針刺治療大鼠酒精戒斷焦慮征的作用機制

邢宇雙，林娜，梁啟超，楊志*，吳宜艷*

(1.齊齊哈爾醫學院，黑龍江 齊齊哈爾 161006；2.牡丹江醫學院，黑龍江 牡丹江 157011)

酒精依賴不僅損害個人健康，更是家庭暴力和犯罪的重要根源。焦慮和抑郁等為代表的酒精戒斷征是酒精依賴的主要負性強化效應，是酒精成癮者復飲乃至嚴重依賴的重要誘因，因此緩解和防止酒精戒斷焦慮征一直被視為治療酒精依賴的最有效手段之一[1]。

針刺作為中醫的兩大支柱之一，具有療效穩固，操作安全簡單和無成癮性等優點，自古以來被廣泛用于成癮藥物的脫敏和脫毒治療。近30年以Bullock等人為代表的一些國內外學者們通過隨機對照臨床實驗證明了針刺療法對酒精依賴的治療效果，并觀察到針刺人體一些特定穴位顯著減輕了酒精依賴者對酒精的渴望程度，同時明顯減少了他們的飲酒次數和飲酒量，為針刺療法在酒精依賴中的應用提供了強有力的臨床支持[2]。2005年，Kim等人報告了針刺足三里和三陰交穴位調節大腦紋狀體和伏隔核多巴胺神經的興奮性，抑制大鼠過度運動，肌肉僵硬和震顫等酒精戒斷機體癥狀的實驗結果[3]。最近幾年針刺治療酒精戒斷焦慮征的研究尤其受到我國學者們的重視，2010年,張雅紅等人在國家自然基金項目資助下，完成了電針治療改善酒精依賴住院患者情緒的研究[4]。

在焦慮樣癥狀的產生以及表達中，機體常伴隨著CRH-ACTH-腎上腺內分泌反應軸的功能亢進。促腎上腺皮質激素釋放(Corticotropin releasing hormone，CRH)調節內分泌、自主神經、中樞神經和行為反應，是機體應答應激刺激的重要神經肽。第二信使環磷酸腺苷(Cyclic adenosine monophosphate，cAMP)的效應元件作為順勢增強子位于CRH基因的上游調節區，與其轉錄活性密切相關。由此我們假設：酒精戒斷過程中，cAMP和CRH的濃度上升終產生焦慮。中醫學認為，焦慮癥之神志不安多由臟腑功能失調、氣機失常所致, 涉及到心、肝、脾以及腎。足三里為足陽明胃經合穴，三陰交，足三陰經的交會穴，起到疏肝調肝、健脾化痰、補虛培元，對治療焦慮癥狀具有非常重要的作用。綜上所述，本實驗欲在動物實驗水平觀察和證明針刺三陰交、足三里對大鼠酒精戒斷焦慮樣癥狀的治療作用，探究其作用機制，為針刺療法防治酒精復飲提供實驗和理論依據。

1 實驗材料

1.1 實驗動物

SPF級雄性SD大鼠，體質量220～250 g。哈爾濱醫科大學動物實驗中心提供，質量合格證號：23001700000704。實驗動物飼養在SPF級實驗室，溫度(22.0±2.0)℃，食物和水供應充足。

1.2 主要實驗試劑

cAMP酶聯免疫檢測試劑盒：南京建成生物工程研究所；CRH酶聯免疫檢測試劑盒：南京建成生物工程研究所。

1.3 實驗儀器

針刺針(華佗牌)：廣州得源醫療器械有限公司； 電針儀(BT701-1B)：上海華誼醫用儀器有限公司； 旋渦混合器(XH-D)：上海比朗儀器有限公司；高架十字迷宮：上海欣軟信息科技有限公司；恒溫培養箱：上海博訊實業有限公司醫療設備廠；酶標儀(M3)：MolecularDevices。

2 實驗方法

2.1 實驗動物分組、酒精成癮模型的建立及治療

選取健康SD大鼠54只，隨機分為空白組(生理鹽水)，模型組(20%Eth)，電針兩穴組(20%Eth+電針單側足三里、三陰交)，針刺兩穴組(20%Eth+針刺單側足三里、三陰交)，三陰交組(20%Eth+針刺單側三陰交)，足三里組(20%Eth+針刺單側足三里)。除空白組外，其余5組每天腹腔內注射20%(w/v)酒精1.5 mL/100 g，共28 d，制備酒精成癮模型[5]，撤酒精3 d，制備酒精戒斷焦慮征模型，撤酒精期間分別針刺相應的穴位進行治療，治療前先將大鼠固定在自制的綁鼠臺上，用酒精進行消毒，電針兩穴組進行治療時，針刺單側足三里、三陰交，針柄接上電針儀，選用疏密波，頻率為15/25 Hz，電流為1～2 mA，刺激的強度以大鼠被針刺側的下肢輕微顫抖為度。每天進行1次，每次針刺30 min，連續治療3 d，空白組和模型組在相同的時間進行與針刺組相同的固定，但不進行針刺治療。

