不同條件對纖維素糖化反應動力學參數的影響

劉 璐， 張志才*，2， 樊亞娟， 胡坤雅， 汪 佳

（1.江蘇大學，農業生產加工工程研究所，江蘇 鎮江 212013；2.北京綠科天成生物有限公司，北京 102300）

秸稈轉變成生物質能源包括4個步驟：秸稈的預處理、秸稈纖維素的糖化、發酵和生物能源的提取。其中纖維素糖化，即把秸稈中的纖維素轉變成可發酵的己糖[1-3]，是秸稈開發利用生產清潔能源過程中一個極其重要步驟。秸稈中的纖維素糖化反應是一個動態反應過程，為探究其行為機理需要進行動力模型學研究，利用該模型研究影響酶水解效率的因素及規律[4]。

由于纖維素酶水解過程是異相反應，且反應速率常數不斷降低，準穩態理論不成立，再加上酶水解反應動力學較復雜，不能采用傳統的米氏方程進行描述[5]。而米氏方程模型僅適用于均相體系中，許多生物催化反應發生在非均相系統中，受到擴散與傳質，反應物分子、產物分子與催化劑表面發生的吸附、傳遞、脫附、酶變性等影響[6-7]。因此，無法用傳統的米氏方程理論描述非常規的反應[8]，需要對模型進行修改以描述非均質系統中的酶反應[9]。

Kopelman等認為非均相反應的動力學不遵從經典動力學模型，速率常數隨著時間而變，速率常數與反應級數和譜維數有關，酶解反應動力學屬于類分形動力學模型[10-11]。Priit V?ljam?e采用類分形動力學研究了里氏木霉的水解過程，同時提出類分形動力學可能也適用于纖維素的酶解過程[12]。Huang研究了不同濃度的不溶性酶對不同濃度的底物水解，提出了快速吸附的動力學模型，并討論了確定動力學參數的方法[13]。

而IMM的研究對象是復雜、抽象和未簡化的非線性系統，不僅可以認識其內在規律、反映事物的內在本質，還可以簡化研究過程。簡化的動力學模型使用Kobs，0來考慮預處理前后底物酶的初始活性和可及性，Ki表現出由酶對惰性和非反應性物質的阻礙反應引起的酶活性逐漸喪失的異構系統，IMM可以清晰反應纖維素酶水解的反應過程。對此，作者選擇IMM研究了不同反應條件對纖維素糖化反應動力學參數的影響，以獲得最大糖得率，為木質纖維素的糖化奠定良好的基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

纖維素：購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；纖維素酶：購自和氏璧生物技術有限公司。

1.2 動力學模型

纖維素的糖化反應發生于非均相體系，反應過程可以用下列方程表示：

其中S，P和ES分別表示底物、產物，和酶-底物復合物。k1和k2是指正向反應速率常數，k-1表示反向反應速率常數。模型假設：（i）與酶反應相比，固體底物對酶的吸附速率更快，（ii）酶的反應受阻主要包括產物抑制，基質對酶非反應位點的吸附作用，以及酶的質量轉移阻力，（iii）酶反應被認為是酶（E）與底物的結合形成酶-底物復合物，（iv）預處理對固體底物結構的影響通過相應的反應速率即k1，k-1和k2反映出來。基于以上假設，在反應過程中，當[ES]處于準穩態，對于[ES]有，μ分解=μ合成，μ分解=（k-1+k2）[ES]，μ合成=k1[E][S]，由此得到[ES]=[E][S]/Km，這里Km=（k-1+k2）/k1。 因此，產物的生成速率可以表示為：

產物和底物達到平衡時，

式（2）中：[S0]表示底物初始濃度。 因為[ES]＜＜[P]+[S]，所以[ES]可忽略。 （2）可簡化為下式：

公式（3）代入公式（1），化簡得到下列公式（4）：

令[P]/[S0]=Ytrs，代入式（4）中。

公式（5）中k2[E0]/Km=Kobs，0，且Kobs，0取決于底物預處理的效果，酶對底物的可及性以及酶在固體基質中的活性。非均相反應體系中的糖化反應由于底物的不可溶解性導致酶與底物接觸面積過小而使得反應速率很慢。因此，酶的活性受到阻礙，酶的水解速率逐漸減小。阻礙的反應可由下式表示出來，其中，Ki表示水解過程中無效酶的系數，Ei表示無效酶。阻礙反應可通過如下一階方程表示：

