中國倉鼠口腔鱗癌miR-504的表達特征分析

衛佳寧, 續國強, 高繼萍, 王曉堂, 肖蘭飛, 宋國華

(山西醫科大學實驗動物中心, 實驗動物與人類疾病模型動物模型山西省重點實驗室, 太原 030001)

口腔鱗狀細胞癌(oral squamous cell carcinoma,OSCC)是頭頸部最常見的惡性腫瘤之一，約占頭頸部惡性腫瘤的90%左右[1]，其發病率在全球呈逐年上升趨勢[2]。每年頭頸部惡性腫瘤新發病患者人數高達60萬例[3,4]，且患病人群趨向于年輕化[5]，這對人類健康和生命構成了嚴重的威脅。

微小RNA(microRNA，miRNA)是具有調控基因表達功能的非編碼小分子單鏈RNA, 在癌癥以及其他疾病的發生、發展中發揮著重要作用, 參與了腫瘤細胞的增殖、侵襲和轉移等生物學特性的調控過程, 發揮類似癌基因或抑癌基因的作用。關于miRNA在OSCC方面的研究有: miR-29b-1-5p誘導OSCC的上皮間充質轉化[6]; miR-125b通過靶向抗氧化因子過氧化物樣酶2A(peroxiredoxin-like 2A, PRXL2A)來抑制口腔致癌性[7]; miR-127-3p靶向驅動蛋白(kinesin-like protein，KIF3B)以抑制OSCC的發展[8]; miR-199a-5p通過靶向絲氨酸-蘇氨酸激酶/核因子κB (IKKβ/ NF-κB)信號通路在OSCC中起腫瘤抑制劑的作用[9]等相關研究，miR-504是我們課題組前期通過對中國倉鼠OSCC模型高通量測序篩選得到的，目前其在OSCC方面的相關研究知之甚少。

中國倉鼠是我國具有特色的實驗動物，其口腔兩側各有一個伸縮性大的頰囊，頰囊組織主要由纖維組織、鱗狀上皮細胞及疏松結締組織構成，血供豐富，微血管網密、顏色淡、透光性好，是進行OSCC研究的理想動物模型[10]。本實驗室完成了中國倉鼠口腔頰囊組織miRNA高通量測序和生物信息學分析，鑒定得到差異表達的miRNA共有268個, 137個表達上調, 131個表達下調, 其中miR-504表達下調[11]。本文對miR-504進行了克隆測序, 并對其結構進行預測, 采用qRTPCR方法鑒定miR-504中中國倉鼠OSCC模型的癌組頰囊和癌旁舌組織的不同階段的表達特征, 為OSCC中miR-504下游相關通路研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 動物模型建立及分組

選取清潔級雄性中國倉鼠90只，8～10周齡，體質量30～40 g(誤差不大于10%)，山西醫科大學實驗動物中心生產[SCXK(晉)2015-0001];90只中國倉鼠分為3組: 空白組30只、陰性對照組12只、實驗組48只, 空白組不做處理，陰性對照組涂抹丙酮，實驗組涂抹丙酮溶解的0.5%二甲基苯丙蒽(9,10-Dimethy1-1, 2-Benzanthracence，DMBA)。倉鼠分籠飼養在屏障動物實驗設施中[SCXK(晉)2015-0001]，飼養室溫度 23～25 ℃，環境相對濕度40%。涂藥后禁食禁水2 h，其余時間自由進食和飲水，仔細觀察每只鼠的生活狀況，對外觀產生病變的鼠及時進行標記。

1.2樣本采集及病理HE染色

模型建立開始，隔日涂一次DMBA。定期在造模6周、12周和18周解剖13只(8只實驗組+5只對照組)倉鼠取樣：取倉鼠的左右頰囊和舌組織，將采集的一部分頰囊組織和所有舌組織做好標記立即放入液氮中冷凍，然后于-80℃冰箱中保存，以備提取RNA; 另一部分頰囊組織放入質量分數4%多聚甲醛溶液中固定24～72 h，然后進行乙醇溶液梯度脫水、石蠟包埋、切片、伊紅-蘇木素(HE)染色、中性樹脂封片。

