植物乳桿菌FB-T9抑制變異鏈球菌及其生物膜形成的研究

張秋香， 黃 銀， 姚沛琳， 張 灝， 陳 衛(wèi)

（江南大學(xué) 食品學(xué)院，江蘇 無(wú)錫 214122）

齲病是由細(xì)菌引起的慢性感染性疾病，是一個(gè)連續(xù)礦化和脫礦化交替變化的過(guò)程[1]。牙齒表面的牙菌斑[2]是齲病發(fā)生的始動(dòng)因子，它是一種典型的生物膜，是由細(xì)菌分泌的物質(zhì)和細(xì)菌之間相互作用而形成的。變異鏈球菌（Streptococcus mutans）是公認(rèn)的人類口腔中最主要的致齲細(xì)菌[3]，它能高效利用蔗糖代謝產(chǎn)生乳酸，破壞牙體組織；并且具有很強(qiáng)的粘附能力和產(chǎn)多糖能力，會(huì)促進(jìn)牙齒表面致齲性生物膜的進(jìn)一步形成和發(fā)展[4]。此外12歲兒童恒牙齲齒的患病率為28.9%，而中年人齲齒患病率為88.1%，老年人齲齒患病率為98.4%，齲病總體狀況不容樂(lè)觀[5]。

現(xiàn)階段防治兒童齲病的常見(jiàn)方法[6]有氟化物的應(yīng)用、糖代替品的使用、養(yǎng)成正確的刷牙方法和頻率、定期口腔保健和兒童齲病風(fēng)險(xiǎn)性評(píng)估等。但含氟牙膏攝入過(guò)量時(shí)會(huì)導(dǎo)致氟斑牙，糖替代品的使用要求父母具有較強(qiáng)的識(shí)別觀念，機(jī)械去除牙菌斑的方法需考慮到兒童的接受性，定期口腔保健及風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估對(duì)家庭經(jīng)濟(jì)狀況的要求較高，因此尋找一種簡(jiǎn)單有效的齲病防治手段很有必要。近些年來(lái)，許多專家學(xué)者發(fā)現(xiàn)多種益生菌能通過(guò)抑制致病菌定殖、調(diào)節(jié)粘膜免疫等機(jī)制對(duì)牙周病、口臭以及口腔念珠菌病等口腔疾病的治療發(fā)揮作用[7]。口腔益生菌能競(jìng)爭(zhēng)性抑制口腔致病菌粘附和定殖，尤其可以減少唾液中變異鏈球菌的數(shù)量[8]。為降低齲病的發(fā)病率，適用于口腔健康的益生菌需要具備的首要生物特性是能夠抑制變異鏈球菌的生長(zhǎng)和生物膜的形成，并能在口腔黏膜和牙面粘附增殖[9]，對(duì)溶菌酶也具有一定的耐受力[10]。

作者通過(guò)抑制致齲細(xì)菌生長(zhǎng)和抑制致齲菌生物膜形成兩個(gè)指標(biāo)篩選得到性能良好的乳酸菌，探究待測(cè)菌株的菌株特性，及其對(duì)唾液包裹的羥磷灰石的粘附性和對(duì)溶菌酶的耐受性，以期得到能有效預(yù)防齲齒的優(yōu)良乳酸菌。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 樣品唾液、牙菌斑和口腔粘膜：無(wú)錫朝陽(yáng)口腔醫(yī)院提供；糞便樣品：取自江蘇如皋和廣西巴馬長(zhǎng)壽村老人，樣品收集后置于體積分?jǐn)?shù)30%甘油中-80℃保存。白菜葉、青菜葉等菜葉樣品:市售，采集后，進(jìn)行乳酸菌的分離和篩選。

1.1.2 菌種變異鏈球菌ATCC25175（Streptococcus mutans）：中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心提供。

1.1.3 培養(yǎng)基和主要試劑

1）MRS[11]：葡萄糖 20.0 g，蛋白胨 10.0 g，牛肉膏10.0 g，酵母粉5.0 g，三水合乙酸鈉5.0 g，檸檬酸氫二銨2.0 g，七水合磷酸氫二鉀2.0 g，七水合硫酸鎂0.2 g，四水合硫酸錳 0.05 g，吐溫-80 1.0 mL，蒸餾水 1 000 mL，pH 6.2± 0.2，0.1 MPa滅菌 20 min。用于乳酸菌的篩選和培養(yǎng)；

