山羊胎肝內(nèi)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的存活與分化研究

鄢東海, 黃小昆, 向雪萍, 卿德科, 方 偉, 李自安, 王 強(qiáng), 王金祥, 龐榮清

(1. 聯(lián)勤保障部隊(duì)第920醫(yī)院干細(xì)胞與免疫細(xì)胞生物醫(yī)藥技術(shù)國(guó)家地方聯(lián)合工程實(shí)驗(yàn)室、云南省細(xì)胞治療技術(shù)轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室、云南省干細(xì)胞工程實(shí)驗(yàn)室, 昆明 650032;2. 昆明醫(yī)科大學(xué)920醫(yī)院臨床學(xué)院, 昆明 650031)

臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(umbilical cord mesenchymal stem cells，UCMSC)是一種取材方便、分化潛能較強(qiáng)的成體干細(xì)胞，是再生醫(yī)學(xué)研究常用的種子細(xì)胞。雖然UCMSC在體外一定的誘導(dǎo)條件下可以向脂肪、軟骨和成骨組織分化[1], 但在體內(nèi)免疫監(jiān)控的環(huán)境條件下是否可以向肝細(xì)胞分化？其在體內(nèi)究竟如何生存、遷移、分化以及組織錨定？這些基本問題一直是再生醫(yī)學(xué)研究關(guān)注的焦點(diǎn)和難點(diǎn)[2]，需要可靠的科學(xué)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證研究。胚胎發(fā)育期由于免疫系統(tǒng)尚未發(fā)育成熟，被認(rèn)為是研究干細(xì)胞分化的理想環(huán)境[3]。運(yùn)用胚胎發(fā)育期的特殊微環(huán)境，研究UCMSC的基本科學(xué)問題，可以為其轉(zhuǎn)化應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)，并已經(jīng)在細(xì)胞移植、免疫耐受研究和移植器官來(lái)源等諸多方面展示了無(wú)限的希望和潛在的應(yīng)用價(jià)值[4]。本研究首次將人UCMSC(hUCMSC)注射到處于胚胎發(fā)育期的胎羊肝臟實(shí)質(zhì)區(qū)域，以構(gòu)建人-山羊肝臟嵌合體，觀察hUCMSC在胎羊肝臟發(fā)育特定微環(huán)境內(nèi)的生存和變化，為hUCMSC用于人類肝病治療甚至將來(lái)器官培育提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要材料

1.1.1 主要試劑培養(yǎng)液DMEM/F12、新生牛血清和trypsin-EDTA均購(gòu)自美國(guó)Gibico公司，攜帶綠色熒光蛋白(Green Fluorescent Protein，GFP)基因的慢病毒載體購(gòu)自吉滿生物公司, DNA/RNA提取、cDNA合成、人雄性性別決定基因(SRY)等基因引物及PCR Mix試劑盒購(gòu)自美國(guó)Promega公司，免疫組織化學(xué)染色用抗人單抗[兔抗人肝細(xì)胞核因子3β(HNF3β)、兔抗人 HNF4α和兔抗人白蛋白 (ALB）購(gòu)自美國(guó)Abcam公司。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 2只雌性妊娠山羊來(lái)源于醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，用于胎肝內(nèi)定位注射實(shí)驗(yàn)研究[SYXK(軍)2012-0039]。

1.1.3 人臍帶組織 經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)[批件號(hào)2017027]，來(lái)源于健康男嬰的臍帶用于分離hUCMSC。

1.1.4 實(shí)驗(yàn)儀器Eclipse 80i熒光顯微鏡為日本Nikon公司生產(chǎn); BX41生物顯微鏡為日本Olympus公司生產(chǎn); C1000 PCR擴(kuò)增儀和Gel Doc XR凝膠成像儀均為美國(guó)BIO-RAD公司生產(chǎn)。