隨著反應的進行，可與酶反應的底物隨著時間的增大而減少。基于對實驗的觀察，Ki可用隨時間變化的下列函數表示：

酶的物料平衡組成為：

式（8）中，[E0]，[E]，[ES]，[Ei]指初始酶濃度，自由酶的濃度，一個酶-底物復合物的濃度，一個無效酶的濃度。 式（8）對時間求導，得式（9）。

因為[ES]復合物被假設為穩定態且d[ES]/dt≈0，所以，式（9）可被簡化為下式。

將公式（7）帶入公式（10）中，得下式。

公式（11）進行積分，得[E]/[E0]=1/（1+αt）2，帶入式（5），得下式。

對公式（12）整理并積分給出下列公式。

對式（13）進行變形，得下式。

式（14）中，兩邊同時被t除，得到的t項和常數項系數分別為 α/Kobs，0和 1/Kobs，0，Ki可由式（7）進行計算，預測的Ytrs（Ytrs，pred）可由下式計算。

1.3 試驗設計

由試驗得到條件溫度、pH、底物質量濃度和酶質量濃度對糖得率影響最大，因此設計4因素3水平的29組的Box-Behnken試驗，研究溫度（A）、pH（B）、底物質量濃度（C）和纖維素酶質量濃度（D）對糖得率Ytrs的影響，并采用Design Expert 8.0.1、SPSS 17.0軟件進行分析[14-17]，通過比對各因素顯著性篩選出最適合水解的條件，每組試驗重復3次，試驗因素及水平見表1。對試驗結果進行回歸分析、方差分析。

為了探究Ytrs與Kobs，0、Ki相關性， 利用 SPSS 17.0軟件對其進行分析，通過顯著性判斷因素之間是否相關，獲得方程，并解出方程，討論三者之間的關系，獲得最大糖得率。

表1 Box-Behnken設計方案Table 1 Box-Behnken design of response surface design

1.4 分析方法

1.4.1 纖維素酶水解將纖維素與纖維素酶在pH 4.8 0.1 mol/L的乙酸鹽緩沖液混合后，加到100 mL三角瓶中用DNS法[18]測定初始還原糖質量濃度為C0。在50℃，120 r/min水浴搖床中的振蕩糖化，分別于 0、1、2、4、8、16、32 h 取樣，并將樣品冰浴冷卻。取樣品與離心管中，4 000 r/min離心15 min，取上清液測定還原糖含量和酶活。

1.4.2 還原糖的測定采用3，5-二硝基水楊酸法[19]。

總還原糖的產量（Ytrs）根據下列公式計算：

其中，V為反應體系的體積（mL），G為底物質量（g），C0、C1分別為反應前后還原糖質量濃度（g/mL）。

所有試驗均經過3次平行試驗，結果以平均值來表示。

1.5 數據處理

所有試驗均經過3次平行試驗，結果以平均值來表示，試驗結果采用EXCEL 2007和SPSS 17.0統計分析軟件來處理。

2 結果與討論

2.1 模型擬合結果分析

影響酶反應速率的因素主要包括反應溫度、溶液的pH、酶質量分數和基質質量分數。試驗選擇響應面分析研究了這些因素的單獨作用和交互作用對酶反應速率的影響。4因素3水平29組試驗的BBD運行，反應不同時間還原糖得率的結果顯示在表2。

表2 Box-Behnken設計運行結果Table 2 Run results of Box-Behnken design of response surface design

用IMM模型 （公式14）擬合表3中的試驗數據，得到表3。

從表3可以看出，所有擬合的R2都高于0.96，并且與adj-R2值極其接近，p＜0.001，說明IMM模型能很好的擬合實驗結果，而且具有較高的解釋率和可信度。通過擬合的方程得到的Kobs，0和Ki也顯示在表4。

表3 Box-Behnken設計運行結果的模型擬合分析Table 3 Model fitting analysis of the run results of Box-Behnken design of response surface design

2.2 響應面結果分析

從表3可見，反應時間32 h的糖得率最高，因此試驗選擇 32 h 的糖得率（Ytrs）和表 4 中的Kobs，0和Ki作為響應值，分析了反應溫度，pH，底物質量濃度和纖維素酶質量濃度單獨作用和交互作用對這3個響應值的影響。采用下列方程擬合實驗數據：

其中Y是預測響應值（Ytrs，Kobs，0和Ki）；β0是常數；βi是單獨作用系數；βij是不同因素間XiXj交互作用系數，βii同一因素之間交互作用系數；Xi和Xj表示自變量值。擬合結果顯示在表5。

方差分析的結果如表5所示。四元二次模型的p＜ 0.05，Ytrs值，Kobs，0和Ki的F值分別為15.52，9.65和3.03，表明模型非常顯著。模型的失擬項“Prob ＞F”值分別為 0.054 3，0.856 6，0.052 6 均大于0.05，即失擬項不顯著，因此模型具有統計意義。將表5中的各項系數分別帶入方程（17），得到下列方程：

