天竺葵對膿毒癥小鼠腎功能保護作用觀察

陳美玲, 陳 燁, 程玉梅, 朱春玲

(貴州醫科大學附屬醫院1. 腎內科, 2. 重癥醫學科, 貴陽550004)

膿毒癥是因嚴重感染而導致的全身炎癥性反應類疾病，即使在重癥監護情況下其發病后的致死率仍然較高[1]。在被感染時細胞因子激活是宿主防御系統的一個重要環節。但是大量的細胞因子激活可能導致全身廣泛損傷和多器官功能衰竭[2]。膿毒癥可上調一氧化氮(nitric oxide, NO)和活性氧(reactive oxygen species, ROS)的產生，從而導致細胞毒性[3,4]。ROS的過量產生可引起因內源性抗氧化防御系統降低和脂質過氧化減少而導致的氧化應激反應。因此認為具有抑制ROS和炎性細胞因子產生的藥物可以治療嚴重的膿毒癥或膿毒癥性休克[5,6]。

天竺葵是可在部分蔬菜和水果中提取出的化合物,主要化學成分為天竺葵素、天竺葵醇及精油等，具有抗氧化、抗糖尿病和細胞保護作用[7]。已有關于天竺葵抗炎癥反應、抗癌癥和預防糖尿病的研究報道[8]，但是天竺葵對膿毒癥患者的腎功能保護作用尚無明確定論。因此本實驗研究了天竺葵對膿毒癥模型小鼠的腎保護作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

SPF級雄性C57BL/6小鼠30只，(6.2±1.4)周齡，體質量(21.4±4.1) g，購自貴州醫科大學[SCXK(黔)2018-0001]，飼養于貴州醫科大學附屬醫院實驗動物中心[SYXK(黔)2014-002]。

1.2 主要儀器設備和試劑

天竺葵提取物, 購自美國Sigma公司; 舒泰購自法國維克制藥股份有限公司; 原發性人臍靜脈內皮細胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)培養基購于美國生物科學公司; 白細胞介素-6(interleukin 6, IL-6)、腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor-α, TNF-α)、丙二醛(malondialdehyde,MDA)、總谷胱甘肽(glutathione, GSH)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase, GSH-Px)和過氧化氫酶活性(catalase, CAT)試劑盒均購自南京建成生物有限公司; 酶標儀購自美國BioTek公司; 離心機購自上海安亭科學儀器廠; 電泳儀購自美國Bio-rad公司。

1.3 小鼠膿毒癥模型制作及實驗處理

將30只小鼠隨機分為3組，分別為對照組、模型組和天竺葵組, 每組10只。對照組小鼠正常飼養, 不做任何處理; 模型組和天竺葵組小鼠制作膿毒癥模型, 造模成功后, 天竺葵組分別于造模后12 h、60 h注射天竺葵提取物(0.4 mg/kg), 共注射2次。在天竺葵第2次注射后48 h分別收集3組小鼠血液和器官樣品用于功能測定。

造模方法: 采用盲腸結扎后穿孔(cecal ligation plus puncture, CLP)手術制作膿毒癥模型，即將小鼠行腹腔注射麻醉(舒泰30 mg/kg)，在其腹壁正中切口，輕輕拉出盲腸，用無菌4號絲線在盲瓣于盲腸中點進行結扎，并用無菌針頭在結扎部位于盲腸頂端的中點處貫穿刺盲腸壁，造成穿孔，輕輕擠壓盲腸，擠出少許內容物確保穿孔通暢，然后把盲腸推回腹腔，逐層縫合。

1.4 腎損傷標志物檢測

第2次注射天竺葵后48 h，提取小鼠血液、尿液及腎組織樣本取樣。分別檢測3組小鼠的血尿素氮(blood urea nitrogen, BUN)、血肌酐、乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase, LDH)、中性粒細胞明膠酶相關脂質運載蛋白(neutrophil gelatinaseassociated lipocalin, NGAL)、視黃醇結合蛋白(retinol-binding protein, RBP)、N-乙酰 -β-D-葡萄糖苷酶(N-acetyl-β-D-glucosidase, NAG)[9]及24 h蛋白尿水平(小鼠尿液收集方法，小鼠置于代謝籠中，禁食不禁水24 h收集尿液)。