2.2 行為學指標測試

實驗室內光線昏暗并保持恒亮，室溫24℃，保持安靜。將每只大鼠置于高空十字架(EPM)的正中央釋放，每只大鼠測試時間為5 min。每一只動物完成測試后，清理糞便，并對裝置用酒精進行徹底清潔消毒。

測試指標：進入到開放臂次數(OE)：即進入到任一開放臂的次數，以大鼠4個爪均進入到臂內開始，中途有1個爪從該臂中完全撤出，視為該次進入活動完成；進入到開放臂時間(OT)：進入到開放臂停留的時間，單位：秒(s)；進入到閉合臂次數(CE)：即進入到任一閉合臂的次數，以大鼠4個爪均進入到臂內開始，中途有1個爪從該臂中完全撤出，視為該次進入活動完成；進入到閉合臂時間(CT)，進入到閉合臂停留的時間，單位：秒(s)。由以上指標分別計算出：①進開放臂次數比例OE%=OE/(OE+CE)×100%；②開放臂停留時間比例OT%=OT/(OT+CT)×100%

2.3 ELISA測CRH、cAMP濃度

所有大鼠都完成高架十字迷宮(EPM)測試后，立即將每只大鼠斷頭處死，剪開顱蓋和腦膜，剝離組織后，將大腦放在冰盤上，迅速取出左右兩側海馬，稱重后，立刻放入-80℃的液氮中保存，之后轉移到-80℃低溫冰箱里存放。將試劑盒在室溫下平衡半小時。配置標準品稀釋液，濃度分別為480、240、120、60、30 nmol/L。取海馬，勻漿，離心，取上清，待測?？瞻卓撞患訕樱患语@色劑A、B和終止液用于調零；標準品孔，每孔加入稀釋好的標準品50 μL，零孔加入標準品/樣品稀釋液50 μL，然后加入辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)試劑50 μL；樣品孔，加入樣品50 μL，然后加入HRP試劑50 μL。輕輕搖晃，蓋上封板膜，37℃培養箱中孵育60 min。洗滌5次，拍干。在每個孔內先加入顯色劑A 50 μL，隨后加入顯色劑B 50 μL，輕輕震蕩以混勻，37℃下避光顯色，顯色10 min。每孔加終止液50 μL，終止反應。以空白孔調零，450 nm波長依序測量各孔的吸光值(OD值)。測定在加入終止液后的10 min內進行。

2.4 統計學方法

3 實驗結果

3.1 針刺治療對大鼠OE%和OT%的影響

在高架十字迷宮測試中，與空白對照組相比，酒精戒斷大鼠在開放臂的逗留次數和時間明顯減少；與模型組相比，電針兩穴治療后可顯著增加在開放臂停留的次數、時間，針刺兩穴組能增加其逗留次數，而單穴位治療組作用效果不明顯。結果見表1。

表1 針刺對EPM大鼠進入開放臂次數比(OE%)、開放臂停留時間比(OT%)的影響

注：與空白對照組比較，*P<0.05，**P<0.01；與模型對照組相比，#P<0.05，##P<0.01

3.2 ELISA 檢測cAMP結果比較

與空白組相比較，酒精成癮大鼠海馬中cAMP的濃度明顯升高，與模型組相比，電針兩穴組和針刺兩穴組能顯著的降低cAMP的濃度，單穴位治療組降低cAMP的趨勢不明顯。結果見表2。

表2 針刺對酒精戒斷大鼠cAMP濃度的影響

注：與空白組相比，*P<0.05，**P<0.01；與模型組相比，#P<0.05，##P<0.01

3.3 ELISA檢測CRH結果比較

與空白組相比，酒精成癮大鼠的海馬中CRH的濃度顯著升高，與模型組相比較，電針兩穴組與針刺兩穴組經治療可明顯降低海馬中CRH的濃度，三陰交組和足三里組降低CRH濃度的趨勢不明顯。結果見表3。

