紅細胞膜仿生氮化硼納米球的制備及其作為抗腫瘤藥物載體的研究

馮詩倪， 張慧杰， 高曉冬， 中西秀樹*

（1．江南大學 糖化學與生物技術教育部重點實驗室 /生物工程學院，江蘇 無錫 214122；2．江南大學 藥學院，江蘇 無錫 214122）

惡性腫瘤嚴重威脅人類的生命健康。化療藥物因其適用于所有腫瘤類型，是目前應用最為廣泛的腫瘤治療方法之一。然而，化療藥物缺乏靶向性，在殺傷腫瘤細胞的同時也會無選擇性的殺傷正常組織細胞；且藥物在機體內代謝較快，容易被腎臟清除，無法達到良好的治療效果[1]。為改善化療藥物的治療效果，近年來藥物載體遞送系統（Drug delivery system，DDS）的發展提供了一種全新的化療藥物遞送方式。DDS可利用腫瘤部位高通透性和滯留（EPR）效應促進化療藥物進入腫瘤細胞，提高腫瘤部位藥物濃度，進而增強腫瘤治療效果[2]。

隨著納米技術的不斷發展，具有多種功能的納米材料被廣泛應用于生物醫學領域[3]。氮化硼（Boron nitride，BN）納米材料憑借其優異的抗氧化性、化學穩定性、潤滑性能、以及較高的導熱性成為研究者關注的熱點之一，并被廣泛用作復合物材料、光學與電子材料等[4]。BN具有與碳納米材料相似的結構和性質，它可看成是B原子與N原子交替連接代替C原子的位置而得[5]。研究表明，BN具有比碳納米材料更優異的生物相容性，是一種在醫學上極具潛力的納米材料[6]。BNNS作為一種新型BN納米材料，具有均一的球形結構和較低的結構誘導毒性。2011年，Zhi等[7]首先報導了BNNS具有良好的生物相容性，并且較易被細胞攝取。Zhang等[8]曾利用BNNS作為納米載體遞送具有免疫刺激活性的含有CpG基序的寡脫氧核苷酸（CpG oligodeoxynucleotide，CpG ODN）。 實驗結果表明，BNNS可以保護CpG ODN在血清中不被酶解，促進其被免疫細胞攝取。BNNS能顯著提高CpG ODN的免疫刺激活性，并刺激免疫細胞產生大量抗腫瘤細胞因子。此外，研究發現BN可以遞送高濃度硼原子到腫瘤組織中，大大高于血液和其它組織中硼原子含量，使其在硼中子俘獲治療 （Boron neutron capture therapy，BNCT）的應用中極具潛力[9-10]。 BN納米材料作為藥物載體或可實現化療與BNCT療法相結合的腫瘤協同治療。這將有可能為抗腫瘤治療提供一種安全高效的新策略。正因如此，BNNS在作為抗癌藥物載體方面顯示了一定的優越性。然而，迄今為止基于BNNS的抗腫瘤藥物載體鮮有報導，BNNS在生物醫學領域的應用仍待探索和發掘。此外，BNNS的表面疏水性能使其難以充分分散在有機溶劑和水中，易產生團聚現象，極大地限制了其發展與應用[11]。因此，必須對BN納米材料進行表面功能化修飾。

近年來，受到自然界生物近乎完美的結構、功能啟示，仿生技術引起了研究人員的廣泛關注[12]。通過對機體內源性功能成分的模仿，仿生藥物載體能夠與機體實現完美兼容，更加高效地進行藥物遞送。紅細胞是脊椎動物血液中數量最多的一種血細胞，負責向機體各個組織細胞輸送氧氣并回收二氧化碳等代謝產物。在血液循環系統中，紅細胞壽命長達120 d。紅細胞優異的系統循環能力得益于其獨特的形變能力和細胞膜表面的免疫抑制相關蛋白[13]。Zhang[14]課題組利用低滲處理制得天然紅細胞膜，并對金納米顆粒進行包被。實驗結果表明，紅細胞膜的包被能幫助金納米顆粒在血液中維持良好的穩定性，抑制巨噬細胞的吞噬。Rao等人[15]利用微流控電穿孔技術將紅細胞膜鍍層于磁性納米粒子外，制備出具有核-殼結構的仿生磁性納米粒子RBC-MNs。基于納米粒子優良的磁性、光熱性能和紅細胞膜的血液長循環特點，RBC-MNs被用于腫瘤增強核磁共振成像和光熱療法。結果表明RBCMNs能夠有效逃逸免疫細胞的吞噬，通過EPR效應大量聚集于腫瘤組織中，顯示出良好的抗腫瘤效果。

