方可靠，制備的溫敏納米凝膠載藥栓塞微球具有較高的載藥量和較高的相變溫度，有望作為TACE的栓塞載藥材料。

3 討論

3.1溫敏納米凝膠的栓塞機制 由于NIPAM結構同時含有親水的酰胺基和疏水的異丙基，低于相變溫度時，分子內氫鍵占主導，凝膠微球處于溶脹狀態(tài)，體積較大。隨著溫度的升高，氫鍵被破壞，分子內疏水作用占主導，導致凝膠微球收縮，體積變小[10]。但是當溫敏凝膠用于栓塞時，并不是通過微球本身完成栓塞，而是通過微球之間的疏水作用，形成宏觀上的凝膠阻塞血管。因此可以避免小顆粒的溫敏納米凝膠載藥栓塞微球通過腫瘤血竇或動靜脈吻合口，使化療藥更多的進入人體循環(huán)，甚至通過肝血管床，在肺部及其他器官形成致命性誤栓，導致肢體麻木、癱瘓、腦卒中、死亡等嚴重后果。

3.2正交實驗的數據處理 當指標較多時，每個指標優(yōu)選的條件可能相互矛盾，對某一效應有利的條件可能對其他效應不利，如載藥量和相變溫度，前者要求越高越好，后者則不然。因此各效應間應達成妥協(xié)，使所有指標綜合為一個可反映總體效應結果。本文采用Hassan“歸一化”法，將每個指標數學轉換，均標準化為0～1的總評“歸一值”[11]。

溫敏納米凝膠載藥微球具有液體栓塞劑的優(yōu)點，流動性好，不需要高壓注入，能避免栓塞劑反流或異位栓塞的發(fā)生，對不同形狀、部位均能實現栓塞。而通過溶膠-凝膠轉變實現栓塞，又具有顆粒栓塞劑的優(yōu)點，粘度低，剪切變稀顯著，相變行為豐富，具有較大強度。且以溫度作為調控因素，避免有機溶劑和交聯(lián)劑的使用，使用也更為安全，更適合用于血管栓塞[12]。

納米凝膠處方中AA用量是決定其載藥量和相變溫度的關鍵，隨著AA用量增加，凝膠親水性增加，因此顆粒體積增大，相變溫度升高[13]。由于DOX是通過羧基的靜電吸附作用負載于微球中，所以載藥量隨著AA的用量的增加而增大。該載藥方式制備過程簡單，可自發(fā)進行，特別適合負載帶電荷藥物[14]。根據最終優(yōu)化的處方，NIPAM、AA、MBA和SDS的用量分別為1.13，0.32，0.04和0.06 g，制備的3批栓塞微球載藥量為(19.01±0.82)%，相變溫度為(36.6±2)℃，有望以優(yōu)秀的負載DOX栓塞材料用于TACE的治療。