低苯丙氨酸山杏仁肽的制備

李志剛， 張宇靖， 張 晨， 光翠娥

（食品科學與技術國家重點實驗室，江南大學，江蘇 無錫214122）

苯丙酮尿癥（phenylketonuria，PKU）是一種由苯丙氨酸羥化酶 （phenylalanine hydroxylase，PAH）功能障礙或四氫生物蝶呤（tetrahydrobiopterin，BH4）合成酶/二氫生物蝶呤（dihydrobiopterin，BH2）還原酶缺陷而導致的常染色體隱性遺傳氨基酸代謝障礙性疾病[1-3]。飲食治療即控制患者日常飲食中苯丙氨酸攝入量，是目前最主要最有效的治療方式[4-5]。常見的由除苯丙氨酸外的其他游離氨基酸混合而成的配方食品，氣味難以接受，且食用后易造成人體滲透壓過高而導致腹瀉[6]。采用內肽酶和外肽酶分步水解的方法釋放游離苯丙氨酸或產生苯丙氨酸處于末端的肽鏈，經吸附去除苯丙氨酸后產物可用于為PKU患者制備特殊醫學配方食品。最常見最有效的吸附劑為活性炭。

日本學者Yamashita[7]和國內學者周志偉[6]分別以濃縮魚蛋白和酪蛋白為原料，通過酶法水解再經一定方式分離苯丙氨酸制備了低苯丙氨酸肽。除動物蛋白源外，小麥蛋白[8]、大米蛋白[9]及玉米蛋白[10]等也被用于制備此類肽。

作者以山杏仁蛋白為原料，通過酶法水解吸附苯丙氨酸制備低苯丙氨酸肽，為山杏仁的精深加工提高附加值提供依據，同時為開發低/無苯丙氨酸肽特殊醫學配方食品提供原料來源。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

脫脂山杏仁粗蛋白粉：上海問森生物科技有限公司產品；Alcalase 2.4L、Flavourzyme 1000L （食品級）：丹麥諾維信（Novozymes）公司產品；粉末活性炭：食品級，江蘇中遠活性炭公司產品。

紫外可見光分光光度計（UV-1600）：上海美普達儀器公司產品；pH計、離心機：梅特勒特托利多（上海）有限公司產品；HS-7集熱式電磁攪拌器：IKA產品；K9840智能定氮儀、SH420石墨消解儀：海能儀器產品；DZF-6050電熱真空干燥箱：上海博迅實業有限公司醫療設備廠產品；冷凍干燥機：美國Labconoco公司產品；Agilent1100氨基酸專用高效液相色譜系統：美國Agilent公司產品。

1.2 山杏仁蛋白的提取工藝脫脂山杏仁粗蛋白粉→調節pH至9.0→浸提→離心 （4000 r/min，20 min）→取上清液→調節pH至 4.1→離心 （5 000 r/min，15 min）→取沉淀→去離子水清洗→調節pH至7.0→真空冷凍干燥24 h→杏仁蛋白[11]。

1.3 常規成分測定

蛋白質含量測定：GB5009.5—2010[12]，凱氏定氮法；脂肪含量測定：GB/T5009.6—2003[13]，索氏抽提法；水分含量測定：GB5009.3—2010[14]，直接干燥法；灰分含量測定：GB5009.4—2010[15]，550℃高溫灼燒法；酶活測定：QB/T 1803—93[16]。

1.4 水解度（Degree of hydrolysis，DH）的測定

水解度測定采用甲醛滴定法[17]，公式如（1）所示：

式中：C為氫氧化鈉標準溶液濃度，mol/L；V1為所取水解液經甲醛滴定至終點pH 9.2時所消耗氫氧化鈉標準溶液的體積，mL；V2為空白經甲醛滴定至pH 9.2時所消耗的氫氧化鈉標準溶液的體積，mL；V為水解上清液體積，mL；M為水解樣品質量，g；N為樣品蛋白質質量分數，%；Htot為每克蛋白質中所含肽鍵毫摩爾數，對于杏仁蛋白，該值取7.58 mmol/g[18]。

