3D打印聚己內酯多級管道支架促進梗死后心肌修復

研究表明，心肌補片移植于心肌梗死部位可以為心肌梗死區域提供良好的力學支持，改善心肌梗死后心臟左室重構，減少心肌凋亡，進而改善心功能[1-3]。大多數相關研究集中在心肌補片良好的力學性質上，而忽略其在促血管化方面的作用，而心肌再血管化對梗死后處于缺血的心肌細胞功能的恢復非常關鍵[4]。近年來，3D打印技術在心肌補片支架領域應用廣泛，可精準設計特定的結構促進移植區域的血管化，故心肌補片在促血管化方面有很好的應用前景[5-6]。本研究中，我們通過3D打印技術，以蔗糖和聚已內酯(PCL)為材料，制備多級管道支架，移植于SD大鼠心肌梗死區域，探討其對SD大鼠心肌梗死后再血管化作用及其潛在機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

健康雄性Sprague-Dawley大鼠24只，體質量為200～250 g，由上海交通大學醫學院實驗動物科學部提供，動物生產許可證號為 SCXK(滬)2018-0006，使用許可證號為：SYXK(滬)2013-0050，將動物飼養在12 h光照、黑暗交替，恒濕恒溫環境下。

1.2 主要試劑和儀器

CD31抗體(1∶100，美國Abcam)；α-SMA抗體(1∶200，美國 Abcam )；DAPI(美國Vector)；Alexa Fluor 594熒光二抗(1∶1000，美國Thermo Scientific)；Alexa Fluor 488熒光二抗(1∶200，美國Thermo Scientific)；小動物人工呼吸機(DW-3000A/B，北京眾實迪創科技發展有限責任公司)；共聚焦激光掃描顯微鏡(LSM-710，德國Zeiss)；PCL(80 000 g/mol，美國Sigma)；六氟異丙醇(HFIP，上海達瑞精細化工)；食用蔗糖(市售)；CD31抗體(1∶100，美國Abcam)；α-SMA抗體(1∶200，美國 Abcam)；DAPI(美國 Vector)；Alexa Fluor 594熒光二抗(1∶1000，美國Thermo Scientific)；Alexa Fluor 488熒光二抗(1∶200，美國Thermo Scientific)；掃描電子顯微鏡(SEM, JSM-5600LV，日本JEOL)；力學試驗機(Exceed 40，美國MTS)小動物人工呼吸機(DW-3000A/B，北京眾實迪創科技發展有限責任公司)；共聚焦激光掃描顯微鏡(LSM-710，德國Zeiss)。

1.3 3D打印PCL多級管道支架

以市售蔗糖作為原料，在熔融沉積成型(FDM)打印機中加熱1 h，焦糖化處理后作為打印墨水；并進一步通過3D打印制備焦糖化模板，打印溫度為135 ℃。將4%的PCL/HFIP溶液，通過溶劑澆鑄法在模板表面形成涂層，然后通過犧牲模板法將焦糖化模板去除，經過冷凍干燥后獲得PCL多級管道支架。將含有PCL涂層的蔗糖支架放置在載玻片上，在載玻片上滴加適量蒸餾水，使支架的一側與蒸餾水接觸，用顯微鏡觀察并視頻記錄蔗糖溶解的過程。通過SEM和力學試驗機表征PCL多級管道支架的結構和力學參數。將PCL支架浸漬紅色染料溶液，觀察染液在管道中分布情況。

1.4 急性心肌梗死模型構建及支架體內移植

2%戊巴比妥(30 mg/kg)對SD大鼠進行腹腔麻醉后，將大鼠固定于手術臺，行氣管插管，小動物呼吸機維持其呼吸。胸部去毛并消毒鋪巾，于左側第4～5肋間隙打開胸腔，打開心包，暴露SD大鼠心臟，6-0聚丙烯縫線于左心耳前下部約3～4 mm 處縫合，結扎左冠狀動脈前降支(LAD)，結扎后可觀察到心尖部及前壁心肌組織出現蒼白色，前壁收縮運動減弱。關閉胸腔并縫合皮膚，將SD大鼠送回動物房飼養。Sham組SD大鼠僅開胸，不結扎LAD。術后2 d行超聲檢查確定基線，篩選出射血分數為40%～45%的SD大鼠16只，隨機分成2組，分別為MI組(n=8)和MI+scaffold組(n=8)。MI+scaffold組進行二次開胸，用6-0聚丙烯縫線將補片縫合于心臟表面，補片覆蓋梗死區域，Sham組和MI組僅二次開胸，關閉胸腔，縫合后將SD大鼠送回動物房飼養。