1.5 組織炎癥標志物檢測

分別檢測3組小鼠血漿中NO、TNF-α、IL-6及髓過氧化物酶(myeloperoxidase, MPO)水平。其中NO檢測采用亞硝酸鹽/硝酸鹽測定, 使用Griess試劑和釩溶液測定血漿中亞硝酸鹽和硝酸鹽的水平。將每個樣品(100 μL)與釩溶液(100 μL)混合并與Griess試劑一起孵育。半小時后，測量吸光度(A540nm)值。使用亞硝酸鈉標準品制備標準曲線以測量最終濃度。TNF-α、IL-6及MPO均采用酶聯免疫吸附法測定, 嚴格按照試劑盒說明書操作。

1.6氧化應激標志物檢測

分別檢測3組小鼠脂質內MDA、GSH、SOD、GSH-Px和CAT水平[9,10]。

1.7統計學方法

應用SPSS20.0軟件進行統計分析。計量資料采用表示，組間比較的統計分析采用重復因素方差分析檢驗，方差不齊采用Dunnett’s檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 三組小鼠腎臟損傷標志物水平比較

與對照組比較，模型組BUN 、血肌酐、尿蛋白、LDH、NGAL、RBP及NAG水平均顯著升高(P＜0.05); 天竺葵組BUN、血肌酐、NGAL、RBP及NAG水平顯著升高(P＜0.05)。與模型組比較，天竺葵組BUN、血肌酐、尿蛋白、LDH、NGAL、RBP及NAG水平顯著降低(P＜0.05)(表1)。

表 1 三組小鼠腎臟損傷標志物水平比較

2.2三組小鼠腎組織炎癥標志物水平比較

與對照組比較，模型組及天竺蘭組N O、TNF-α、IL-6及MPO水平均顯著升高(P＜0.05)。與模型組比較，天竺蘭組NO、TNF-α、IL-6及MPO水平均顯著降低(P＜0.05)(表2)。

2.3 三組小鼠氧化應激標志物比較

與對照組比較，模型組MDA水平顯著升高，GSH、SOD、GSH-Px及CAT水平均顯著降低(P＜0.05); 天竺葵組MDA水平顯著升高(P＜0.05)。與模型組比較，天竺葵組MDA水平顯著降低，GSH、SOD、GSH-Px及CAT水平均顯著升高(P＜0.05)(表3)。

表 2 三組小鼠腎組織炎癥標志物水平比較

表 3 三組小鼠氧化應激標志物比較

3 討論

對人類膿毒癥的研究因復雜的病理生理學過程、人群的多樣性、診斷標記物的不充足以及倫理限制等多重復雜原因而受到限制[11,12]。CLP模型被認為是多菌膿毒癥的金標準模型，可以模擬人類膿毒癥[13]。

BUN 、血肌酐、尿蛋白及LDH是腎損傷檢測的基礎指標。NGAL是急性腎損傷的早期診斷標志物, 可用于預測慢性腎臟疾病的進展; RBP能早期發現腎小管的功能損害，并能靈敏反映腎近曲小管的損害程度，可作為腎功能早期損害和監護治療的指標, 還可作為肝功能早期損害和監護治療的指標。NGAL是一種細胞內溶酶體酶，以腎近曲小管含量最高，尿、血清和唾液中NAG活性變化與腎臟狀態密切相關。檢測三組小鼠腎損傷上述標志物，結果表明，天竺葵注射治療能夠顯著降低造模后小鼠BUN、血肌酐、尿蛋白、LDH、NGAL、RBP及NAG水平。說明天竺葵能夠對膿毒癥腎損傷起到保護作用。黨璇等[14]對天竺葵的藥理活性研究表明, 其具有腎保護作用。

對三組小鼠腎組織炎癥標志物及氧化應激標志物檢測表明，天竺葵注射治療能夠顯著降低造模后小鼠炎癥標志物NO、TNF-α、IL-6及MPO水平; 提高氧化應激標志物GSH、SOD、GSH-Px及CAT水平，降低氧化應激標志物MDA水平。基因編碼三種抗氧化酶(SOD，CAT和GSH-Px，被認為是主要的氧化防御基因[15]。小鼠CLP手術后降低了腎臟SOD，CAT和GSH-Px的表達，但是它們通過天竺葵的注射處理后表達水平較未處理組顯著增加，表明天竺葵具有針對CLP術后誘導的腎組織氧化損傷的細胞保護活性。CLP還增加腎臟MDA濃度，腎臟MDA是作為主要的脂質過氧化產物和氧化應激標記物[16]。因此，天竺葵可以通過抑制脂質中的過氧化反應和活化抗氧化酶來保護免受膿毒癥誘導的氧化應激和損傷。

綜上所述，天竺葵或可用于膿毒癥引發的腎性疾病的治療。