1.2GFP轉(zhuǎn)染標(biāo)記hUCMSC的準(zhǔn)備

采用本課題組前期建立的hUCMSC分離培養(yǎng)及其轉(zhuǎn)染標(biāo)記方法[1,5]制備男嬰來(lái)源的hUCMSC并進(jìn)行綠色熒光蛋白(GFP)轉(zhuǎn)染標(biāo)記。即剪碎的男嬰臍帶在含10%牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)體系中擴(kuò)增出貼壁生長(zhǎng)的第三代細(xì)胞，經(jīng)流式細(xì)胞測(cè)定細(xì)胞免疫表型并進(jìn)行體外成脂、成骨、成軟骨誘導(dǎo)分化實(shí)驗(yàn)鑒定為間充質(zhì)干細(xì)胞后，按照轉(zhuǎn)染復(fù)數(shù)50的劑量往生長(zhǎng)良好的第三代hUCMSC培養(yǎng)液中加入攜帶GFP的慢病毒載體液共培養(yǎng)48 h，生理鹽水漂洗后消化收集細(xì)胞，熒光顯微鏡下觀察確定標(biāo)記成功的細(xì)胞，即GFP-hUCMSC，用生理鹽水重懸后調(diào)整細(xì)胞濃度為108/mL用于胎肝內(nèi)定位注射實(shí)驗(yàn)。

1.3 胎肝內(nèi)細(xì)胞定位注射

采用本課題組前期建立的胎肝內(nèi)定位注射方法[6]，即選擇交配后經(jīng)超聲探查確診妊娠2個(gè)月的山羊，固定并腹部消毒后，在B超引導(dǎo)下穿刺至胎羊肝臟實(shí)質(zhì)區(qū)域，連接裝有1 mL細(xì)胞懸液(含108個(gè)男性GFP-hUCMSC)的注射器，準(zhǔn)確將GFP-hUCMSC懸液注射到3只孕齡2個(gè)月的胎羊肝臟實(shí)質(zhì)區(qū)域。陰性對(duì)照為孕齡相同的胎羊，以同樣方式注射1mL生理鹽水。

1.4 GFP陽(yáng)性細(xì)胞的觀察

胎羊出生后1個(gè)月, 手術(shù)切取部分肝臟組織,用OTC(一種聚乙二醇和聚乙烯醇的水溶性混合物)包埋后制作冰凍切片, 滴加DAPI染色后直接在熒光顯微鏡下觀察GFP陽(yáng)性細(xì)胞的分布并拍照。

1.5 人雄性性別決定基因(SRY)基因的檢測(cè)

切取適量肝臟組織，快速加入液氮研磨后用DNA試劑盒提取DNA, 以PCR方法擴(kuò)增人SRY基因, PCR擴(kuò)增引物序列及擴(kuò)增條件見表1。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后，于凝膠成像儀上觀察目的條帶并拍照。未注射細(xì)胞的羔羊肝臟為陰性對(duì)照, 甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)基因?yàn)閮?nèi)參。

1.6 人肝細(xì)胞特異基因的檢測(cè)

切取適量肝臟組織，快速加入液氮研磨后用RNA提取試劑盒提取總RNA，用first Strand cDNA Synthesis試劑盒合成cDNA，以RT-PCR方法檢測(cè)人肝細(xì)胞特異基因肝細(xì)胞核因子3 β(Hepatocyte nuclear factor 3β, HNF3β)、肝細(xì)胞核因子4α(Hepatocyte nuclear factor 4α, HNF4α)和白蛋白(albumin, ALB)的表達(dá), RT-PCR擴(kuò)增引物序列及條件見表1。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后, 于凝膠成像儀上觀察目的條帶并拍照。未注射細(xì)胞的羔羊肝臟為陰性對(duì)照,GAPDH為內(nèi)參。

1.7 人肝細(xì)胞特異蛋白的檢測(cè)

切取部分肝臟組織, 用體積分?jǐn)?shù)10%甲醛溶液固定后制作石蠟切片, 經(jīng)脫蠟、水化、抗原修復(fù)后, 檢測(cè)人肝細(xì)胞特異蛋白細(xì)胞核因子HNF3β、HNF4α和ALB的表達(dá), 分別滴加相應(yīng)的一抗(人抗兔 HNF3β、HNF4α、ALB), 在濕盒內(nèi) 4℃孵育過夜, 磷酸鹽緩沖液漂洗3次, 滴加抗兔生物素化二抗, 室溫條件下孵育30 min, 磷酸鹽緩沖液漂洗3次后蘇木素復(fù)染2 min, 在顯微鏡下觀察并拍照。