作者擬借助紅細胞膜良好的流動性，通過物理擠壓的方式將其包覆于BNNS外表面，同時，將疏水性小分子化療藥物DOX嵌插于紅細胞膜磷脂雙分子層內，構建出紅細胞膜包被的，裝載DOX的仿生藥物遞送系統DOX@RBC-BNNS，并對該遞送系統進行表征和體外抗腫瘤效果驗證（圖1）。

圖1 DOX@RBC-BNNS的制備過程Fig.1 Schematic illustration of the preparation process of DOX@RBC-BNNS

1 材料與方法

1.1 實驗材料

DOX：上海生工生物工程股份有限公司產品；昆明小鼠（雌性，均6-8周齡）：維通利華實驗動物技術有限公司產品；人宮頸癌細胞HeLa細胞株：中科院細胞庫提供；DMEM培養基和胎牛血清蛋白（FBS）： 美國 Gibco 公司產品；Cell-Counting Kit-8（CCK-8）試劑盒：日本Donjindo公司產品；Alexa Fluor?488-鬼筆環肽及DAPI：Invitrogen公司產品。

1.2 實驗方法

1.2.1 紅細胞小體的制備利用眼球取血法取昆明小鼠全血約2 mL置于5 mL離心管中 （內含0.5 mL質量分數3.8%檸檬酸鈉溶液作為抗凝劑）。將上述血液于4℃下3 000 r/min離心20 min，吸除上層血液絨毛層。再將紅細胞置于預冷的等滲磷酸鹽緩沖液（pH 7.4）中重懸，后于4℃下離心洗滌3次。將洗凈后的紅細胞置于預冷的0.2×PBS低滲緩沖液中重懸，隨后置于4℃冰箱中放置1 h，使之在低滲緩沖液中完全溶血。然后于4℃，9 000 r/min條件下離心15 min，使紅細胞膜沉淀，去除血紅蛋白。重復離心洗滌3次，經額定功率為60 W的水浴超聲20 min后，制得紅細胞小體。

1.2.2 RBC-BNNS的構建BNNS采用化學氣相沉積法（CVD）制備而成[16]。將制得的紅細胞小體和BNNS按質量濃度比為1∶1共混，使用迷你擠壓器（Avanti）進行往復的擠壓過篩，依次使用孔徑為400 nm及200 nm的 Millipore聚碳酸脂膜，連續過膜擠壓20次，制得紅細胞膜包被的RBC-BNNS。

1.2.3 RBC-BNNS的表征RBC-BNNS的形態表征由JEM-2100透射電子顯微鏡（JEOL，Japan）在加速電壓為80 kV時得到。表面電位及水合粒徑由Nano ZS Zetasizer（Malvern，England） 測得。紫外-可見光吸收光譜由Nanodrop 2000分光光度計（Thermo Fisher Scientific） 測得。

1.2.4 細胞培養實驗用細胞為人宮頸癌細胞HeLa細胞。HeLa細胞培養于DMEM（含有質量分數10%加熱滅活后的FBS及1%鏈霉素/青霉素雙抗）中。置于37℃，環境濕潤的體積分數5%CO2培養箱內培養。當細胞貼壁生長大于80%時進行細胞傳代。

1.2.5 RBC-BNNS的生物安全性考察利用CCK-8法來檢測HeLa細胞的活性。取對數生長期的細胞，稀釋成1×l05個/mL單細胞懸液，以每孔100 μL加入96孔細胞培養板中。將培養板置于37℃，體積分數5%CO2培養箱中培養24 h使細胞貼壁。隨后向培養板中加入系列質量濃度的BNNS和RBCBNNS，將96孔板放在培養箱內繼續培養24 h。最后向每孔加入10 μL CCK-8溶液，孵育約3 h，用酶標儀測定每個孔在450 nm處的吸光度值。

