牛棒狀桿菌環介導等溫擴增快速檢測方法的建立及初步應用

馮 潔, 張 泉, 錢 淼, 謝建云, 高 誠

(1.揚州大學獸醫學院, 揚州 225009; 2. 上海實驗動物研究中心,上海市實驗動物質量監督檢驗站, 上海 201203)

牛棒狀桿菌(Corynebacterium bovis, C.bovis)是一種革蘭氏陽性小桿菌，條件性致病，世界范圍內廣泛分布，可感染多種動物，可導致裸小鼠表皮角化過度，俗稱“鱗皮病”，也是引起奶牛乳房炎的常見病原菌之一[1,2]。無毛鼠、免疫缺陷鼠一旦感染，幾乎終身攜帶。感染小鼠表現鱗屑狀皮炎，SCID小鼠則出現脫毛、形成禿塊等癥狀。通常呈一過性感染，感染后7～10 d出現“鱗屑”，14～20 d內自行消失，但感染至少要持續30 d左右。組織學檢查可出現棘皮癥、角化過度，真皮層可觀察到單核細胞浸潤[3-5]。感染動物通常伴隨體質量減輕、結膜充血、攝水量增加、異種移植物生長緩慢等現象。對實驗動物質量和實驗結果有較大影響，因此已被全球眾多實驗動物機構列為實驗大、小鼠尤其是免疫缺陷鼠的重點監測病原體之一。我國于2010年首次報道該菌感染情況[6], 但至今尚未列入國家標準規定的監測項目。僅在2017年頒布的團體標準[7]中規定了該菌的分離培養和PCR檢測方法。本研究擬建立一種特異、敏感、高效的環介導等溫擴增(loop-mediated isothermal amplification, LAMP)檢測方法，旨在為牛棒狀桿菌的監測提供技術支持。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

牛棒狀桿菌ATCC 7715(C.bovis)、嗜肺巴斯德桿菌ATCC 35149(P. pneumotropica)、支氣管鮑特桿菌ATCC 14065(B. bronchiseptica)、金黃色葡萄球菌ATCC 6538(S. aureus)、綠膿桿菌ATCC 27853(P. aeruginosa)、嚙齒檸檬酸桿菌ATCC 51116(C. rodentium)均購自美國標準生物品收藏中心(American type culture collection，ATCC);鼠傷寒沙門菌CMCC50115(S. typhimurium)、福氏志賀菌CMCC 51572(S. flexneri)、肺炎克雷伯桿菌CMCC 46117(K. pneumoniae)均購自中國醫學微生物細菌保藏管理中心。

脫氧核糖核酸擴增試劑盒(LAMP法)購自北京藍譜生物科技有限公司，細菌基因組DNA提取試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司，DL2000 DNA Marker購自日本TaKaRa公司，瓊脂糖購自西班牙Bio-west公司，GoldViewTM核酸染料購自上海賽百盛(SBS)基因技術有限公司。實時濁度儀LA-320c，購自日本榮研化學株式會社。

1.2 方法

1.2.1 引物設計與合成 根據GenBank公布的牛棒狀桿菌16S rRNA基因序列，針對其保守區域利用LAMP在線設計軟件設計一套LAMP引物，包括外引物F3和B3、內引物FIP和BIP和環引物LB。引物序列如表1，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

表 1 LAMP擴增引物序列Table 1 The sequences of LAMP primers

1.2.2 基因組DNA提取按照Tiangen細菌基因組DNA抽提試劑盒說明書進行操作。提取的細菌基因組DNA經紫外分光光度計測定A260/280在1.6～2.0范圍內方可使用。獲得DNA樣品于-20 ℃保存備用。

1.2.3 LAMP方法的建立與優化以牛棒狀桿菌基因組為擴增模板，滅菌純凈水為空白模板，采用稀釋好的LAMP引物，參照LAMP擴增試劑盒說明，采用表2體系進行預實驗。將反應管置于實時濁度儀內反應并繪制曲線，曲線上升表示發生擴增反應即為陽性。為確保反應精確性，設置60～66 ℃擴增溫度范圍、30～75 min反應時間，對反應條件進行優化。