1.5 石蠟包埋及Masson染色

術后28 d取材SD大鼠心肌組織，浸于4%多聚甲醛固定24 h。將固定好的心肌組織置入不同濃度的酒精中脫水(75% 4 h、85% 2 h、90% 2 h、95% 1 h、100% 1 h)，將脫水的心肌組織石蠟包埋，于石蠟切片機上連續切片，每層5 μm，攤片，60 ℃烘烤后室溫保存備用。將切片先用Weigert氏鐵蘇木素染5 min，自來水洗后，以1 %的鹽酸酒精分化數秒，流水沖洗數分鐘后返藍。以麗春紅酸性品紅液染5～10 min后，蒸餾水快速漂洗，最后磷鉬酸水溶液處理3～5 min，苯胺藍液復染5 min。將染好的切片置于1%冰醋酸處理1 min，脫水封片，顯微鏡鏡檢觀察。

1.6 免疫熒光染色

將組織切片置于盛滿檸檬酸抗原修復液的高壓鍋內進行抗原修復。冷卻后用PBS清洗甩干，加入自發熒光淬滅劑5 min，流水沖洗10 min。在切片上滴加一抗(CD31抗體+α-SMA抗體)，切片平放于濕盒內4 ℃孵育過夜；玻片置于PBS中洗滌3次，每次5 min，稍甩干后滴加與一抗相應種屬的二抗覆蓋組織，避光室溫孵育50 min；玻片置于PBS中洗滌3次，每次5 min，稍甩干后滴加DAPI染液，避光室溫孵育10 min，封片后于共聚焦激光掃描顯微鏡下觀察并采集圖片，每個區域取3個視野，取平均值。

1.7 統計學分析

計量數據采用均數±標準差表示，采用 SPSS 24.0 軟件進行統計分析，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，3組間比較采用單因素方差分析(One-way ANOVA)，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 3D打印PCL多級管道支架

3D打印機需要設定的主要參數有打印溫度和打印速率，參數的設定關系到模板打印能否成功和成品支架的形態。圖1A顯示焦糖墨水可以在高溫下被順利擠出形成纖維，并在3D打印機的控制下進行排列，溫度降低后焦糖墨水很快凝固，所打印的形狀能很好保持。如圖1B所示，3D打印的蔗糖模板具有精細的三維結構，為直徑400～600 μm的焦糖絲連續均勻地堆積而成，層與層之間晶絲交叉粘接形成整體。

圖1C展示了管道內部相互連通，提供管道之間的物質運輸通道，這種多級管道結構模擬了血管在組織中的運輸功能。采用4%PCL澆筑法能夠制得厚度適中、均勻完整的三維支架(見圖1D)。支架管路排列整齊，分布均勻，縱橫交錯。圖1E～1G顯示，由于蒸餾水滴加于支架一側，支架的溶解從接觸蒸餾水一側開始，并逐漸向另一側發展。隨著溶解時間的增長，蒸餾水與蔗糖之間的固液界面不斷向支架內部推移。可以觀察到蔗糖已溶解的部分呈白色管狀支架，而蔗糖未溶解的支架部分呈淺黃色，蔗糖支架內的氣泡也隨著溶解向外部遷移。上層支架內蔗糖溶解的同時，下層支架內的蔗糖也在溶解，當所有蔗糖全部溶解時，支架所形成的孔道結構與原有的模板形態結構完全一致。

圖1 PCL多層管道支架制作過程及結構特點(標尺為500 μm)

2.2 PCL多級管道支架縮小SD大鼠梗死面積及瘢痕面積

術后28 d收集各組SD大鼠心臟組織，進行Masson染色，每組8個樣本。3組切面Masson染色整體及局部代表圖見圖2。Sham組心肌組織無明顯的纖維化；MI組術后28 d梗死區域纖維化明顯, 梗死范圍比例為(64.63±7.72)%，瘢痕面積為(13.85±1.98)mm2；MI+scaffold組梗死區域纖維化較MI組少，梗死范圍為(42.01±8.68)%，瘢痕面積為(9.82±1.47)mm2，與MI組相比均存在明顯差異(P<0.01)。

