萹蓄草提取物的抗氧化和抑菌活性研究

鄭澤生，楊愛梅，張富祿，尚暉嵐，李瓊

(1.蘭州理工大學生命科學與工程學院，甘肅 蘭州 730050；2.甘肅省高校中藏藥篩選評價及深加工重點實驗室，甘肅 蘭州 730050)

萹蓄(PolygonumaviculareL.)為蓼科Polygonaceae蓼屬一年生草本植物,又名扁竹、竹節草、烏蓼、地蓼等,分布于全國大部分地區[1]。萹蓄中含有多種化學成分如黃酮類、酚酸類、苯丙素類、糖類、氨基酸以及多種常量和微量元素等[2]。臨床多用于治療泌尿系統感染、細菌性痢疾、非胰島素依賴性糖尿病、腎炎、結石、牙痛等疾病[3-4]。民間廣泛用其治療泌尿系統的感染，結石及腎炎等疾病[5]。

萹蓄的獨特療效及作為長期用藥的基礎，深受研究者的重視，然而研究者多以萹蓄化學成分報道較多，其藥理活性報道較少。為了深入研究萹蓄草抗氧化和抑菌活性成分，本實驗對萹蓄草四種不同溶劑萃取物抗氧化活性和抑菌活性進行了研究，以期為萹蓄相關產品的開發提供可靠的實驗數據和理論依據，為萹蓄的藥效物質研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

萹蓄藥材于2016年9月購于定西市藥材市場，經楊林副教授鑒定為P. aviculare的地上部分。五種受試細菌：大腸桿菌(Escherichia coli)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、肺炎鏈球菌(Streptococcus pneumoniau)、地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)、綠膿桿菌(Pseudomonas aeruginosa)等保藏于蘭州理工大學生命科學與工程學院中藏藥提取分離技術研究室。乙醇、石油醚、乙酸乙酯、正丁醇 均為分析純(天津市大茂化學試劑廠)；DPPH(Sigma公司)；維生素 C(上海伊卡生物技術有限公司)；三氯化鐵﹑鐵氰化鉀 (TCA)；磷酸二氫鉀﹑水楊酸﹑過氧化氫(天津百世化工有限公司)；牛肉膏(北京雙旋微生物培養基制品廠)；蛋白胨﹑瓊脂粉(北京博奧拓達科技有限公司)；青霉素和鏈霉素 (四川省環亞生物科技有限公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 萹蓄不同溶劑萃取物的制備

粉碎干燥的萹蓄草，樣品用95%乙醇按料液比1∶7(w/v)回流提取，濾渣再用1∶5(w/v)的95%乙醇回流提取2次，每次2 h，合并3次提取液，抽濾，減壓濃縮得乙醇總浸膏。留樣乙醇總浸膏后，將剩余樣品用一定量的蒸餾水溶解，分別用等體積的石油醚、乙酸乙酯和正丁萃取，獲得石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物、正丁醇萃取物。

1.2.2 抗氧化活性實驗

(1)DPPH自由基清除能力的測定

根據Shimada等[6]的方法測定萹蓄提取物的DPPH清除能力，并進行了一些修改。將1.2.1項下提取和萃取得到的樣品，依次配置濃度為0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，1.2，1.4 mg/mL的樣品溶液，取樣品溶液各2.0 mL和2.0 mL現配好的0.05 mg/mL的DPPH乙醇溶液混合，25℃，避光靜置30 min于517 nm處測定吸光度值A1；各樣品溶液2.0 mL依次加入無水乙醇2.0 mL作為對照，測定吸光度值A2；以無水乙醇作為空白，測定吸光度值A0，VC(抗壞血酸)作為陽性對照，3次平行重復測定。清除率按下式計算：

DPPH·清除率(%)=[1-(A1-A2)/A0]×100%

(2)羥基自由基清除能力的測定

根據李培源等[7]的方法測定萹蓄提取物的羥基自由基清除能力，并進行了一些修改。將1.2.1項下提取和萃取得到的樣品，依次配制濃度為0.4，0.6，1.0，1.4，1.8，2.2，2.6 mg/mL，得樣品溶液，取各樣品溶液2 mL同1 mL 6 mmol/L的硫酸亞鐵溶液﹑1 mL 6 mmol/L的水楊酸-乙醇溶液﹑1 mL 0.1% H2O2溶液，并依次定容至10 mL，充分混勻，在37℃保溫30 min于510 nm下測定吸光度A1；1 mL蒸餾水代替1 mL 0.1% H2O2溶液作為對照，測定吸光度A2；2 mL無水乙醇代替樣品溶液作為空白，測定吸光度A0，VC(抗壞血酸)作為陽性對照，3次平行重復測定。清除率按下式計算：