2）TSB[11]：胰蛋白胨 17.0 g，大豆蛋白胨 3.0 g，酵母浸膏6.0 g，葡萄糖2.5 g，氯化鈉5.0 g，磷酸氫二鉀 2.5 g，蒸餾水 1 000 mL，pH 7.2 ± 0.2，0.1 MPa滅菌20 min。用于變異鏈球菌的培養(yǎng)增殖。

1.1.4 主要試劑碳酸鈣，醋酸氯己定溶液（洗必泰），羥磷灰石，結(jié)晶紫，丙酮，無(wú)水乙醇，二甲苯，硝酸鉀，乙酸乙酯，氯仿，溶菌酶：中國(guó)醫(yī)藥集團(tuán)上海化學(xué)試劑公司產(chǎn)品；CFSE熒光染料：Invitrogen公司產(chǎn)品；PI染料：Sigma公司產(chǎn)品。

1.1.5 主要儀器UV-1800紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)：島津企業(yè)管理有限公司產(chǎn)品；D-78532 Tuttlingen冷凍離心機(jī)：德國(guó)RUMA-ZENTRIFUGEN公司產(chǎn)品；LSM710激光共聚焦顯微鏡：德國(guó)蔡司公司產(chǎn)品；MMLTISKAN GO酶標(biāo)儀：Thermo公司產(chǎn)品；M5熒光酶標(biāo)儀：Molecular Devices公司產(chǎn)品。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 乳酸菌的分離利用添加有15 g/L CaCO3的MRS培養(yǎng)基從樣品中篩選乳酸菌[12]，供后續(xù)實(shí)驗(yàn)備用。

1.2.2 拮抗S.mutans乳酸菌的篩選通過(guò)牛津杯瓊脂擴(kuò)散實(shí)驗(yàn)從得到的乳酸菌中篩選對(duì)變異鏈球菌具有拮抗作用的乳酸菌，具體實(shí)驗(yàn)方法參考姚沛琳[11]。將質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.02%醋酸氯己定溶液稀釋3倍后作為陽(yáng)性對(duì)照。

1.2.3 抑制S.mutans生物膜形成乳酸菌的篩選選取抑菌效果良好的乳酸菌進(jìn)一步篩選出能抑制S.mutans生物膜形成的菌株。生物膜標(biāo)本的制備、熒光染料的配制及染色主要依據(jù)Khan[13]等人的方法進(jìn)行；通過(guò)專業(yè)軟件處理得到生物膜厚度，并計(jì)算生物膜中活菌面積和死菌面積。生物膜中細(xì)菌量的變化用細(xì)菌總面積減少率來(lái)表示，即細(xì)菌總面積減少率（%）=（實(shí)驗(yàn)組－對(duì)照組）/對(duì)照組，通過(guò)比較形成的生物膜中的菌體面積減少率初步判定待測(cè)乳酸菌對(duì)變異鏈球菌的生物膜形成抑制與否[11]。

1.2.4 菌體性質(zhì)的測(cè)定

1）待測(cè)菌株自聚和共聚能力的測(cè)定 乳酸菌和變異鏈球菌均過(guò)夜培養(yǎng)12 h，3 000 r/min離心15 min后棄上清收集菌體，重懸于PBS中，調(diào)節(jié)均濃度為108CFU/mL。根據(jù)菌體單獨(dú)培養(yǎng)和混合培養(yǎng)時(shí)菌液上層吸光值分別判斷菌株的自聚和共聚能力，計(jì)算公式為：自凝集率其中At表示在2、4、16 h吸光值，A0表示t=0時(shí)刻的吸光值；交互凝集率其中Ax表示乳酸菌的吸光值，Ay表示變異鏈球菌的吸光值，Amix表示混合樣品的吸光值。

2）待測(cè)菌株自身生物膜形成能力測(cè)定 待測(cè)菌株自身生物膜形成能力的測(cè)定參考Wen[14]等人的方法進(jìn)行。實(shí)驗(yàn)方法稍有改動(dòng)：染色后用乙醇-丙酮混合液顯色，顯色后于酶標(biāo)儀600 nm處測(cè)定吸光度。

