吡非尼酮與槲皮素通過S1P/SPHK信號通路抗小鼠肺纖維化比較研究

張興彩，蔡余力，張偉，陳憲海

(1.山東中醫藥大學附屬醫院肺病科，山東 濟南 250014；2.山東中醫藥大學附屬醫院關節骨科，山東 濟南 250014)

特發性肺纖維化(IPF)是由慢性的上皮細胞損傷，纖維細胞異?；钴S造成的，而吡非尼酮作為IPF治療的新晉推薦藥物，具有抗炎、抗氧化及抗纖維化的作用，但吡非尼酮調節纖維增生的機制至今尚未完全清楚，其生物學活性可能是多靶點的。槲皮素是一種黃酮類化合物，存在于多種具有抗纖維化作用的草藥中。我們的先期研究發現槲皮素通過抑制SphK1/S1P信號在體內和體外均可改善肺纖維化[1]。有研究表明，S1P/SphK1通過與多種細胞作用參與促纖維炎癥及纖維化的過程，其中包括改變血管通透性、白細胞浸潤、遷移、成纖維細胞和肌成纖維細胞的分化增殖[2-3]。本研究初步探討吡非尼酮抗肺纖維化作用是否與調節S1P/SphK1信號通路有關，并與槲皮素進行比較，為臨床用藥提供更多的理論支撐。

1 材料與方法

1.1 藥物及儀器

博來霉素：購自日本株式會社，規格：15 mg/支。吡非尼酮原料藥：購自大連美侖生物技術有限公司。槲皮素原料購自中國上海阿拉丁生物技術有限公司。試劑：0．5%羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)溶液；鞘氨醇-1-磷酸(S1P)檢測試劑盒(酶聯免疫吸附試驗法)購自武漢優爾生科技股份有限公司，貨號CEG031Ge。ExicyclerTM 96熒光定量儀(韓國BIONEER公司)，凝膠圖象處理系統(Gel-Pro-Analyzer軟件)。

1.2 動物造模及給藥

選擇成年雄性C57BL/6小鼠，8周齡，體質量(20±2)g，隨機分為4組,每組20只(對照組A，博來霉素組B，博來霉素+吡非尼酮組C，博來霉素+槲皮素組D)。除對照組外，其余3組小鼠經氣管滴注博來霉素(10 mg/kg，溶于100 μL生理鹽水)誘導肺纖維化，對照組給予同劑量生理鹽水。造模當天為第0天，從第1天開始，C組小鼠每天灌胃給藥吡非尼酮(200 mg/kg，溶于0.5% CMC-Na溶液中)，D組小鼠每天灌胃給藥槲皮素(100 mg/kg)200 μL共給藥20 d，對照組和博來霉素組灌胃給予同劑量0.5% CMC-Na溶液。第21天，各組小鼠摘除眼球取血后腹腔注射50 mg/kg戊巴比妥鈉過量麻醉致死,取肺組織，部分肺組織固定于10%中性甲醛溶液中，部分肺組織液氮速凍轉至-80℃保存備用。

1.3 小鼠肺間質纖維化模型病理學觀察

行HE染色和Masson染色，分別于100倍和400倍光學顯微鏡下進行觀察肺組織肺泡炎和肺纖維化程度。

1.4 Real-time PCR檢測各組小鼠肺組織中鞘氨醇磷酸化酶1(SphK1)mRNA表達水平

步驟遵循試劑盒說明書,利用總RNA提取試劑盒提取樣本總RNA, 將得到的RNA樣本進行反轉錄，得到對應的cDNA，PCR反應體系包括：cDNA模板1 μL，上下游引物(10 μM)各0.5 μL，SYBR GREEN mastermix 10 μL，用ddH2O補足至20 μL，采用 Prime Premier 5.0軟件進行引物設計，實驗中所用到的引物如下:小鼠Sphk1(forward 5′-ACGAGCAG GTGACTAATGAAGA-3′,reverse 5′-GTGCCCACTGTGAAACGAA-3′),內參GAPDH(forward 5′-GGACGCATTGGTCGTCTGG-3′，reverse 5′-TTTGCACTGGTACGTGT TGAT-3′)本實驗利用韓國BIONEER公司生產的ExicyclerTM 96熒光定量儀進行熒光定量分析,每種樣本每個基因進行4個復孔平行實驗，實驗數據的選取，舍去誤差較大的數值，取剩余數值的平均值作為最終實驗保留數據，結果數據采用方程2- △△ CT計算目的基因的表達水平。