1.2.6 DOX的裝載首先以PBS作為緩沖液分別制備1 mg/mL的BNNS和RBC-BNNS溶液，分別取1 mL于離心管中，再向其中加入500 μL DOX溶液（1 mg/mL）。 制備DOX@BNNS時：將BNNS與 DOX的混合液在避光條件下室溫震蕩24 h。隨后，經13 500 r/min離心20 min收集樣品并用PBS洗滌數次，離心收集得到DOX@BNNS；制備DOX@RBCBNNS時：將RBC-BNNS與DOX的混合液在避光條件下通過孔徑為200 nm的迷你擠壓器連續過膜擠壓，隨后，經13 500 r/min離心20 min后收集樣品并用PBS洗滌數次，得到DOX@RBC-BNNS。利用Nanodrop檢測上清中游離DOX的量，通過計算得到載體上DOX的裝載量。

1.2.7 DOX@RBC-BNNS的細胞攝取將HeLa細胞接種于35 mm的Petri培養皿中，培養24 h使細胞貼壁后向培養液中加入2.5 μg/mL的DOX@RBC-BNNS，37℃下分別孵育0.5 h、2 h及4 h。孵育結束后，用PBS洗滌細胞，加入體積分數3.7%甲醛固定30 min。用PBS洗滌細胞2次后，細胞膜和細胞核分別用Alexa Fluor?488鬼筆環肽和DAPI染色，再用PBS洗滌2次，最后用激光共聚焦顯微鏡分別在405 nm和488 nm通道觀察HeLa細胞對DOX@RBC-BNNS的攝取情況并采集相應的熒光圖像。

1.2.8 DOX@RBC-BNNS體外抗腫瘤效果評價取對數生長期的HeLa細胞，質量分數0.25%胰蛋白酶消化成單細胞懸液，以1×104個/mL的細胞密度接種于96孔板中，100 μL/孔。細胞培養24 h后，分別加入終質量濃度為 2 μg/mL的游離 DOX、DOX@BNNS及DOX@RBC-BNNS，繼續培養細胞48 h。實驗終止前，各孔分別加入CCK-8溶液10 μL，繼續培養3 h后，用酶標儀測定每個孔在450 nm處的吸光度值。

1.2.9 統計學分析選用Student檢驗法對數據進行統計學差異分析。數據的表達方式均為平均值標準偏差。顯著性差異分別被標注為*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001。

2 結果與討論

2.1 RBC-BNNS的構建與表征

通過CVD法制備得到的BNNS具有均一的球形結構，通過透射電鏡（圖2）可以清晰的觀察到該納米球呈現聚集狀態，平均粒徑約為100 nm。經RBC包被后，BNNS表面的晶體結構消失，邊緣可見半透明的膜結構，且RBC-BNNS在透射電鏡下呈現出良好的單分散狀態，粒徑增加為約130 nm。該結果證明RBC膜成功包被于BNNS表面。

圖2 BNNS和RBC-BNNS的透射電鏡圖片Fig.2TEM images of BNNS and RBC-BMMS

隨后，利用動態光散射粒度儀對RBC-BNNS的粒徑、Zeta電位及穩定性進行考察。圖3顯示，BNNS的水合粒徑為763 nm，這是由于BNNS在水溶液中的團聚所造成。通過低滲處理制得的紅細胞小體的水合粒徑為227 nm，將其包被于BNNS表面后，RBC-BNNS的粒徑降為150 nm，說明RBC-BNNS在溶液中呈單分散狀態。細胞膜磷脂雙分子層外部親水，使RBC-BNNS表面具備親水性，在溶液中表現出良好的分散性。Zeta電位結果顯示，BNNS表面電位約為-32.2 mV，而RBC-BNNS的電位約為-10.6 mV，與紅細胞小體的表面電位 （-9.5 mV）相似。以上結果表明，RBC膜的包被改善了BNNS的表面疏水性，極大提升了BNNS的溶液分散性。此外，Zeta電位的變化間接證明了RBC-BNNS的成功制備。

圖4顯示了RBC-BNNS在PBS緩沖液中的長期穩定性。結果表明RBC-BNNS的粒徑在14 d內無顯著變化，說明該仿生納米載體具有良好的分散性和穩定性。這種理想的分散穩定性增加了RBCBNNS的靜脈給藥可操作性，同時也將有助于維持藥物在系統循環過程中的穩定性，避免血管堵塞等不良反應的發生。

圖3 BNNS，RBC小體和RBC-BNNS的粒徑及表面電位Fig.3 Hydrodynamic size and surface zeta potential of BNNS，RBC-Vesicles and RBC-BNNS