3）待測(cè)菌株表面疏水性和表面酸堿電荷測(cè)定 以二甲苯為疏水性有機(jī)溶劑測(cè)定待測(cè)菌株表面疏水性；選擇乙酸乙酯作為路易斯堿，氯仿作為路易斯酸，測(cè)定待測(cè)菌株表面酸堿電荷。乳酸菌表面疏水性和表面酸堿電荷的測(cè)定參考Samot.J[15]等人所描述的方法。將乳酸菌過(guò)夜培養(yǎng)12 h后，離心收集菌體，重懸于pH 6.2的0.1 mol/L KNO3中，在600 nm下調(diào)吸光度為0.6，記為A0；將1 mL有機(jī)溶劑加入到3 mL菌液中，在室溫下先預(yù)培養(yǎng)10 min，之后振蕩2 min，再在室溫下培養(yǎng)20 min，測(cè)定水相在600 nm下的吸光度，記為A1，計(jì)算公式：

菌體表面酸堿電荷的測(cè)定同上，將有機(jī)溶劑替換為乙酸乙酯和氯仿。

1.2.5 菌株綜合性質(zhì)分析對(duì)菌株性質(zhì)的測(cè)定結(jié)果采用主成分分析法[16]（Principal Component Analysis，PCA）進(jìn)行分析，從中得到綜合性能優(yōu)良的菌株進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.6 目的菌株的鑒定將分析得到的性質(zhì)良好的菌株進(jìn)行16S rDNA分子生物鑒定[17]，將其基因組進(jìn)行提取、PCR之后由測(cè)序公司測(cè)序，所得序列在NCBI上采用BLAST程序在GenBank基因庫(kù)中與已有的16S rDNA序列進(jìn)行相似性比較分析。

1.2.7 植物乳桿菌FB-T9不同時(shí)期介導(dǎo)對(duì)變異鏈球菌生物膜形成的影響作者選擇在S.mutans生物膜形成前期的0、6 h和12 h以及生物膜形成初期（24 h）和成熟后期（48 h）加入乳酸菌菌懸液進(jìn)行介導(dǎo)，利用激光共聚焦顯微鏡（CLSM）對(duì)生物膜進(jìn)行掃描拍照，判斷FB-T9介導(dǎo)對(duì)變異鏈球菌生物膜形成的影響。生物膜模型的建立和生物膜結(jié)構(gòu)的觀察參考Lynch[18]等人的方法，并稍作改動(dòng)。將S.mutans過(guò)夜培養(yǎng)12 h后，調(diào)節(jié)菌濃度為105CFU/mL，取1 mL菌液和3 mL蔗糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.25%的TSB液體培養(yǎng)基于直徑6 cm的玻璃培養(yǎng)皿中，將18 mm×18 mm規(guī)格的無(wú)菌蓋玻片作為生物膜形成載體置于培養(yǎng)皿中，在培養(yǎng)時(shí)間為第0、6、12 h時(shí)分別加入200 μL乳酸菌菌懸液，靜置培養(yǎng)24 h后取出玻璃片，染色、觀察。而在S.mutans24 h（或48 h）生物膜形成后介導(dǎo)的操作如下：在12 h（或24 h）更換3 mL新鮮TSB培養(yǎng)基，形成24 h（或48 h）S.mutans生物膜，去除培養(yǎng)皿中培養(yǎng)基，PBS洗滌玻片2次，去除表面浮游細(xì)菌，加入4 mL乳酸菌菌懸液，靜置培養(yǎng)24 h后，取出玻璃片，染色、觀察。

1.2.8 植物乳桿菌FB-T9對(duì)唾液包裹的羥磷灰石的粘附能力測(cè)定健康志愿者唾液的收集與處理以及唾液包被的羥基磷灰石（S-HA）的制備、待測(cè)乳酸菌的培養(yǎng)、熒光染色及菌體的粘附參考趙紅萍[19]等人的方法，在熒光酶標(biāo)儀上以激發(fā)波長(zhǎng)492 nm、發(fā)射波長(zhǎng)517 nm測(cè)定各孔的熒光值，扣除陰性對(duì)照組的熒光值，即為粘附菌的熒光值。細(xì)菌粘附率=粘附菌的熒光值/總熒光值×100%，其中總熒光值是只含有標(biāo)記的菌液、未加入羥基磷灰石測(cè)定的熒光值；陰性對(duì)照是只含有羥基磷灰石和PBS測(cè)定的熒光值。

