Mcl-1蛋白表達在卵巢癌發生發展中的作用

曹小飛，李思妹，趙美玲，林云安，向 琪，楊方方，劉國龍，關明媚

（廣州市第一人民醫院 腫瘤科，廣東 廣州 510180）

目前，隨著臨床上對于凋亡相關基因與惡性腫瘤的發生與發展間相關性研究的深入，多項研究報道髓樣細胞白血病-1（myeloid cell leukemia-1，Mcl-1）在宮頸癌、肝癌、淋巴瘤以及肺癌等腫瘤組織中的陽性率明顯升高。多位學者進一步研究表明肝癌、胰腺癌、結直腸癌及胃癌等癌組織Mcl蛋白表達水平與腫瘤臨床分期相關，但其在卵巢癌中表達及與臨床分期的關系研究較少。本文中將采用免疫組化Envision法，探討Mcl-1在卵巢癌組織與健康組織中的表達差異，以總結其卵巢癌發生發展中的臨床指導意義。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

病程2～7年，平均（4.07±1.55）年；TNM分期（美國癌癥聯合委員會，AJCC）：Ⅰ期40例、Ⅱ期29例、Ⅲ期33例、Ⅳ期11例；其中粘液性癌46例、漿液性癌37例、交界性腫瘤40例；所有標本均經2名經驗豐富的病理科醫生診斷。另外，選取正常卵巢組織標本（20例）與卵巢囊腺瘤組織標本（40例）作為對照組。

1.2 方法

1.2.1 樣本采集

各組分別于正常卵巢組織、卵巢腫瘤周圍組織以及卵巢腫瘤癌變組織進行切片取樣，所有標本經常規組織處理。

1.2.2 試劑

免疫組化SP試劑盒：北京中杉金橋生物技術有限公司

DAB顯色試劑盒：北京中杉金橋生物技術有限公司

兔抗人Mcl-1多克隆抗體：Santa Cruz公司

0.01 mol/L檸檬酸型抗原修復緩沖液（100×）：福州邁新生物技術有限公司

酶底物顯色劑DAB試劑盒：中杉金橋有限公司

蘇木素復染液：福州邁新生物技術有限公司

1.2.3 檢測方法

（1）免疫組化：石蠟包埋，連續切片（4 μm），脫蠟至水，室溫下在3%H2O2中孵育15 min，血清封閉，加入抗Mcl-1抗體孵育8 h（4℃），后用羊抗兔IgG孵育15 min（37℃），再以辣根酶標記鏈霉卵白素孵育15 min（37℃），DAB顯色。以扁桃體組織切片作為陽性對照，PBS為陰性對照。

（2）免疫熒光：將細胞經種板、轉染、干擾、刺激等處理后用新鮮的多聚甲醛（4%）固定10 min，并用0.2%～0.5%TritonX-100對細胞進行透化處理；加入抗熒光淬滅封片劑封片，并于1周后在顯微鏡下鏡檢。

圖1 Mcl-1蛋白在卵巢癌中呈陽性表達

圖2 Mcl-1蛋白在卵巢囊腺瘤中呈陽性表達

Mcl-1蛋白免疫組化染色以細胞質、胞核中出現棕黃色顆粒為陽性細胞（見圖1，2），在高倍鏡（×400）視野下綜合染色強度和陽性細胞所占比例進行半定量測定。染色強度評分標準：不著色為0分，著淡黃色者為1分，著棕黃色者為2分，著深棕色者為3分。每張切片隨機觀察5個視野，計數500個細胞中陽性細胞所占比例進行評分，評分標準：陽性細胞數＜10%者為0分，10%～30%者1分，31%～60%者2分，＞60%者3分。兩項評分相加，0～1.0分為（-），1.1～2.0分為（+），2.1～3.0分為（++），3.1～5.0分為（+++）。（-～+）為陰性，（++～+++）為陽性。

1.3 TNM分期

1.4 統計學方法

本組研究中，所有數據的統計學計算均采用SPSS 15.0軟件進行，其中計數資料采用百分比（%）表示，數據對比采取x2校驗，當P＜0.05時認為差異具有統計學意義。