2 結(jié)果

2.1 GFP陽(yáng)性細(xì)胞的觀察

肝臟組織用OTC包埋后制作冰凍切片，在熒光顯微鏡下可觀察到接受胎肝內(nèi)細(xì)胞注射的山羊肝臟內(nèi)廣泛存在綠色熒光信號(hào), 細(xì)胞核呈特有的藍(lán)色, 即有GFP-hUCMSC分布, 有的集中分布并形成規(guī)則結(jié)構(gòu)(圖1A), 有的以單個(gè)信號(hào)散在分布于肝臟組織(圖1B)，而接受胎肝內(nèi)注射相同體積生理鹽水的對(duì)照山羊肝臟內(nèi)觀察不到GFP-hUCMSC分布(圖 1C)。

表 1 PCR或RT-PCR擴(kuò)增引物及其退火溫度

圖 1 羔羊肝臟組織內(nèi)GFP-hUCMSC分布

2.2人SRY基因PCR擴(kuò)增

采用PCR檢測(cè)方法，可以從接受胎肝內(nèi)細(xì)胞注射的所有羔羊肝臟組織DNA中檢測(cè)到人SRY基因的表達(dá)，即長(zhǎng)度為120 kb的目的條帶，而沒有接受胎肝內(nèi)細(xì)胞注射的對(duì)照組羔羊肝臟組織DNA中擴(kuò)增不到目的條帶(圖2)。

圖 2 羔羊肝臟組織人SRY基因PCR檢測(cè)

2.3 人肝細(xì)胞特異基因在羔羊肝組織中表達(dá)

采用RT-PCR檢測(cè)方法，可以從接受胎肝內(nèi)細(xì)胞注射的山羊肝臟組織總RNA中檢測(cè)到人ALB基因(長(zhǎng)度為245 kb的目的條帶)和HNF3β基因(長(zhǎng)度為240 kb的目的條帶)(圖3)及HNF4α基因(長(zhǎng)度為113 kb的目的條帶)(圖4)的表達(dá)，而沒有接受胎肝內(nèi)細(xì)胞注射的對(duì)照組山羊肝臟組織中檢測(cè)不到人肝細(xì)胞特異基因的表達(dá)。

2.4 人肝細(xì)胞特異蛋白在羔羊肝臟中表達(dá)

肝臟切片免疫組織化學(xué)染色，可以從接受胎肝內(nèi)細(xì)胞注射的羔羊肝臟組織中檢測(cè)到人ALB蛋白和人HNF4a蛋白的表達(dá), 卻檢測(cè)不到人HNF3β蛋白的表達(dá)(結(jié)果未顯示)。ALB可規(guī)律地圍繞肝小葉靜脈周圍集中分布而呈現(xiàn)棕黃色環(huán)狀結(jié)構(gòu)(圖5A)，或者散在分布而呈現(xiàn)棕黃色點(diǎn)狀或片狀結(jié)構(gòu)(圖5B)。HNF4α多呈棕黃色環(huán)狀結(jié)構(gòu)分布(圖6A、B)。而沒有接受胎肝內(nèi)細(xì)胞注射的對(duì)照羔羊肝組織中未觀察到棕黃色染色(圖5C)。

圖 3 羔羊肝臟組織人ALB基因和HNF3β基因RT-PCR 檢測(cè)

圖 4 羔羊肝臟組織人HNF4α基因RT-PCR檢測(cè)