表 2 LAMP擴增體系Table 2 The Amplification system of LAMP

1.2.4 擴增產物檢測經2.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測或直接熒光染料目測觀察。取2 μL擴增產物經瓊脂糖凝膠電泳檢測，若出現LAMP特征性的梯形帶則判為陽性，未出現擴增條帶則判為陰性。在LAMP反應結束后目測，反應管出現綠色熒光判為陽性，橙色則判為陰性。

1.2.5 LAMP特異性檢測 以牛棒狀桿菌基因組DNA為陽性對照模板，滅菌純凈水為陰性對照模板，嗜肺巴斯德桿菌、支氣管鮑特桿菌、金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌、鼠傷寒沙門菌、福氏志賀菌、嚙齒檸檬酸桿菌、肺炎克雷伯桿菌基因組DNA為模板，利用本文建立的LAMP檢測方法分別進行擴增，以評價該方法的特異性。

1.2.6 LAMP靈敏度檢測 牛棒狀桿菌基因組DNA模板按10 倍梯度稀釋成11.8 ng/μL、1.18 ng/μL、118 pg/μL、11.8 pg/μL、1.18 pg/μL、118 fg/μL、11.8 fg/μL、1.18 fg/μL共8個稀釋度作為模板，采用本文建立的LAMP檢測方法進行擴增，以確定其最低檢測限。

1.2.7 臨床應用驗證無菌采集52只SPF級小鼠(BALB/c小鼠17只, 裸小鼠35只, 均為上海市實驗動物生產許可證單位年檢抽檢樣品)回盲部內容物0.2 g, 懸浮于1 mL PBS(pH7.4)中制成懸液, 按照細菌基因組DNA提取試劑盒說明書提取DNA。分別采用LAMP法和團體標準(T/CALAS 20-2017)實驗動物 牛棒狀桿菌檢測方法[7]進行檢測，對檢測結果進行分析。

2 結果

2.1 LAMP檢測方法的建立

為優化擴增條件，對不同反應溫度和反應時間進行摸索。如圖1所示，溫度優化的結果顯示60～66 ℃都能將陽性核酸擴增，對照正常，其中64 ℃的出峰時間最早，反應效率較高，故選擇64 ℃反應60 min為最佳反應條件。如圖2所示，采用本研究建立的LAMP擴增體系對樣品進行擴增，結果經電泳檢測可見典型梯狀條帶，陰性對照未見條帶。初步表明本研究建立的LAMP擴增方法可行。

圖 1 LAMP反應溫度的優化Figure 1 The optimization of the amplification temperature

圖 2 牛棒狀桿菌LAMP擴增結果檢測Figure 2 LAMP detection of C. bovis

2.2 LAMP特異性檢測

分別以嗜肺巴斯德桿菌、支氣管鮑特桿菌、金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌、鼠傷寒沙門菌、福氏志賀菌、嚙齒檸檬酸桿菌、肺炎克雷伯桿菌的基因組DNA為模板進行LAMP擴增，牛棒狀桿菌基因組DNA為陽性對照模板，滅菌純凈水為陰性對照模板。結果如圖3、圖4所示，僅牛棒狀桿菌出現上升性擴增曲線即特異性擴增，而其他菌株均未出現擴增，表明建立的LAMP檢測方法特異性良好。

2.3 LAMP靈敏度檢測

圖 3 特異性試驗LAMP擴增圖Figure 3 LAMP amplification of specificity test

以11.8 ng/μL的牛棒狀桿菌基因組DNA為起始濃度, 按10倍梯度稀釋后進行LAMP擴增, 以驗證LAMP檢測體系的敏感性。結果顯示本研究建立的LAMP方法能夠檢出的最低模板量為118 fg(圖 5)。

2.4臨床應用驗證

應用本文建立的LAMP檢測方法和團體標準推薦的PCR方法對52份樣品進行檢測。結果如表3所示，LAMP陽性檢出率為98.08%(51/52)，PCR陽性檢出率為94.23%(49/52), LAMP方法的陽性檢出率較PCR高3.85%, 二者符合率為96.15%。

