早搏靈對氯化鋇誘導的心律失常大鼠T型鈣離子通道mRNA表達的影響

陳波,金錦玉,周亞濱,張琪,于曉紅,徐京育,張雪松,宋雪,張瑜,牛雯穎

(1.黑龍江中醫藥大學附屬第一醫院，黑龍江 哈爾濱 150040；2.黑龍江中醫藥大學，黑龍江 哈爾濱 150040；3.哈爾濱市穆斯林醫院，黑龍江 哈爾濱 150001)

心律失?？煞譃榭焖傩院途徛詢煞N，快速性主要以早搏、心動過速、房顫、房速、室速及室顫等居多，是心血管疾病中重要的疾病。本實驗以復方中藥早搏靈為實驗藥物，前期觀察，早搏靈能夠改善患者臨床癥狀，對早搏有抑制作用，為進一步觀察作用機理，以氯化鋇誘導快速性心律失常大鼠，觀察早搏靈對T型鈣離子鈣離子通道α1H亞基表達的影響。

1 實驗材料與方法

1.1 實驗動物

選取清潔級Wistar大鼠40只，雌雄各半，體質量(227.51±6.44)g，選取的動物由哈爾濱醫科大學實驗動物學部提供動物合格證號SCXK(黑)2013-001。

1.2 實驗藥物

早搏靈膠囊由紅參10 g,當歸15 g,黃芪20 g,山楂15 g,麥冬15 g,青皮15 g,黃芩15 g,苦參15 g,丹參15 g,等組成，由黑龍江中醫藥大學附屬第一醫院制劑室制備，黑藥制字Z20110063，批號：20170324；鹽酸維拉帕米片,批號：161001，天津市中央藥業有限公司。氯化鋇(分析純),批號：20160401，天津市光復科技發展有限公司；水合氯醛(分析純),批號：20151215，天津市光復精細化工研究所；生理鹽水,批號161104D12，哈爾濱三聯藥業股份有限公司。

1.3 實驗儀器

十六導生理記錄儀MP150(BIOPAC Systems,Inc.),熒光定量PCR儀(美國bio-rad公司),BECKMAN低溫超速離心機(美國貝克曼庫爾特有限公司),TGL-16G型高速臺式離心機(上海醫用分析儀器廠)。

1.4 實驗方法

1.4.1 分組及給藥方法

選用健康大鼠40只,隨機分4組,維拉帕米對照組，生理鹽水組,早搏靈膠囊組，模型組,每組10只，每日灌胃給藥1次，連續1周。模型組、空白組予以生理鹽水10 mL/kg灌服 ；中藥防治組予34.6 mg/mL的早搏靈溶液10 mL/kg灌服 ；對照組予以3.32 mg/mL的維拉帕米溶液10 mL/kg灌服。末次給藥1 h后，記錄正常心電圖，然后用5%水合氯醛(10 mg/kg)腹腔注射麻醉后,再經大鼠舌下靜脈注射氯化鋇(8 mg/kg)，同時描記大鼠心電圖變化，包括注射后0 min，1 min,3 min,5 min,10 min,20 min，間隔10 min進行一次記錄，至心電圖和心率回復正常。氯化鋇造模后，大鼠出現不同程度的惡性心律失常。心電觀察完畢后，取心肌組織，液氮凍存后置于-80℃冰箱保存。采用熒光定量實時PCR技術觀察心肌組織鈣通道基因α1H的變化。

1.4.2 實時熒光PCR條件及方法

采用總RNA提取試劑盒(TIANGEN)提取組織中總mRNA，經過紫外分光光度計，檢測OD260/OD280，計算RNA的濃度與純度。用cDNA試劑盒(transgen)將5 μg的mRNA逆轉錄成cDNA。以2 μL的cDNA為模板，利用針對α1H設計的引物(正向5′-AAGATGAGCCCTCCCTGCAT-3′；反向5′-GTAGTGTTGCCTCCTTCGGC-3′)、Kir2.1設計的引物(正向5′-TCGATAGCGGAATCGACCGT-3′；反向5′-ATGAACTCCGGCATTGCGTT-3′)和SCN5設計的引物(正向5′-CCAGAGTGCCAGGAATCAGC-3′；反向5′-GGCCTTCATGTCCGCTATGG-3′)，PCR擴增特異性片段。PCR的反應條件如下：a:95℃ for 1 min,b:95℃ for 0:10,c:60℃ for 30 s(+Plate Read),d:Go To b 39 more times,e:Melt Curve 65 to 95℃,increment 0.5℃ for 5 s(+Plate Read)，針對GAPDH的PCR產物作為平行參照(GAPDH:正向引物5′-AGCTTCGGCACATATTTCATCTG-3′；反向引物5′-CGTTCACTCCCATGACAAACA-3′)。

1.4.3 統計學分析

2 結果

2.1 早搏靈膠囊對大鼠心律失常持續時間的影響 見表1

表1 氯化鋇造模后大鼠心律失常持續時間的比較

注：與模型組比較，*P<0. 05

給予灌胃給藥相應計量氯化鋇后，生理鹽水組沒有一例發生快速性心律失常。經統計學數據分析后顯示:早搏靈膠囊組、模型組與維拉帕米組經檢驗符合正態性。三組快速性心律失常持續時間經單因素方差分析，具有極顯著性差異(P<0.01)。在此之后行LSD-t檢驗，其中模型組與維拉帕米組、模型組與早搏靈組與比較，心律失常持續時間均縮短，有顯著差異性(P<0.01);早搏靈組與維拉帕米組比較，差異不具有統計學意義(P>0.05)，證明兩者均可降低心律失常持續時間，因此不能證明兩者在心律失常持續時間的影響上有差異。