圖 5 羔羊肝臟組織人ALB免疫組織化學(xué)染色分析

圖 6 羔羊肝臟組織人HNF4α免疫組織化學(xué)染色

3 討論

肝移植被認(rèn)為是治療終末期肝衰竭最有效的方法，但供肝短缺和免疫排斥問題在很長(zhǎng)時(shí)期內(nèi)很難解決。運(yùn)用干細(xì)胞具有多項(xiàng)分化潛能的獨(dú)特生物學(xué)特性獲取功能性肝細(xì)胞，已成為近年來(lái)再生醫(yī)學(xué)研究追求的主要目標(biāo)之一[7]。體外研究[1]已經(jīng)證實(shí)，UCMSC可以被誘導(dǎo)向脂肪、軟骨及成骨組織分化，這為UCMSC的轉(zhuǎn)化應(yīng)用帶來(lái)了新的希望。本研究將來(lái)源于男嬰臍帶并經(jīng)基因轉(zhuǎn)染標(biāo)記的GFP-hUCMSC，定位注射于2月齡胎羊肝臟實(shí)質(zhì)區(qū)域。母羊分娩后，手術(shù)切取出生1個(gè)月的羔羊肝臟組織，在熒光顯微鏡下可以在冰凍切片視野內(nèi)找到GFP陽(yáng)性的熒光信號(hào)，而且這些熒光信號(hào)可集中分布形成一定規(guī)則的結(jié)構(gòu)，表明定位注射的GFP-hUCMSC不僅可以在免疫系統(tǒng)尚未發(fā)育成熟的山羊胚胎發(fā)育期的特殊生理環(huán)境條件下存活，而且獲得了生長(zhǎng)機(jī)會(huì)，與羔羊肝臟組織形成了兩種來(lái)源細(xì)胞相互移居共存的嵌合狀態(tài)。這與臍帶血宮腔內(nèi)移植和UCMSC治療肝纖維化研究報(bào)道一致[2,8]。

為了進(jìn)一步驗(yàn)證植入細(xì)胞在出生1個(gè)月的新生羔羊肝臟組織中的存在, 本研究從分子水平檢測(cè)了人類男性Y染色體上特定基因片段(SRY基因)的存在。Y染色體是雄性動(dòng)物細(xì)胞特異性的基因結(jié)構(gòu), 它不受細(xì)胞表型變化和移植時(shí)間的影響, 追蹤Y染色體細(xì)胞的存在, 是鑒定嵌合細(xì)胞最可靠的方法, 也是GFP轉(zhuǎn)基因標(biāo)記示蹤技術(shù)的有效補(bǔ)充。結(jié)果證實(shí)，接受胎肝內(nèi)定位注射來(lái)源于男嬰的hUCMSC并順利分娩生產(chǎn)的羔羊, 包括雌性羔羊肝臟組織, 其肝臟組織中均可擴(kuò)增出人SRY基因片段, 大小約為120 kb, 而對(duì)照組未擴(kuò)增出人SRY基因片段。結(jié)合綠色熒光信號(hào)分布的肝臟組織學(xué)觀察, 充分證明了所移植的來(lái)源于男嬰的hUCMSC可以在羔羊肝臟組織內(nèi)存活并形成嵌合狀態(tài)定居。

為了追蹤植入細(xì)胞的演變?nèi)ハ颍狙芯窟\(yùn)用RT-PCR方法和免疫組織化學(xué)染色方法從分子和蛋白水平鑒定了人肝細(xì)胞相關(guān)基因和蛋白的存在。結(jié)果顯示，接受胎肝內(nèi)定位注射hUCMSC并順利分娩生產(chǎn)的羔羊，出生1個(gè)月后其肝臟組織內(nèi)可以檢測(cè)到人HNF3β、HNF4α和ALB基因的表達(dá)，而沒有接受細(xì)胞注射的陰性對(duì)照同齡羔羊肝臟檢測(cè)不到這些基因的表達(dá)。運(yùn)用抗人的單抗進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色，結(jié)果顯示，注射過hUCMSC的實(shí)驗(yàn)羔羊肝臟組織中只可檢測(cè)到HNF4α和ALB蛋白的表達(dá)，HNF4α主要位于靜脈周圍，ALB廣泛分布于靜脈周圍等肝小葉很多區(qū)域。沒有接受細(xì)胞注射的陰性對(duì)照羔羊肝臟組織中檢測(cè)不到這些蛋白的表達(dá)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步證明，定位注射的hUCMSC不僅在胚胎發(fā)育期的胎羊肝臟內(nèi)存活并獲得了進(jìn)一步生長(zhǎng)發(fā)育的機(jī)會(huì)，而且在胎羊出生后，隨著羔羊免疫系統(tǒng)的發(fā)育和成熟，免疫耐受也隨之形成，植入的hUCMSC在胎肝生理微環(huán)境條件下分化為人類肝細(xì)胞樣的細(xì)胞，至少在mRNA和蛋白水平表達(dá)了人類肝細(xì)胞的部分特異標(biāo)志，在一定程度上形成了功能性人肝細(xì)胞樣細(xì)胞，體現(xiàn)了人肝細(xì)胞的特定生物學(xué)功能。UCMSC具有向肝細(xì)胞分化的潛能在其它相關(guān)的體內(nèi)外研究報(bào)道中也得到驗(yàn)證[8,9]。