1.2.9 植物乳桿菌FB-T9對(duì)溶菌酶的耐受能力的分析采用分光光度法考察FB-T9對(duì)溶菌酶的耐受情況。在96孔培養(yǎng)板中加入MRS培養(yǎng)基，再分別添加不同質(zhì)量濃度的溶菌酶溶液使得終質(zhì)量濃度分別為0.2～3.0 mg/mL。將乳酸菌培養(yǎng)物以體積分?jǐn)?shù)5%的接種量接種到96孔培養(yǎng)板中，37℃培養(yǎng)24 h，測(cè)定A600nm，即根據(jù)FB-T9的生長(zhǎng)情況判斷FB-T9對(duì)溶菌酶的耐受性。對(duì)照組只添加等體積的108CFU/mL乳酸菌培養(yǎng)物，溶菌酶溶液的量用等體積無(wú)菌水替代。

2 結(jié)果與討論

2.1 拮抗S.mutans乳酸菌的篩選

通過(guò)選擇性MRS培養(yǎng)基從樣品中篩選出乳酸菌，然后利用牛津杯瓊脂擴(kuò)散法篩選對(duì)變異鏈球菌具有抑制作用的菌株，抑菌結(jié)果如表1所示。

表1 乳酸菌對(duì)變異鏈球菌生長(zhǎng)的抑制Table 1 Inhibition of LAB strains on the growth of S.mutans

續(xù)表1

根據(jù)抑菌實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，選擇抑菌效果良好（抑菌圈在15 mm及以上）的菌株5D-3、PC-T4、LP-11、FB-T9、LPZ-14、381、430、438、7-1-18、12-22、13-15、24-35共12株菌進(jìn)行后續(xù)的篩菌實(shí)驗(yàn)。

2.2 抑制S.mutans生物膜形成乳酸菌的篩選

在0 h將待測(cè)菌株與變異鏈球菌一起培養(yǎng)24 h，使用共聚焦激光掃描顯微鏡觀察生物膜結(jié)構(gòu)，并計(jì)算各自的菌體總面積相對(duì)于空白組的減少率，結(jié)果如表2所示。

表2 不同菌株對(duì)變異鏈球菌生物膜形成的影響（±s）Table 2 Effect of LAB on S.mutans biofilm formation（±s）

表2 不同菌株對(duì)變異鏈球菌生物膜形成的影響（±s）Table 2 Effect of LAB on S.mutans biofilm formation（±s）

菌株編號(hào)減少率/%P C-T 4菌株編號(hào)-4 7.3 4±1.4 2 4 3 8 L P Z-1 4-3 0.9 3±1.0 2 3 3.5 9±0.6 5 5 D-3-4 3.5 6±0.9 1 7-1-1 8 4 5.1 2±1.7 1 6 0.3 3±1.8 7 F B-T 9 1 2-2 2減少率/%2 6.5 1±0.7 9 L P-1 1 3 8 1-6 2.0 9±1.0 3 1 3-1 5 4 7.5 7±0.6 6 4 3 0-3 4.7 1±0.6 7 2 4-3 5 1 3.8 0±0.8 6-6 0.1 5±1.1 0

有些乳酸菌如LPZ-14、FB-T9等對(duì)變異鏈球菌的生物膜的形成有抑制作用，而PC-T4、5D-3等則起到促進(jìn)作用。這種情況與姚沛琳[11]的測(cè)定結(jié)果具有相似性。具有防治齲病能力的益生菌，需要在抑制變異鏈球菌的同時(shí)能抑制其生物膜的形成。

2.3 待測(cè)菌株菌體性質(zhì)測(cè)定

2.3.1 待測(cè)菌株自聚能力的測(cè)定菌體的自聚能力與其黏附宿主細(xì)胞的能力有一定相關(guān)性，具有較強(qiáng)自凝集能力的菌株，定殖能力更好[20]。待測(cè)菌株的自聚能力過(guò)低說(shuō)明該菌株在口腔中的生長(zhǎng)繁殖能力較弱，不利于在口腔環(huán)境中的定殖；但薛龍[21]等人指出高自聚能力是一些口腔致病菌引起口腔疾病的一個(gè)重要原因，所以綜合而言初期自聚力較高而后期自聚力不強(qiáng)的菌株可能更具作為口腔益生菌的潛能。從表3的實(shí)驗(yàn)結(jié)果中可以看出，初期（4 h）待測(cè)菌株的自聚能力強(qiáng)弱不同（8.31%～35.09%），而此自聚結(jié)果整體偏低，可能原因是測(cè)定時(shí)間的不同和菌株的差異性。