2 結 果

2.1 Mcl蛋白在不同臨床分期的卵巢癌組織中表達

Mcl-1蛋白在卵巢腫瘤Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期、Ⅳ期癌變組織中的陽性率分別為54.76%、64.29%、76.67%和92.31%，其陽性率與臨床分期相關（P＜0.05）。見表1。

表1 不同臨床分期Mcl-1蛋白陽性率對比（n，%）

2.2 Mcl-1蛋白在正常卵巢組織、卵巢囊腺瘤組織以及卵巢癌組織中的表達

Mcl-1蛋白在正常卵巢組織、卵巢囊腺瘤組織以及卵巢癌組織中的陽性率分別為5%，32.5%和67.26%，卵巢癌組織的陽性率與其他組織比較差異顯著（P＜0.05），見表2。

表2 不同組織Mcl-1蛋白陽性率對比（n，%）

3 討 論

隨著現階段臨床中關于腫瘤的發生與發展研究的深入，國內外關于凋亡相關基因與惡性腫瘤相關性的報道越來越多，其中Mcl-1、ARIDIA、PDCD4與PDCD5最為熱門。細胞凋亡（aPoPtosis）屬于基因編碼的程序性細胞死亡，在生物體發育、防御及自穩中起重要作用。細胞凋亡并不是一種病理條件下的自體損傷現象，而是主動過程，在凋亡期間會出現激活、表達以及調控等變化，進而為細胞在生存環境爭取更高的生存能力，如果凋亡功能被抑制時，可能會導致淋巴瘤、白血病、多發性骨髓瘤、肝癌、肺癌以及前列腺癌等惡性病變的發生。

Bcl-2蛋白家族己經是被公認的調節凋亡的重要因子，髓樣細胞白血病-1（Myeloid cell leukemia-1，Mcl-1）是Bcl-2家族中重要的抗凋亡成員之一，最早定位在線粒體外膜上，其過度表達在惡性腫瘤早期診斷、治療效果監測等過程中具有至關重要的作用。

多項研究發現Mcl-1在多種消化系腫瘤中過表達，提示Mcl-1對腫瘤的發生、發展起重要作用[5,6]。何勝悅等和趙靜等發現結直腸癌癌組織的陽性率高于結腸癌非癌組織（P＜0.05），其表達與結直腸癌TNM分期、有無淋巴結轉移及5年生存期有關(P＜0.05)，提示Mcl-1蛋白在結直腸癌發生、發展中起重要作用,可作為結直腸癌病理診斷、治療和預后判斷的指標。李峰等[5]研究發現肝癌組織Mcl-1陽性表達率顯著高于對照組（t＝7.835，P＜0.05），其表達與腫瘤有無壞死和TNM分期有關（x2＝4.201，P＜0.05），提示Mcl-1蛋白可能參與了肝硬化的發生、發展及向肝癌的惡性轉化。

多項體外試驗研究從反面證實了Mcl-1蛋白在卵巢癌發生發展中的重要作用。魏建勛等[20]研究發現米托蒽醌能抑制卵巢癌COC1細胞的增殖，誘導其凋亡，此作用可能與米托蒽醌抑制COC1細胞中的Mcl-1表達有關。胡軼等研究表明組蛋白去乙酰化酶抑制劑曲古菌素A、硼替佐米聯合應用于人卵巢癌細胞株SKOV3后卵巢癌凋亡相關蛋白Mcl-1及細胞凋亡率低于單獨用藥組（P＜0.05），低劑量的曲古菌素A和硼替佐米聯合作用誘導人卵巢癌細胞系凋亡機制可能是下調Mcl-1蛋白表達。徐長華等研究3,3'-二吲哚甲烷能顯著抑制卵巢癌SKOV3、A2780細胞的增殖、誘導其凋亡.綜上所述Mcl-1蛋白在卵巢腫瘤組織中的表達陽性率與癌分期密切相關，正反方面說明其在卵巢腫瘤的發生發展過程中起重要作用，可以作為卵巢腫瘤臨床診斷與療效評價的重要指標。