表3 針刺對酒精戒斷大鼠CRH濃度的影響

注：與空白組相比，*P<0.05，**P<0.01；與模型組相比，#P<0.05，##P<0.01

4 討論

焦慮征大多是因為臟腑功能失調、氣機失常而導致神志不安，足三里是足陽明胃經合穴，三陰交是肝、腎、脾經的交會穴，這兩個穴位既能調節所屬臟腑的經氣，同時又針對了焦慮征的病理特點進行治療。近年來，三陰交、足三里作為治療焦慮征的主要穴位，受到廣大學者的關注。有實驗證明，電針三陰交可緩解自然更年期大鼠的焦慮行為[6]，針刺足三里可減輕海洛因戒斷后所產生的焦慮癥狀，且療效穩定[7]。本實驗中，我們選取了三陰交和足三里進行針刺治療，觀察到通過同時針刺這兩個穴位可明顯緩解酒精戒斷所產生的焦慮癥狀，由此我們猜測針刺這兩個穴位可能存在相互作用而使治療效果得到加強。單穴位的治療效果并未如相關文獻中所了解的那么顯著，這可能是由于針刺的天數和時長不同所導致。電針療法是應用電針儀輸出脈沖電流，通過毫針作用于經絡穴位以達到治療疾病目的的一種方法，它將毫針的刺激和電生理的效應相結合，這種方法不僅可以提高針刺的治療效果，同時還增加了針刺的治療范圍，加強了針刺疏通經絡的作用[8]。有文獻報道[9]，電針治療焦慮征的效果與抗焦慮藥物的治療效果相當，且避免了藥物所帶來的依賴性等副作用。在本研究中，多項實驗結果也證實了電針療法較普通針刺確有更好的療效。

大量的研究結果顯示，當機體受到內外環境的刺激時，應激反應會表現出一系列的神經內分泌物質的變化，主要表現為HPA軸的興奮。下丘腦室旁核是HPA-神經內分泌軸的中樞位點，CRH則是HPA軸激活的關鍵性物質。適量的CRH的增多可使機體處于興奮的狀態，但CRH的含量過高時，則可引起適應性的機制障礙，進而引發多種癥狀的發生，其中包括焦慮、抑郁等。有研究表明，在應激刺激下，CRH的濃度以及CRH mRNA的表達均顯著增加[10]。在焦慮癥狀中所觀察到的激素含量的變化主要是由CRH的過度分泌所導致[11]。新近研究表明，CRH的受體拮抗劑可作為抗焦慮以及抗抑郁的神經藥理學治療方法[12]。由本實驗結果我們也觀察到，酒精戒斷焦慮征大鼠的海馬中CRH的濃度較空白組大鼠均增加，經針刺治療后，其數值又下降至正常水平，由此證實了，CRH在焦慮的發生中占有重要的地位。

焦慮征受多種基因和多種環境因素的調控，目前發現其可能通過一系列的信號轉導級聯反應進行調控。有研究表明，與G蛋白相偶聯的cAMP信號傳導通路的異常與焦慮密切相關，這一論證從我們的實驗結果中得到了證實，酒精戒斷大鼠的cAMP的濃度升高，針刺治療后得到緩解。cAMP是體內比較重要的第二信使，它對多種神經遞質的功能發揮起調節作用。近年來，有大量的研究結果證實，cAMP依賴的PKA信號通路在酒精依賴的形成過程中具有重要的作用。環磷腺苷效應元件結合蛋白(CREB)作為PKA重要的下游信號蛋白，在藥物的成癮中也起著尤為重要的作用，因此，近年，CREB在酒精成癮的相關研究中成為又一備受關注的研究熱點。CREB 通過結合 cAMP效應元件(CRE)調節基因的轉錄，CRE是在各種基因調節區域中的順式增強子，CRH基因的上游調節區中存在CRE序列，而且已經證實，CRE的功能與CRH的轉錄活性密切相關，由此為我們的實驗結果提供證據：針刺抗焦慮的作用可能通過調節cAMP-CRH相互作用，終使酒精戒斷焦慮征得到緩解。同時由本實驗結果證實了cAMP、CRH之間可能確存在某種聯系，共同調節酒精戒斷焦慮征的發生。

綜上所述，本實驗探究了針刺可緩解酒精戒斷期間的焦慮樣行為，初步證實針刺可能通過cAMP-CRH相互作用來緩解酒精戒斷焦慮樣癥狀，為針刺療法開發成為防治酒精復飲的有效治療手段提供實驗和理論依據，也為綜合利用中醫療法治療其他毒品成癮提供強有力的實驗支持。