表3 不同時(shí)間點(diǎn)待測(cè)菌株的自聚能力Table 3 Auto-aggregation ability of LAB at different time %

2.3.2 待測(cè)菌株共聚能力的測(cè)定益生菌與致病菌的共聚能力也是益生菌發(fā)揮益生功能的一個(gè)重要方面。如果益生菌能夠與口腔中浮游的致病菌發(fā)生共聚，隨著唾液的吞咽、口腔清理等行為，有助于減少口腔中浮游的致病菌數(shù)量，從而減少致病菌在口腔中的定殖。

由表4的實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，2 h時(shí)待測(cè)菌株的共聚能力較低，可能原因是初期的待測(cè)菌株主要發(fā)揮增殖作用和抑菌作用，而4 h的共聚能力明顯增大，說(shuō)明待測(cè)菌株開(kāi)始與變異鏈球菌發(fā)生相互凝集作用，且交互凝集率在7.3%～22.5%。菌株381、12-22、FB-T9、LPZ-14具有較為良好的共聚能力，說(shuō)明它們?cè)诳谇画h(huán)境中可能具備促進(jìn)浮游變異鏈球菌排除口腔的能力。

表4 不同時(shí)間下待測(cè)菌的共聚能力Table 4 Coagregation ability of LAB at different time %

2.3.3 待測(cè)菌株自身生物膜形成能力測(cè)定TORLAKOVIC[22]等人的研究表明除了變異鏈球菌，包括乳酸菌屬和雙歧桿菌屬在內(nèi)的菌種也可能與早期齲損的發(fā)展有關(guān)，作為益生菌菌株自身生物膜的形成至關(guān)重要。為了保證它們作為益生菌在口腔環(huán)境中不會(huì)促進(jìn)口腔生物膜的形成，其自身生物膜形成能力盡可能越低越好。由圖1的實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，相比于主要致齲菌S.mutans形成生物膜的能力，待測(cè)菌株自身生物膜形成能力普遍較低，其中菌株 381、430、FB-T9和 LPZ-14自身形成生物膜的能力相對(duì)低下，表明它們?cè)诳谇恢凶饔脮r(shí)可能不會(huì)促進(jìn)生物膜的形成。

圖1 待測(cè)菌株自身生物膜形成能力Fig.1 Biofilm formation ability of LAB

2.3.4 待測(cè)菌株表面疏水性測(cè)定菌株的表面疏水性越高，對(duì)上皮細(xì)胞的粘附性越好[23]。由圖2顯示的實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出菌株 PC-T4、FB-T9、438、13-15和24-35具有較高的疏水性，可能對(duì)口腔上皮細(xì)胞的粘附力強(qiáng)，更有利于有益菌株在口腔內(nèi)的定殖。

2.3.5 待測(cè)菌株表面酸堿電荷測(cè)定菌體的表面性質(zhì)，如表面疏水性和表面酸堿電荷與菌株之間及與宿主之間的非特異性粘附有關(guān)[24]，菌體表面具有較低的酸電荷和較高的堿電荷不會(huì)促進(jìn)生物膜的形成，反而能抑制其形成。由表5顯示的結(jié)果可以看出待測(cè)菌株FB-T9和438具有較理想的酸堿電荷性質(zhì)，這與它們能有效抑制變異鏈球菌生物膜形成量的結(jié)果保持一致。