圖 4 LAMP特異性試驗Figure 4 Specificity test of LAMP

表 3 LAMP和PCR方法的比較Table 3 Comparison of LAMP and PCR

3 討論

牛棒狀桿菌可寄居于感染小鼠的口腔、消化道，引起小鼠角化過度和體質量減輕，牛棒狀桿菌感染可影響腫瘤生長、干擾異種移植、改變自然殺傷(NK)細胞活性等。因此感染了該菌的小鼠被認為不適用于科學實驗[8-10]。近年來，國際上實驗動物設施內牛棒狀桿菌污染的案例時有發生，牛棒狀桿菌感染成為裸小鼠常見病原體之一[11-14]。實驗動物設施內牛棒狀桿菌感染控制非常困難，傳播迅速，發病率高但死亡率低。攜帶牛棒狀桿菌而無臨床癥狀的裸小鼠是該病重要的傳染源，可通過污染物如動物皮屑、墊料、籠具、手套及隔離衣等進行直接傳播，還可經移植的腫瘤細胞系進行傳播。已污染的設施內通過生物安全柜進行籠盒的更換及相關操作，并不能有效防止該菌的傳播[15]。控制該病原體最有效的方法是減少飼養密度和大范圍的環境凈化。屏障系統、限制人員及物品進出、物品進入設施前充分消毒也是重要的保護手段。環境一旦被污染則很難清除。對于污染群體，一般建議全群淘汰，通過熏蒸重新凈化環境，對于珍貴動物則需采用胚胎移植手段進行凈化。

圖 5 LAMP敏感性試驗Figure 5 Sensitivity test of LAMP

目前，該病可通過培養法和分子生物學方法進行診斷。牛棒狀桿菌為革蘭氏陽性小桿菌，菌體短小、一端或兩端膨大呈棒狀，無鞭毛、無莢膜、無芽孢，兼性厭氧。生長緩慢，分離困難，因裸小鼠皮膚表面的其他微生物生長速度快，直接從皮膚組織進行細菌分離培養，會出現雜菌阻礙牛棒狀桿菌生長，甚至將其覆蓋，往往會造成漏檢[9]，不適用于大規模流行病學調查。分子生物學檢測方法具備高效快速、操作簡便等優勢，近年來應用十分廣泛，尤其對于生長緩慢及苛養菌的檢測尤為適用。LAMP技術是2000年Notomi等[16]報道的一種快速核酸擴增技術, 該技術利用一種鏈置換DNA聚合酶(Bst DNA polymerase)和2對特殊引物, 特異性識別靶序列上的6個獨立區域, 在等溫條件下(65 ℃左右)保溫數十分鐘即可完成核酸擴增。反應結果可通過反應副產物焦磷酸鎂白色沉淀直接進行肉眼觀察判定, 無需特殊、昂貴儀器。因具備簡單、快速、靈敏、特異、易于推廣等優勢, 尤其適合于現場使用, 已廣泛應用于病原體的快速檢測和早期診斷。但是, LAMP的靈敏度高，一旦開蓋容易形成氣溶膠污染，分區不嚴格則易造成假陽性，在操作過程中應盡量規避。另外，該方法對引物設計要求比較高。

16S rRNA具有高度的保守性和特異性，已成為細菌基因分類理想的靶序列，可實現對細菌的快速、特異、靈敏檢測，應用日益廣泛。本研究根據牛棒狀桿菌16S rRNA基因序列設計一組LAMP擴增特異性引物，對新建LAMP檢測體系進行條件優化、特異性和敏感性分析。實驗結果顯示，LAMP擴增可在恒溫條件下短時間內完成檢測，特異性好，靈敏度較PCR高。檢測結果可直接通過肉眼實現可視化觀察，無需開蓋進行電泳，操作簡便、高效，且避免了核酸污染檢測場所。臨床檢測數據表明，PCR和LAMP兩種分子生物學檢測方法相比，LAMP方法敏感性較PCR方法高，與敏感度檢測結果一致, PCR檢測呈陽性的樣品均能被LAMP方法檢出。分子生物學檢測方法具備精準、高效、便捷的優勢，可用于病原體的初步篩查，但仍需結合分離培養等病原學檢測金標準進行驗證。

綜上，本研究建立了牛棒狀桿菌LAMP快速檢測方法，與現有技術相比不受培養條件和檢測儀器的限制，具備簡便、快捷、特異、靈敏的優勢，結果判定簡單易行，可用于實驗動物、相關動物源性生物制品及實驗動物環境中牛棒狀桿菌的檢測，該方法的建立可為實驗動物質量控制提供技術支撐。