1.5 Western-blot檢測各組小鼠肺組織中fibronectin(FN)、α-SMA、Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ和SphK1蛋白表達水平

根據每個樣本的質量及體積加入相應體積的RIPA裂解液，裂解樣本，然后繼續置于冰上靜置5 min。低溫冷凍離心機，10 000 r/min，4℃，離心10 min，分離上清為所得的蛋白質抽提物。用考馬斯亮藍法測定蛋白濃度，取總蛋白含量為40 μg/孔上樣，進行SDS-PAGE約2.5 h，電轉移于PVDF膜上(電壓80 V轉印1.5 h) 上，用5%(M/V)脫脂奶粉稀釋抗體，制成抗體工作液。一抗4℃孵育過夜。實驗中所孵育的一抗分別為：fibronectin antibody(1：300,BOSTER,BA1771,中國)α-SMA antibody(1：500，BOSTER，BM4172，中國)Collagen I antibody(1：500 ，Bioss，bs-7158R，中國) Collagen III antibody(1：500 ，BOSTER，BM1625，中國) Sphk1 antibody(1：300，BOSTER，BA2865，中國)次日TBST洗膜洗4次，每次5 min，分別加入相應二抗Fibronectin,α-SMA,Collagen I,Sphk1二抗為羊抗兔IgG-HRP(1：5000，碧云天，A0208，中國)Collagen III 二抗為羊抗小鼠IgG-HRP(1：5000，碧云天，A0216，中國)37℃孵育45 min，TBST洗膜洗6次，每次5 min，后加入化學發光試劑,X 線膠片曝光。同時以內參GAPDH 進行對照，染色方法同上。將膠片進行掃描，用凝膠圖象處理系統(Gel-Pro-Analyzer軟件)分析目標條帶的光密度值。

1.6 ELISA試劑盒檢測各組小鼠血清和肺組織中1-磷酸鞘氨醇(S1P)表達水平

根據組織重量和PBS1:9勻漿。10 000 r/min,離心10 min，上清為實驗所需蛋白樣品，血清1 000 r/min 離心10 min，取上清即可檢測。參照ELISA試劑盒說明書進行試驗，以空白孔調零，酶標儀450 nm波長，依序測量各孔吸光度。每孔設3個平行孔，以標準品濃度的對數為縱坐標，OD值為橫坐標，做出標準曲線，然后計算含量。

1.7 統計學方法

實驗數據利用SPSS 17．0統計軟件進行分析。組間數據比較采用單因素方差分析進行t檢驗以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 HE染色及Masson染色觀察各組小鼠肺部損傷情況

結果顯示，10 mg/kg博來霉素經氣管滴注給藥，可引起小鼠肺組織嚴重損傷且出現嚴重的纖維化程度，如圖1A、B所示。HE染色于100倍、400倍光鏡下觀察博來霉素誘導的小鼠肺組織內的病理以炎性滲出、肺泡炎為主，炎性細胞總數多，以中性粒細胞為主，可見成纖維細胞增殖及細胞外基質沉積，肺泡壁和肺泡間隔增厚明顯，肺組織結構破壞嚴重，這也驗證了10 mg/kg博來霉素誘導IPF小鼠模型建立成功， Masson染色病理學觀察博來霉素誘導的小鼠肺組織內在胸膜下、大氣道及血管壁周圍的深藍色基質膠原明顯增多，有大量纖維組織增生，而吡非尼酮與槲皮素均可以減輕這些損傷，起到保護肺臟的作用，其中槲皮素鏡下改善表現更加突出。

2.2 小鼠肺組織中纖維化相關蛋白的表達

博來霉素顯著增加小鼠肺組織中纖維化相關蛋白FN，α-SMA，Collagen I, Collagen III的表達量，從分子水平上提示博來霉素誘導IPF小鼠模型建立成功，而吡非尼酮，槲皮素均可有效抑制肺纖維化相關蛋白FN，α-SMA，Collagen I的表達水平從而起到抵抗肺纖維化的作用(P<0.01)，如圖2所示。這個結果與HE、Masson染色結果一致。兩者比較無顯著性差異。吡非尼酮與槲皮素在抑制Collagen III的表達方面均不明顯，與模型組比較無顯著差異。

圖1 染色結果(A為HE染色結果，B為Masson染色結果)