1.5 Flavourzyme 1000L水解單因素實驗

配制質量分數5%山杏仁蛋白溶液，添加2 000 U/g Alcalase 2.4 L于60℃、pH 9.0條件下水解2 h后沸水浴滅酶10 min，待冷卻后用于外肽酶水解。外肽酶水解后沸水浴滅酶10 min，4 000 r/min離心10 min取上清液測定不同條件下DH。

1.5.1 pH對DH的影響于55℃下添加500 U/g Flavourzyme1000L， 分別于 pH 6.5、pH 7.0、pH 7.5、pH 8.0、pH 8.5下水解120 min，測定不同pH下的DH。

1.5.2 溫度對于DH的影響于pH 7.5、酶添加量為 500 U/g，分別在 45、50、55、60 ℃溫度下繼續水解120 min，分別測定不同溫度下DH的變化。

1.5.3 酶添加量E/S對DH的影響于pH 7.5、55℃的水解條件下， 測定 500、1 000、1 500、2 000、2 500、3 000、3 500、4 000 U/g 酶添加量下水解 120 min后DH的變化。

1.5.4 水解時間對DH的影響于pH 7.5、50℃、酶添加量為3 000 U/g的條件下，分別測定30、60、90、120、150、180 min 不同水解時間的 DH， 確定水解時間。

1.6 Flavourzyme 1000L水解正交實驗

通過單因素實驗發現，水解120 min后DH基本保持不變，因此采用三因素三水平的正交實驗確定Flavourzyme 1000L的最佳水解條件。正交實驗設計見表1。

1.7 苯丙氨酸的吸附

經雙酶分步水解后水解液6 000 r/min離心20 min，取上清液添加10 g/dL食品級粉末活性炭，于35℃、pH 2.0吸附3 h。

表1 正交實驗表Table 1 Factors and levels of orthogonal test

1.8 氨基酸組成分析

稱取100.0 mg肽粉于水解管內，加入8 mL 6 mol/L鹽酸，充氮封管后于120℃水解22 h，水解完成后取出冷卻加入4.8 mL 10 mol/L氫氧化鈉溶液中和鹽酸，再轉移至25 mL容量瓶中定容。雙層濾紙過濾，取1 mL濾液于1.5 mL離心管內 1 0000 r/min離心10 min，吸取400 μL上清液于樣品瓶中進樣測定。

液相色譜條件：Agilent Hypersil ODS柱（5 μm，4.0 mm×250 mm）； 流動相 A （pH=7.2）：27.6 mmol/L醋酸鈉-三乙胺-四氫呋喃 （體積比為500∶0.11∶2.5）；流動相 B（pH=7.2）：80.9 mmol/L 醋酸鈉-甲醇-乙腈（體積比 1∶2∶2）；采用梯度洗脫，洗脫程序：0 min，體積分數 8%B；17.0 min，體積分數 50%B；20.1 min，體積分數 100%B；24.0 min，體積分數0%B；流動相流量為1.0 mL/min；柱溫40℃；紫外檢測器（VWD）檢測波長為 338 nm，脯氨酸于262 nm處檢測。

2 結果與分析

2.1 常規成分測定結果

提取所得山杏仁蛋白基本成分見表2。

表2 山杏仁蛋白質基本成分Table 2 Main composition of apricot kernel protein

蛋白酶酶活測定結果見表3。

表3 蛋白酶酶活Table 3 Enzyme activity of different proteases

2.2 Flavouzryme 1000L水解單因素實驗

Alcalase2.4L是一種高效的細菌蛋白酶，能夠產生大量末端為疏水性氨基酸的肽類，所得水解液往往具有很強的苦味[19]。Flavourzyme 1000 L是一種兼具外肽酶和內肽酶活性的復合蛋白酶，能有效切除肽鏈末端的疏水性氨基酸[20]，并且能對肽類進行進一步水解，改善水解液的風味。