圖2 待測(cè)菌株的表面疏水性Fig.2 Surface hydrophobicity of LAB

表5 待測(cè)菌株的表面酸堿電荷Table 5 Acid and alkali charge of the surface of LAB %

2.4 菌株性質(zhì)綜合分析

利用PCA分析方法來(lái)評(píng)價(jià)乳酸菌的菌株特性與抑制S.mutans生物膜形成的能力，從而篩選出具有潛在抑制S.mutans生物膜形成作用的乳酸菌。由因子載荷圖 3（a）可知，主要分成 4 個(gè)主成分：（1）第一主成分（PC1）在模型中的貢獻(xiàn)率為35.62%，特征是疏水性、酸電荷和堿電荷；第二主成分（PC2）在模型中的貢獻(xiàn)率為22.28%，特征是自聚能力；第三主成分（PC3）在模型中的貢獻(xiàn)率為16.24%，特征是自身生物膜形成能力；第四主成分（PC4）在模型中的貢獻(xiàn)率為13.66%，特征是共聚能力。因子評(píng)分圖3（b）和圖3（c）展示了潛在乳酸菌的分布。從因子評(píng)分圖3（b）上可以看出，在主成分1和主成分2上綜合得分高的有3株菌，分別為PC-T4、13-15和FBT9；從因子評(píng)分圖3（c）上可以看出，在主成分3和主成分4上綜合得分高的有兩株菌，分別為FB-T9和LPZ-14。綜合看來(lái)，菌株FB-T9表現(xiàn)出較高的綜合能力。結(jié)合篩菌結(jié)果，在抑菌作用和抑制變異鏈球菌生物膜形成性質(zhì)上表現(xiàn)良好的菌株為FB-T9。

圖3 主成分分析乳酸菌菌株特性Fig. 3 Graphical representation of the principal component analysis of LAB properties

2.5 目的菌株的鑒定

基于16S rDNA基因兩端的保守序列，對(duì)菌株FB-T9進(jìn)行分子鑒定，結(jié)果表明菌株FB-T9的16S rDNA序列與植物乳桿菌序列具有100%的同源性，可以初步判定菌株FB-T9為植物乳桿菌。

2.6 植物乳桿菌FB-T9介導(dǎo)對(duì)變異鏈球菌生物膜形成的影響

根據(jù)唐子圣[25]等人的研究結(jié)果，變異鏈球菌早期生物膜經(jīng)過(guò)24 h已經(jīng)基本形成，形成規(guī)律具體如下：0 h細(xì)菌開(kāi)始粘附；6 h細(xì)菌開(kāi)始定殖，是生物膜典型結(jié)構(gòu)形成的關(guān)鍵時(shí)期；到12 h，早期生物膜開(kāi)始形成；24 h時(shí)早期生物膜已經(jīng)基本形成；而到48 h，變異鏈球菌生物膜已經(jīng)成熟。

為考察植物乳桿菌FB-T9的介導(dǎo)時(shí)間對(duì)變異鏈球菌生物膜的影響，在0、6、12 h時(shí)分別在變異鏈球菌培養(yǎng)液中加入FB-T9，隨后培養(yǎng)至24 h，通過(guò)激光共聚焦顯微鏡觀察變異鏈球菌的生物膜結(jié)構(gòu)。隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加，從 24 h（圖 4（a））到 48 h（圖4（b）），陰性對(duì)照組中S.mutans生物膜的熒光強(qiáng)度和面積增大，結(jié)構(gòu)逐漸變得致密，生物膜的形成量也逐漸增大。在0 h（圖4（c））加入FB-T9介導(dǎo)培養(yǎng)至24 h后，熒光強(qiáng)度極低，說(shuō)明FB-T9嚴(yán)重抑制了S.mutans的粘附；在 6 h（圖 4（d））介導(dǎo)后培養(yǎng)至 24 h，能看到零散的橘色熒光，死菌較多，說(shuō)明前6 hS.mutans開(kāi)始粘附，但之后由于FB-T9的加入，抑制了S.mutans的定殖；而在 12 h（圖 4（e））介導(dǎo)時(shí)，由于S.mutans已成功定殖，菌體熒光面積逐漸增大，但呈現(xiàn)出分散的橘色熒光，說(shuō)明S.mutans的生長(zhǎng)和生物膜的形成受到了抑制。