·OH清除率(%)= [1-(A1- A2)/A0]×100%

(3)總還原力的測定

根據張國廣等[8]的方法測定萹蓄提取物的總還原力，并進行了一些修改。將1.2.1項下提取和萃取得到的樣品，依次配制濃度為0.2，0.4，0.6，0.8，1.0,1.2 mg/mL，得樣品溶液，取各樣品溶液2.5 mL同0.2 mol/L pH=6.6的磷酸緩沖液2.5 mL﹑ 1%鐵氰化鉀2.5 mL，充分混勻，在50℃水浴中反應20 min，加入10%三氯乙酸2.5 mL，混勻后4 000 r/min離心10 min，取上清液5 mL，分別加入蒸餾水4 mL﹑0.1%三氯化鐵1 mL，混勻后靜置10 min，在700 nm處測定其吸光度值A。VC(抗壞血酸)作為陽性對照，3次平行重復測定。吸光度值越大，表明還原能力越強。

1.2.3 抑菌活性實驗

本實驗以大腸桿菌﹑金黃色葡萄球菌﹑肺炎鏈球菌﹑地衣芽孢桿菌和綠膿桿菌為受試菌，采用牛津杯法[9-10]對萹蓄草乙醇總浸膏，石油醚萃取物，乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物進行抑菌活性測定。取200 μL菌液均勻涂布于牛肉膏蛋白胨培養基的平板上，將已滅菌牛津杯淺淺插入已經涂布的培養基表面，每個平板置3個牛津杯，用移液槍吸取不同濃度的樣品200 μL于牛津杯內，并對不同濃度的平板進行標注。以二甲基亞砜(DMSO)作為空白對照，青霉素和鏈霉素溶液作為陽性對照。將各樣液平板放置于37℃的生化培養箱中培養18 h后，觀察并測量抑菌圈的大小，并計算測量數據。以上實驗重復3次。

2 結果

2.1 抗氧化活性的測定

(1)DPPH自由基清除能力的測定

如圖1所示為萹蓄草不同溶劑萃取物對DPPH自由基的清除率。四種萃取物對DPPH自由基的清除能力隨樣品質量濃度的增加而逐漸增大，并呈現良好的量效關系，通過回歸方程計算得出四種萃取物的半清除率EC50見表1。其中乙酸乙酯萃取物半清除率最小，說明其對DPPH自由基清除效果比較理想，但清除作用小于抗氧化劑Vc。

圖1 萹蓄草不同溶劑萃取物對DPPH自由基的清除率

提取物乙醇總浸膏石油醚萃取物乙酸乙酯萃取物正丁醇萃取物EC50/mg·mL-16.8747.9935.9328.972

(2)羥基自由基清除能力的測定

結果如圖2所示為萹蓄草不同溶劑萃取物對羥基自由基的清除率，四種不同溶劑萃取物對羥自由基的清除率在一定范圍內與濃度呈線性正相關，繪出相應曲線，計算EC50，結果見表2。其中，乙酸乙酯萃取物對羥基自由基的EC50為4.831 mg/mL，表明有較好的抗氧化活性。

圖2 萹蓄草不同溶劑萃取物對羥基自由基的清除率

提取物乙醇總浸膏石油醚萃取物乙酸乙酯萃取物正丁醇萃取物EC50/mg·mL-16.9357.9934.8316.836

(3)總還原力的測定

如圖3所示為萹蓄草不同溶劑萃取物總還原力的測定，四種萃取物均具有一定的還原能力。在測量范圍內，當樣品濃度大于0.8 mg/mL時，乙酸乙酯萃取物比其他溶劑萃取物的還原能力要好很多，當樣品濃度大于1 mg/mL時，乙醇總浸膏和正丁醇萃取物的還原能力接近。總還原力的排序依次是：Vc>乙酸乙酯萃取物 >石油醚萃取物>正丁醇萃取物>乙醇總浸膏。

圖3 萹蓄草不同溶劑萃取物總還原力的測定

2.2 最低抑菌濃度的測定

如表3所示為萹蓄草不同溶劑萃取物的最低抑菌濃度。四種萃取物在較低濃度下均有抑菌作用，乙酸乙酯萃取物對五種受試菌抑菌的MIC值為1 mg/mL，表明乙酸乙酯萃取物抑菌作用較強，而乙醇總浸膏﹑石油醚萃取物﹑正丁醇萃取物對肺炎鏈球菌﹑金黃色葡萄球菌﹑地衣芽孢桿菌和綠膿桿菌的MIC值為3 mg/mL。可以得出乙酸乙酯部位為萹蓄草提取物的最佳抑菌部位。

表3 萹蓄草不同溶劑萃取物的最低抑菌濃度(mg/mL)

3 結論與討論

實驗結果表明, 萹蓄95%乙醇提取物，石油醚萃取物，乙酸乙酯萃取物，正丁醇萃取物都具有清除DPPH自由基活性，清除羥基自由基活性和還原能力。然而，與陽性對照藥維生素C相比，活性較低。四種萃取物對大腸桿菌﹑金黃色葡萄球菌﹑肺炎鏈球菌﹑地衣芽孢桿菌和綠膿桿菌均具有較好的抑制活性。萹蓄乙酸乙酯萃取物的抗氧化和抑菌活性都較好，是具有多種藥理活性的天然產物，其提取物是新藥物開發的優良材料。本研究結果為萹蓄資源的拓展利用提供了實驗依據，對開發天然抗氧化劑和抑菌劑具有廣闊的開發利用前景，為我國豐富的中草藥開發具有重要意義。