圖4 基于粒徑變化的RBC-BNNS穩定性考察Fig.4 Stability of RBC-BNNS in terms of particle size

2.2 RBC-BNNS的生物安全性

理想的藥物載體必須具備優異的生物安全性。為此，利用CCK-8法對BNNS及RBC-BNNS的生物安全性進行了考察。圖5為不同質量濃度的BNNS和RBC-BNNS對HeLa細胞存活率的影響。結果表明BNNS和RBC-BNNS在最高質量濃度100 μg/mL范圍內未表現明顯的細胞毒性，細胞活性均保持在90%以上，展現出良好的生物相容性。

圖5 BNNS和RBC-BNNS的細胞毒性檢測Fig.5 Cytotoxicity of BNNS and RBC-BNNS

2.3 DOX@RBC-BNNS的細胞攝取

BN納米材料與石墨具有相似的結構和性質，可與疏水性小分子藥物DOX通過π鍵相互結合。而RBC-BNNS則通過其外層RBC膜的疏水性磷脂雙分子層貯存DOX。DOX在RBC-BNNS上的裝載量為214.3 μg/mg，遠高于其在BNNS上的裝載量（6.7 μg/mg）（圖 6），這是由于 RBC-BNNS 增強的溶液分散性提升了載體的比表面積，且藥物裝載過程中的機械擠壓力促進了藥物在RBC-BNNS上的裝載。

圖6 BNNS和RBC-BNNS的DOX裝載量Fig.6 DOX loading capacity of BNNS and RBC-BNNS

選擇HeLa細胞作為腫瘤細胞模型來評價DOX@RBC-BNNS的細胞攝取情況。DOX在488 nm激發光激發下能產生紅色熒光，可通過CLSM考察細胞對藥物載體的攝入。CLSM成像結果如圖7所示，在0.5 h時，僅有少量DOX@RBC-BNNS進入HeLa細胞；隨著培養時間增長至2 h，大量紅色熒光定位于細胞質中；共孵育4 h后，HeLa細胞在細胞核區域顯示出明亮的紅色熒光。該結果證明DOX@RBC-BNNS能夠被HeLa細胞快速高效攝取，隨后DOX能夠從載體上有效釋放并進入細胞核發揮作用。

圖7 HeLa細胞與DOX@RBC-BNNS共培養0.5 h，2 h及4 h后的共聚焦顯微鏡圖片Fig.7 CLSM images of HeLa cells after incubation with DOX@RBC-BNNS for 0.5 h，2 h and 4 h，respectively

2.4 DOX@RBC-BNNS的體外抗腫瘤效果

最后，利用CCK-8法驗證 DOX@RBC-BNNS對腫瘤細胞的殺傷效果。如圖8所示，游離DOX與載藥納米粒子均表現出對腫瘤細胞的殺傷作用，但游離DOX及DOX@BNNS對腫瘤細胞的殺傷力相對較弱。這是由于DOX通過被動擴散途徑進入細胞且易被泵出；而DOX@BNNS較差的溶液分散性限制了細胞對藥物的攝入[17]。DOX@RBC-BNNS對腫瘤細胞的殺傷效果最為明顯，或與其優越的分散性和高效的細胞攝取有關。以上結果表明，RBCBNNS在癌癥治療中有很強的藥物運載和運輸潛力，可被用作有效的藥物載體進行深入研究。

圖8 HeLa細胞與游離 DOX，DOX@BNNS及 DOX@RBC-BNNS共培養48 h后的相對細胞活性Fig.8 Relative viability of HeLa cells incubated with free DOX，DOX@BNNS and DOX@RBC-BNNS for 48 hours

3 結 語

采用低滲處理分離純化紅細胞膜，通過機械擠壓將其包被于BNNS外，制備了一種新型仿生藥物運輸載體RBC-BNNS。該載體具有均一的粒徑及良好的分散性，在PBS中能保持較長時間的穩定。體外毒性實驗表明該載體具有優越的生物相容性。該載體的 DOX的裝載量為 214.3 μg/mg，遠高于BNNS。RBC-BNNS能夠有效輸送DOX進入腫瘤細胞，并在胞內進行藥物釋放。此外，細胞毒性實驗初步驗證了DOX@RBC-BNNS比游離DOX具有更顯著的癌細胞殺傷效果。綜上，該仿生藥物載體在腫瘤治療中具有潛在的應用前景，為開發安全高效的藥物載體提供了新思路。