2.2 各組大鼠鈣離子通道α1H亞基表達結果

表2 各組大鼠鈣離子通道α1H亞基表達結果

注：基因差異表達倍數>1為高表達，<1為低表達；<0.5或>2為有顯著性

從表2中看出，經大鼠舌下靜脈注射氯化鋇，當大鼠出現快速性心律失常后，早搏靈膠囊組與模型組相比，T型鈣通道α1H亞基為低表達，有顯著性差異，證明早搏靈膠囊對T型鈣通道α1H亞基表達有抑制作用；維拉帕米組T型鈣通道α1H亞基為高表達，說明維拉帕米對T型鈣通道α1H亞基表達無明顯抑制作用。

3 討論

早搏靈膠囊具有益氣養陰、理氣活血之功效。早搏靈膠囊方中以紅參為君藥，長于大補元氣，又能安神生津。臣藥有黃芪、當歸、丹參。黃芪是補氣之要藥，與紅參相配伍，令氣旺血行，達到瘀去絡通作用。麥冬具有生津養陰、清心除煩之功,與紅參相伍益氣養陰復脈是生脈,散主藥。當歸補血養血又活血,山楂行氣散結。丹參祛瘀止痛，又有安神養心定志作用。青皮為佐藥行氣活血。黃芩、苦參清熱防藥物過于滋膩?，F有藥理學研究發現，早搏靈膠囊中黃芪、當歸等可以作用于鈣離子通道，調節細胞內Ca2+濃度，心肌細胞膜上的Ca2+內流減少，細胞內Ca2+超載的現象降低，心肌細胞膜結構得到穩定，保護心肌，從而心肌組織傳導性得到改善，可以對抗各種原因引起的快速性心律失常[1-2]。

氯化鋇造模，誘發大鼠出現快速心律失常，具有多樣性和復雜性的特點，其作用原理是氯化鋇可以抑制鈉-鉀泵，導致細胞內鈉高鉀低，同時因鈉-鈣交換，使細胞內鈣超載，鈣過量的結果可誘發快速性心律失常[3]?，F代研究表明，通過調控鈣離子通道，可有效治療快速性心率失常[4]。鈣離子進入細胞內，主要有兩種方式，分別是化學門控式和電壓門控式。在血管平滑肌中主要的電壓門控式鈣通道分為L型和T型兩種電壓門控式鈣通道。T型鈣通道可參與心臟的起搏活動，如果T型鈣通道被完全阻斷心臟起搏活動就可以減慢20%。研究發現，心房起搏細胞上的T型鈣流比非起搏細胞要大,當阻斷T型鈣流，可以減慢心率，達到控制快速心律失常作用[5]。近年來的研究多支持 T 型鈣通道功能的異常與心血管疾病有密切聯系。T型鈣通道具有快激活、快失活、慢去活、單通道電容小，以及低電壓激活(-60 mV)的特性，因此被稱為低電壓激活鈣離子通道。T型鈣離子通道在心臟心肌傳導組織、動脈血管壁上、以及神經激素釋放的部位中含量較高, 因此在興奮傳導電流時生理病理意義非常重要[6]。在脊椎動物中，T 型鈣離子通道包括3個不同的α1亞基基因: CACNA1G、CACNA1H、CACAN1I，分別編碼 α1G、α1H、和α1I[7]。每個α1亞單位在膜電位發生變化時可以控制通道的開放和關閉[8]。在某些病理狀態下的心臟疾病中，T型鈣通道可以阻斷鈣離子由細胞外向細胞內的過多內流，而參與細胞內鈣離子的調控，從而減少細胞內鈣離子過多的現象，減少心律失常的發生[9]。近兩年有研究，同樣發現心律失常的原因可能與心室肌T型鈣通道表達增多有關[10]。T型鈣通道在心肌癥狀發展過程中可能對心肌細胞的重塑起重要作用[11]。

本實驗研究結果表明，比較心肌組織T型鈣通道α1H亞基表達水平，早搏靈組T型鈣通道α1H亞基與模型組比較顯著低表達。早搏靈組與維拉帕米組相比較，早搏靈組心肌組織T型鈣通道α1H亞基表達水平下調，而維拉帕米組與模型組無差異性，說明在T型鈣離子通道α1H亞基拮抗作用方面，早搏靈膠囊優于維拉帕米。早搏靈作用機制可能是下調T型鈣離子通道α1H亞基表達，減少病理狀態下心肌組織內Ca2+過多內流，從而減少細胞內鈣離子超載狀態。這可能是其治療快速性心律失常的機制之一[12]。

4 結語

當今，心血管疾病已嚴重危害人們身體健康，特別高發于中老年人群，具有患病率高、致殘率高和死亡率高的特點，快速心律失常持續發作如果治療不及時，最終結果可導致病人猝死。在今后的研究實驗中應該更深入、更全面地掌握中藥抗心律失常的作用機制，在臨床實踐中進行更大樣本、更細致的研究，使中醫藥在治療快速型心律失常方面的水平得到進一步提高。