圖2 纖維化相關蛋白的表達水平

2.3 IPF小鼠模型中S1P、SphK1的表達

研究結果顯示，博來霉素可顯著增加S1P、SphK1的表達水平，而吡非尼酮,與槲皮素均可顯著降低由博來霉素引起的肺組織中SphK1 mRNA和蛋白表達水平的升高(P<0.01)，如圖3A、B所示；同時也可以顯著降低由博來霉素引起的血清和肺組織中S1P的表達水平的升高(P<0.01)，如圖3C、D所示。可見吡非尼酮與槲皮素對IPF小鼠模型中S1P、SphK1表達均具有一定的抑制作用，兩者比較無顯著性差異。

圖3 IPF小鼠模型中S1P、SPHK的表達量

3 討論

特發性肺纖維化是(idiopathic pulmonary fibrosis，IPF)是一種慢性、進行性、纖維化性間質型肺病，其病理組織學改變與普通的間質型肺炎相似，是特發性間質性肺炎中最常見的類型[4]，但發病原因尚未完全闡明，目前也沒有有效的治療手段，且患病率和病死率成逐年上升的趨勢，故也成為國內外學者研究的熱點之一[5-6]。最近研究證明，IPF是由慢性的上皮細胞損傷，纖維細胞異?；钴S造成的[7-12]。近年來Milara等[2]研究發現在IPF患者的血清和肺泡灌洗液中S1P水平升高，且這種S1P水平升高與肺功能呈負相關性；也發現在IPF患者肺組織中SphK1表達增加與α-SMA、波形蛋白及Ⅰ型膠原蛋白的表達增加相關。成纖維細胞主要表達S1P1、S1P2和S1P3。在S1P信號反應中，S1P1介導細胞遷移和小鼠胚胎成纖維細胞增殖；相反，S1P2介導抑制細胞遷移和EMFs及人肺成纖維細胞HLF1的增殖[2-3]。King等[13]研究也證實S1P通過自分泌TGF-β的方式誘導人肺泡上皮細胞A549的上皮間質轉化(EMT)，TGF-β和S1P之間的交聯機制部分是依賴SphK1活性及S1P的產生。由于S1P具有類似于TGF-β的作用，S1P也可引起肺纖維細胞表達α平滑肌肌動蛋白。S1P可使肺纖維細胞轉化為肌成纖維細胞，在博來霉素誘導的小鼠肺纖維化模型中發現，肺纖維化灶中出現高表達的SPHKl和α平滑肌肌動蛋白，當使用SphK抑制劑和siRNA基因敲除S1P2/SphK1或S1P3/SphK可降低TGF-β誘導的α-SMA、纖維連接蛋白和膠原蛋白的表達；以上研究結果表明S1P及其受體可能參與肺纖維化過程[14]。

2015年ATS/ERS/JRS/ALAT聯合發表的特發性肺纖維化國際指南中吡非尼酮成為IPF治療的新晉推薦藥物。吡非尼酮是口服的吡啶類藥物，能調節許多細胞因子，包括轉化生長因子-β(TGF-β)、結締組織生長因子(CTGF)、血小板衍生因子(PDGF)和腫瘤壞死因子(TNF-α)，改變膠原表達合成和累積，抑制細胞外基質增殖和表達[3]，具有抗炎、抗氧化及抗纖維化的作用。吡非尼酮調節纖維增生的機制至今尚未完全清楚，其生物學活性可能是多靶點的。銀杏葉是一種中藥，在抑制呼吸道炎癥[15]、急性肺損傷修復[16]、肺癌惡性腫瘤抑制[17]等方面發揮作用。槲皮素是一種黃酮類化合物，存在于多種草藥中，包括銀杏葉[18]。已有報道槲皮素在動物模型中抑制CCl4誘導的肝纖維化、異丙腎上腺素誘導的心臟纖維化和單側輸尿管梗阻性腎纖維化[19-21]。最近，有報道稱槲皮素可以減輕博萊霉素誘導的Wistar大鼠肺纖維化[22]，但其機制尚未闡明。本研究發現吡非尼酮與槲皮素抗肺纖維化作用與調節S1P/SPHK 信號通路有關，這可能是用于肺纖維化的臨床治療的原因。研究比較觀察了吡非尼酮與槲皮素干預S1P/SPHK 信號通路的作用結果，認為兩種藥物在調節S1P/SPHK 信號通路方面未見明顯差異，提示可進一步開發研究含槲皮素類藥物用于肺纖維化的臨床治療，未來研究可以進一步觀察兩藥聯合使用對于肺纖維化的治療效果是否有協同作用。