圖4 激光共聚焦顯微鏡下的生物膜結(jié)構(gòu)圖Fig.4 CLSM images of biofilm structure

為考察S.mutans生物膜形成后FB-T9的抑制作用，在24 h時(shí)加入FB-T9介導(dǎo)，培養(yǎng)到48 h觀察生物膜結(jié)構(gòu)。可以看到在24 h（圖4（f））介導(dǎo)時(shí)由于S.mutans生物膜已經(jīng)基本形成，呈現(xiàn)出小面積的團(tuán)狀結(jié)構(gòu)，且相對(duì)于12 h（圖4（e））介導(dǎo)后的生物膜結(jié)構(gòu)致密，但對(duì)比24 h陰性對(duì)照（圖4（a）），綠色熒光面積很少，主要呈現(xiàn)出橘色熒光，說(shuō)明FB-T9對(duì)生物膜中的菌體有明顯抑制作用，但在結(jié)構(gòu)上沒(méi)有明顯的破壞作用；而在48 h時(shí)介導(dǎo)，由于S.mutans生物膜已經(jīng)成熟，生物膜呈現(xiàn)致密的團(tuán)塊狀結(jié)構(gòu)，菌落聚集融合，但是相較于48 h的陰性對(duì)照 （圖4（b）），除了生物膜中的死菌面積明顯增大以外，生物膜結(jié)構(gòu)沒(méi)有顯著變化，說(shuō)明在S.mutans生物膜成熟以后FB-T9的介導(dǎo)效果并不理想。從而可推斷，植物乳桿菌FB-T9在S.mutans生物膜形成前期的介導(dǎo)效果較好，能顯著抑制變異鏈球菌的粘附和定殖，對(duì)其生物膜結(jié)構(gòu)的形成表現(xiàn)出明顯的抑制作用，且對(duì)于減少各時(shí)期生物膜中的活菌面積有顯著效果。

2.7 植物乳桿菌FB-T9對(duì)唾液包裹的羥磷灰石粘附能力的測(cè)定

人類牙齒的主要成分為羥磷灰石，體外利用SHA模擬人口腔牙齒，考察植物乳桿菌FB-T9對(duì)牙面的粘附能力。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：植物乳桿菌FB-T9對(duì)S-HA的粘附率為32.93%，顯著低于變異鏈球菌對(duì)S-HA的粘附率 （P＜0.05）。這表明植物乳桿菌FB-T9對(duì)牙面的粘附性相對(duì)較低，不會(huì)在牙齒表面大量聚集，對(duì)牙齒酸蝕威脅的可能性較小。

2.8 植物乳桿菌FB-T9對(duì)溶菌酶的耐受能力的分析

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：在0～1.2 mg/mL質(zhì)量濃度下的溶菌酶基本不影響植物乳桿菌FB-T9的生長(zhǎng)，但是當(dāng)溶菌酶質(zhì)量濃度高達(dá)1.4 mg/mL時(shí)，菌體生長(zhǎng)吸光值發(fā)生突然變小，可能原因是在植物乳桿菌FBT9的對(duì)溶菌酶耐受的臨界質(zhì)量濃度介于1.2～1.4 mg/mL之間，即植物乳桿菌FB-T9對(duì)溶菌酶的最高耐受質(zhì)量濃度為1.2 mg/mL[26]。作者的實(shí)驗(yàn)結(jié)果遠(yuǎn)遠(yuǎn)高出人口腔唾液中溶菌酶質(zhì)量濃度（0～57 μg/mL），這說(shuō)明該菌株具備在口腔環(huán)境中存活的能力。

圖5 植物乳桿菌FB-T9在不同質(zhì)量濃度溶菌酶下培養(yǎng)24 h的生長(zhǎng)情況Fig.5 Growth of L.plantarum FB-T9 at 24 h in different concentrations of lysozyme

3 結(jié) 語(yǔ)

從健康人的糞便中分離得到一株對(duì)變異鏈球菌的生長(zhǎng)及生物膜形成具有抑制效果的植物乳桿菌FB-T9。L.plantarumFB-T9的早期介導(dǎo)能顯著抑制S.mutans的粘附和定殖，進(jìn)而抑制生物膜形成，且能有效減少生物膜中的活菌面積。此外，該菌對(duì)牙面表現(xiàn)出較低的粘附率，并在遠(yuǎn)高于口腔溶菌酶濃度的條件下，表現(xiàn)出良好的耐受性，說(shuō)明FBT9具備作為口腔益生菌的潛能。由于L.plantarumFB-T9在《可用于食品的菌種》名單之列，可以作為安全益生菌株添加于食品中，以咀嚼片或奶片的形式作為日常口腔益生菌產(chǎn)品在預(yù)防兒童和成人口腔齲齒上發(fā)揮作用。