2.2.1 pH對DH的影響從圖1可以看出，在選定的pH值下，隨著pH的上升DH逐漸提高，當pH達到7.5左右時DH最大，超過7.5后由于蛋白酶的構象發生變化，水解能力逐漸下降，因此選擇pH 7.5為其水解pH。

圖1 pH對DH的影響Fig.1 Effect of pH value on DH

2.2.2 溫度對DH的影響從圖2可以看出，在選擇的溫度參數下，DH逐漸提高，在50℃左右時水解能力最強，超過50℃后由于高溫導致酶的構象發生不可逆的改變，活性開始下降，因此選擇50℃為其水解溫度。

圖2 溫度對DH的影響Fig.2 Effect of temperature on DH

2.2.3 酶添加量對DH的影響從圖3可以看出，隨著酶濃度的上升DH逐漸增大，當添加量增加到3 000 U/g左右時再增加酶濃度DH上升變緩，這可能是由于酶與底物的作用位點達到飽和狀態，再增大酶濃度對于DH的提高貢獻有限，因此酶添加量選擇3 000 U/g。

圖3 酶添加量對DH的影響Fig.3 Effect of enzyme concentration on DH

2.2.4 水解時間對DH的影響從圖4可以看出，隨著時間的推移，能夠被Flavourzyme 1000L水解的位點逐漸減少，水解120 min后能夠被繼續水解的位點幾乎沒有，DH變化平緩，因此選擇120 min為其水解時間。

圖4 水解時間對DH的影響Fig.4 Effect of hydrolysis time on DH

2.3 Flavourzyme 1000L水解山杏仁蛋白最佳條件

正交實驗結果見表4。

通過極差分析可知，影響Flavourzyme 1000L水解山杏仁蛋白的主次因素為B＞A＞C（pH的影響最顯著，溫度次之，酶添加量影響最小），最佳因素水平組合為B2A2C2，即水解pH為7.5，水解溫度為50℃，酶添加量為3 000 U/g。經測試在此工藝條件下水解120 min DH可達41.23%。

2.4 苯丙氨酸的去除及肽的氨基酸分析

常見的用于分離苯丙氨酸的方法有膜分離法、離子交換法、凝膠過濾法等，而活性炭對苯丙氨酸有著特異性的吸附能力[21]，具有廉價高效的特點，因此選用食品級粉末活性炭去除苯丙氨酸。

雙酶分步水解后所得水解液，經活性炭吸附苯丙氨酸后，真空抽濾去除活性炭，旋轉蒸發濃縮后真空干燥72 h。氨基酸組成見表5。

表4 正交實驗結果Table 4 Results of the orthogonal test

表5 肽粉氨基酸組成Table 5 Amino acid composition of the peptide powder

經計算，苯丙氨酸占總氨基酸質量的0.32%，較山杏仁蛋白所含質量分數5.01%大幅降低，同時也低于周志偉[6]等人利用酪蛋白制備低苯丙氨酸肽中質量分數0.5%。由于活性炭對含苯環氨基酸吸附選擇性較差，因此在利用此法生產低苯丙氨酸特殊食品時常常需要添加色氨酸和酪氨酸。此外，由于PKU患者飲食控制嚴格，導致體內缺乏礦物質和維生素，因此在利用此類肽制備低苯丙氨酸特殊食品時需要添加維生素、礦物質和碳水化合物等。

3 結 語

經過試驗，Flavourzyme 1000 L水解山杏仁蛋白的最佳工藝條件為水解溫度50℃、pH 7.5、添加量3 000 U/g，水解120 min后DH可達41.23%。雙酶分步水解后，水解液經活性炭吸附，最終所得肽粉中苯丙氨酸質量分數為0.32%。用此法所得低苯丙氨酸肽可通過補充部分氨基酸、維生素、礦物質及碳水化合物等為PKU患者制備低苯丙氨酸特殊醫學配方食品。