2.3 PCL多級管道支架促進心肌再血管化

圖3中A和B分別表示MI組和MI+scaffold組心肌梗死交界區血管再生情況，綠色熒光代表α-SMA，標記平滑肌細胞，紅色熒光代表CD31，標記血管內皮細胞，藍色熒光代表DAPI，標記細胞核。對比兩者結果發現，MI+scaffold組梗死交界區新生血管密度為(15±3.13)個/HPF，而MI組梗死交界區新生血管密度為(5.29±0.91)個/HPF，兩組差異有統計學意義(P<0.01)，說明PCL多級管道支架對梗死交界區具有較強的促血管化的能力。圖3表示MI+scaffold組支架內血管再生情況。PCL多級管道支架內部的新生血管密度為(17.7±2.71)個/HPF，與另兩組相比差異有統計學意義(P<0.05)，說明PCL多級管道支架具有良好的生物相容性，并具有促血管再生的能力。

圖2 術后28 d心肌組織Masson染色

注：A為MI組梗死交界區；B為MI+scaffold組梗死交界區；C為MI+scaffold組支架內部

3 討論

我們通過3D打印技術，成功制備PCL多級管道支架，并移植于SD大鼠梗死心肌表面，發現其可縮小心肌梗死范圍和瘢痕區域，并促進交界區域的再血管化，從而修復梗死后的心肌。

目前，心肌補片支架因其在力學性能上的優越性，在梗死后心肌修復方面取得了較好的成果[7]。然而，大多研究主要關注補片支架的力學性能，在其生物相容性和促血管化方面仍然面臨很大的挑戰[8]。3D打印技術能準確設計和調控支架結構，在心肌補片支架方面應用廣泛。

本研究采用3D打印構筑三維結構仿生血管網絡。受限于現有設備的精度和材料流動加工過程中的變形性，3D打印技術尚無法直接打印薄壁血管網絡結構，因此采取間接倒模的方式來制備血管網絡支架。利用間接倒模法制備三維支架已經取得一定的成果，但仍然面臨一定的挑戰，包括材料的選擇、三維支架結構的穩定性、生物相容性及可降解性[9-10]。我們選擇食用級的蔗糖作為原料，利用熔融層積成型技術打印支架的模板。模板的形態結構可以通過3D打印實現宏觀和微觀層面上個性化的定制。焦糖化的蔗糖具有諸多優點：良好的生物相容性、原料的易得性、適宜的熔點、熔融狀態下良好的流動性和降溫時快速的固化成型性。采用液澆鑄和模板浸出法，將生物材料制備成三維連通的管狀網絡支架，并通過調控相分離在支架管道壁上形成均勻分布的微納米級的開放孔，模擬天然血管壁的通透性，保證氧氣和營養物質能夠通過管壁，使仿生血管網具備類似血管壁的物質交換功能。該巧妙的多級管道結構有利于血管的生長。

心臟發生心肌梗死后，隨著病情的進展，心臟左室發生不良的左室重構，即心臟左室擴大，膠原纖維沉積，瘢痕形成，最終導致心力衰竭，故逆轉不良的左室重構對于梗死后心肌修復至關重要[11]。本研究中我們發現，PCL多級管道支架移植于SD大鼠梗死心肌表面28 d后，MI+scaffold組梗死范圍和瘢痕區域明顯小于MI組，說明PCL多級管道支架在一定程度上能促進心肌修復。心肌再血管化在心肌修復中起重要作用，早期再血管化有助于梗死交界區處于缺血的心肌獲得足夠的血供，防止其因長期的缺血而導致凋亡[12]。本研究中，PCL多級管道支架中長入大量的新生血管，同時梗死交界區也有大量的新生血管，為處于缺血的心肌細胞提供了良好的血供，減少梗死交界區心肌細胞的凋亡，故最終可縮小梗死范圍和瘢痕面積，這與組織學結果相符。

我們通過3D打印技術成功制備PCL多級管道支架，經動物實驗證實可促進梗死心肌再血管化，縮小梗死范圍和梗死面積，達到修復心肌的作用。