肝富集轉(zhuǎn)錄因子(liver-enriched transcription factors)是一組主要存在于肝臟并調(diào)控肝特異基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子，在器官發(fā)育的調(diào)控中發(fā)揮著關(guān)鍵作用[10]，促進(jìn)肝臟的代謝[11]，主要包括6個(gè)家族的因子，其中HNF3β是參與肝臟發(fā)育過程的肝富集轉(zhuǎn)錄因子級(jí)聯(lián)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中最重要的轉(zhuǎn)錄因子,在胚胎發(fā)育的早期表達(dá)，對(duì)HNF4α等轉(zhuǎn)錄因子有調(diào)控作用。HNF4α是一種鋅指結(jié)構(gòu)蛋白, 其氨基酸序列在進(jìn)化過程中高度保守，在肝細(xì)胞發(fā)育和分化過程中發(fā)揮重要作用[12]。在肝臟發(fā)育早期，HNF4α即可激活一些肝臟基因表達(dá), 如甲狀腺激素結(jié)合蛋白等，但還是在成熟的肝細(xì)胞中表達(dá)量最高, 是調(diào)控肝細(xì)胞分化和維護(hù)肝細(xì)胞生物學(xué)功能的重要轉(zhuǎn)錄蛋白，在肝臟的形成和成人肝臟許多基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)中起關(guān)鍵作用。本研究結(jié)果顯示，接受細(xì)胞注射的新生1月齡羔羊肝臟組織中可以檢測(cè)到人HNF3β和HNF4α基因的表達(dá)，但免疫組織化學(xué)方法只能檢測(cè)到人HNF4α蛋白的表達(dá)，檢測(cè)不到人HNF3β蛋白的表達(dá)，此結(jié)果可能提示，HNF3β主要高表達(dá)于hUCMSC向肝細(xì)胞分化的早期過程，羔羊出生后其表達(dá)水平就大幅降低，致使本研究只能在mRNA水平上檢測(cè)到其表達(dá)，而不能在蛋白水平檢測(cè)到其表達(dá)。而由于HNF4α主要高表達(dá)于成熟肝細(xì)胞，是維護(hù)肝細(xì)胞正常生物學(xué)功能的重要因子，因此，本研究可以在mRNA和蛋白水平上均可檢測(cè)到其表達(dá)。白蛋白(ALB)主要由肝細(xì)胞合成分泌，是鑒定成熟肝細(xì)胞功能的經(jīng)典指標(biāo)，本研究可以在mRNA和蛋白水平上檢測(cè)到人ALB的表達(dá)，表明HNF4α維持了hUCMSC向肝細(xì)胞樣細(xì)胞分化的結(jié)果。

本研究結(jié)果初步表明，hUCMSC在胎羊肝臟發(fā)育的特定微環(huán)境內(nèi)，可以存活并獲得了進(jìn)一步生長(zhǎng)發(fā)育的機(jī)會(huì)，其在免疫系統(tǒng)逐步發(fā)育成熟的羔羊肝臟內(nèi)維持至少一個(gè)月，這預(yù)示著免疫耐受基本形成，hUCMSC用于人類肝病治療至少在嬰幼兒或許是可行的。