表4 二次響應面模型的方差分析Table 4 ANOVA analysis for quadratic response surface

采用Design Expert 8.0.1軟件對試驗結果進行分析。模型的“Prob＞F”的p值小于0.000 1，表明模型是顯著的。在響應值為Ytrs的模型中，顯著項為B，C，D，CD，A2，B2，C2， 在響應值為Kobs，0的模型中，顯著項為A，C，D，在響應值為Ki的模型中，顯著項為A，A2，B2。因此響應值為Ytrs模型中包含兩個線性項（B，C，D），一個交互項（CD），三個交互項（A，B和C）； 響應值為Kobs，0模型包含兩個線性項（A，C，D）；響應值為Ki模型包含兩個線性項（A），和兩個二次項（A2，B2）。

2.3 單因素作用分析

2.3.1 溫度對反應動力學模型參數的作用纖維素酶水解是一種化學反應，以分子運動為基礎，以酶分子與底物分子的吸附、絡合和解離為基礎，分子動能與溫度直接相關，且酶是生物催化劑，具有溫度效應，影響酶解率[20]。在40～48℃之間，溫度升高，糖得率逐漸增大，無效酶（Ki）逐漸降低，在48℃時，獲得最大糖得率和最低的無效酶；當溫度超過48℃時，酶以失活為主無效酶逐漸增大，糖得率逐漸降低。在整個試驗溫度范圍內隨著溫度升高，Kobs，0一直保持增加趨勢，說明增加溫度有利于增加酶與底物的可及性，提高酶的利用率。多數研究顯示，纖維素酶作用底物的最佳溫度范圍為 40～65℃[21]，與實驗所得結論一致。

2.3.2 pH對反應動力學模型參數的作用酶在一定的pH范圍內才具有較高的催化活性，因此糖得率隨pH變化的曲線呈拋物線形狀。當pH＜4.5時，隨pH值增加，糖得率逐漸增加，而無效酶逐漸減少；當pH=4.5時，糖得率取得最大值，而無效酶取得最低值；當pH＞4.5，纖維素酶變性，較高的pH值會破會酶的空間結構，影響酶活性部分的解離狀態，因此隨著pH升高，雖然會保持蛋白質的天然性質，卻失去了應有的活性[22]，導致無效酶活性增加，因此糖得率也隨之減少。在pH在4.5時，糖得率取得最大值和無效酶取得最低值，證明pH的變化，通過影響纖維素酶的活力實現。在整個試驗pH范圍內隨著pH升高，Kobs，0一直保持增加趨勢，說明增加pH有利于增加酶與底物的可及性，提高酶的利用率。研究顯示，最適 pH值范圍為 4.0～5.5。

2.3.3 底物質量濃度對反應動力學模型參數的作用增加底物質量濃度，盡管增加了酶與底物總的可接性，但是對于單位質量的底物來說，其相對可接性（Kobs）是變小了，同時由于底物質量濃度增加，單位質量的酶失活作用（Ki）也表現的減少，因此導致單位底物的糖得率降低。當底物質量濃度較低，吸附到底物上的酶較少，大多數酶成游離狀態，底物處于飽和吸附狀態，因此當底物質量濃度增加，酶的可接性增加，底物吸附酶總量增加，但是單位重量的底物吸附的酶量減少，因而總的還原糖得率也降低。底物質量濃度增加，酶與底物的接觸面積越大，酶解率提高。已有研究證明酶催化反應不是底物質量濃度越高越好，底物質量濃度越高，意味著酶溶液體積相對變小，造成反應產物不易擴散，會抑制酶的水解，嚴重降低水解速率。

2.3.4 酶質量濃度對反應動力學模型參數的作用在一定酶質量濃度范圍內，隨著酶質量濃度的增加，增加底物質量濃度，可以增加單位底物酶可接性，因此在整個試驗范圍內，隨著酶質量濃度增加，Kobs，0逐漸增加，酶質量濃度增多，導致酶非反應位點之間的吸附以及游離酶的增加，即單位底物無效酶（Ki）含量也在逐漸增加。因此隨著酶質量濃度增加，糖得率增加是由于單位底物的酶可接近性增加產生。許多文獻報道纖維素分子能和酶分子的結合點數有限，當這些結合點全部被酶分子占據后，再增加纖維素用量，起不到酶解作用。

2.4 交互作用分析

在響應面分析中，等高線通常用于研究各種因素之間的交互作用，分析等高線圖，可以獲得最優響應值時各因素的取值。表5顯示，只有CD（酶溶度和底物濃度）交互作用達到顯著水平，說明其對糖得率影響顯著。因此分析了這兩個因素的交互作用。圖1顯示在實驗范圍內，酶質量濃度越高，底物質量濃度越低，其糖得率越高。該結果與單因素實驗結果一致。

通過對回歸方程18，19和20求解，得到獲得最大Ytrs的條件為：pH 4.4，水解溫度47℃，纖維素酶質量濃度為3 g/dL，底物質量分數5%。預測最大糖得率為0.485 4。可獲得最大Kobs，0的條件為：pH 7，水解溫度60 ℃，纖維素酶質量濃度為3% ，底物質量濃度5 g/dL。 預測最大Kobs，0為 0.474 0 h-1。 可獲得最小Ki值的條件為：pH 4.47，水解溫度47.40 ℃，纖維素酶質量濃度為1 g/dL，底物質量濃度5 g/dL，預測最小Ki值為0.055 8 h-1。綜上所述，獲得最大Ytrs，Kobs，0最小Ki的最優條件為：pH 4.84， 溫度48.9 ℃，纖維素酶質量濃度3 g/dL，底物質量濃度5 g/dL。

圖1 酶質量濃度和底物質量濃度對糖得率影響的響應面等高線圖Fig.1 Response surface plot combined effects of Enzyme concentration and Substrate concentration ratio on Sugar yield

2.5 Ytrs，Kobs，0 和 Ki的關系分析

因為Kobs，0等于k2[E0]/Km，[E0]是纖維素酶初始濃度，在實驗中是常數，Kobs，0與k2[E0]/Km成比例。k2是從酶-底物復合物到最終產物正向反應的速率常數。k2越大，Ytrs越大。米氏常數Km越小，親和力越大。因此，可以推斷Ytrs與Kobs，0呈正相關。Ki是水解反應期間無效酶的系數，因此較低的Ki表示較少的無效酶和更多的有效酶。因此，Ytrs與Ki是負相關。為了驗證這兩個推導，以表3中32小時糖得率為因變量，表4中的kobs，0和Ki為自變量，采用下列方程（21）進行非線性回歸分析：

其中，a，b，c和d分別為（Kobs，0）2，Kobs，0，（Ki）2和Ki的系數，e為常數。表 5顯示F試驗的F值（68.304）和t檢驗的p值（0.000）表明Ytrs與Kobs，0、Ki相關性非常顯著，分析的可信度極高。R2為0.919，高于R2為0.80的置信度[27]，以上均表明本模型的可預測性相對更可靠。調整R2為0.906，接近R2值，即模型具有良好適應性。

表6所有參數的系數均非常顯著（p=0.000）。其中（Kobs，0）2和（Ki）2的系數為負值證明Ytrs和Kobs，0或Ytrs和Ki的關系曲線呈現倒U形，Ytrs具有最大值。在將表5中的每項的系數引入等式（21）之后，得下式。

分別對Kobs，0、Ki求導得式（23）、（24）

令Ytrs′=0，Kobs，0=0.450 9 和Ki=0.053 8。 當Kobs，0＜0.450 9，Ki＜ 0.053 8 時，Ytrs′＞ 0，即Ytrs與Kobs，0和Ki顯著正相關。 相反，Kobs，0＞ 0.450 9 和Ki＞ 0.053 8，Ytrs′＜ 0， 即Ytrs與Kobs，0和Ki顯著負相關。 當Kobs，0=0.450 9，Ki=0.053 8 時，Ytrs達到最大值 0.604 0。 在表中，Kobs，0值大部分小于 0.450 9， 所有Ki值大于0.053 8，因此Ytrs與表征酶的初始活性和酶與底物的可及性的Kobs，0顯著正相關，與無效酶的系數Ki顯著負相關。

3 結語

對纖維素酶水解動力學進行了研究，建立了簡單的動力學模型，響應面設計給出了獲得最大Ytrs和Kobs，0以及最小Ki的條件。分析了不同因素在水解過程中對糖得率的影響和各因素之間的交互作用對糖得率的影響。獲得最大糖得率的條件為pH 4.41，溫度47℃，纖維素酶質量濃度3 g/dL和底物質量濃度5 g/dL。在最優條件下，最大Ytrs為0.4854，與實驗所獲得最大糖得率的0.442 9接近。溫度和pH主要通過改變無效酶系數影響糖得率，而酶和底物質量濃度主要改變酶對底物的可接性作用于糖得率；并進行了糖得率與動力學各參數之間的回歸線性分析，得到相關性大于0.9的結果。在試驗條件下，Ytrs與Kobs，0正相關，與Ki負相關。