1.3 RNA提取及反轉錄

采用Trizol試劑(日本TaKaRa公司)提取組織中的RNA, 按照說明書操作。用酶標儀(FLX-8000型, 美國Gene公司)對RNA的濃度和純度進行定量評估，參照miRNA cDNA第一鏈合成試劑盒(日本TaKaRa公司)說明書合成cDNA，10 μL反應體系: mRQ Buffer (2×) 5 μL，組織中提取的miRNA(0.25～8 μg) 3.75 μL，mRQ Enzyme 1.25 μL。在PTC-200PCR儀上進行反轉錄反應程序設置：第一步在單引物的介導和反轉錄酶的催化下合成RNA的互補鏈cDNA: 37℃，60 min; 第二步加熱后cDNA與RNA鏈解離: 85℃, 5 min。最終生成miRNA對應的 cDNA 第一鏈，-20 ℃保存備用。

1.4miR-504前體序列的克隆

中國倉鼠中miR-504的成熟體序列來自miRBase數據庫，將成熟體序列比對到OSCC基因組，得到miR-504前體的基因組序列，根據所獲得的序列設計特異性miR-504引物(表1)，用于擴增miR-504的前體序列，克隆得到了符合預期結果的片段，連接到GV268載體上(GENE，吉凱基因)，轉化質感受態細胞中，挑取單克隆，經過驗證得到陽性克隆的序列，將測序結果在miRBase(http://www.mirbase.org/)上進行BLAST分析，并使用miRNA前體二級結構在線預測軟件The mfold Web Server（http://unafold.rna.albany.edu/?q=mfold/RNA-Folding-Form）對miR-504前體進行二級結構預測。

1.5頰囊和舌中miR-504實時定量分析

使用RT-PCR方法檢測miR-504在中國倉鼠OSCC四個階段中的表達特征。RT-PCR 實驗正向引物基于 miRNA 成熟體序列設計, 反向引物使用 miRcute miRNA qPCR (TaKaRra公司, 日本)檢測試劑盒自帶的引物。用U6基因作為內參，引物序列見表1。RT-PCR按照TaKaRa試劑盒說明書進行操作，25 μL 反應體系: 正向引物 0.5 μL，反向引物0.5 μL，ROX Dye (50×) 0.5 μL，miRNA第一鏈cDNA 2.0 μL，SYBR Advantage Premix (2×) 12.5 μL，ddH2O 9 μL。在Real time PCR 儀(美國ABI 公司)上進行RT-PCR反應程序設定，反應條件，步驟 1∶95℃ 5 min；步驟2∶95 ℃ 30 s, 60 ℃ 30 s，40 個循環，實驗重復3次, 每組設置3個重復, Ct值取3個重復的平均值, 結果以 2-ΔΔct相對表達量表示[12]。2-ΔΔCt計算方法: ΔΔCt=[(樣本Ct目的基因-樣本Ct內參基因)-(對照組Ct目的基因-對照組 Ct內參基因)]。

表 1 熒光實時定量PCR引物序列

1.6miR-504的qRT-PCR數據統計分析

采用SPSS 17.0統計軟件對qRT-PCR檢測結果的數據進行分析, 對PCR結果的數據采用±s表示，結果采用t檢驗，多組樣本均數間的兩兩比較采用單因素方差分析法(ANOVA)中的LSD法，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 中國倉鼠頰囊組織病理學觀察

光學顯微鏡下，正常頰囊組織棘細胞層薄，基底層細胞明顯、排列整齊, 釘突不明顯，空白組和陰性對照組組織學觀察一致, 未出現異常改變(圖1A和B); 模型組在6周時頰囊黏膜出現輕度充血，病理觀察可見棘層細胞增厚, 基底層細胞形態正常，相對于正常組略微增厚, 極少數釘突形成(圖1C); 12周時黏膜增厚, 病理觀察見棘層細胞明顯增厚，基底層細胞增生且呈明顯改變，釘突較6周明顯增寬(圖1D); 18周時局部有白斑樣病變和糜爛，病理觀察見棘層細胞呈單個或成團角化，基底層細胞增厚，大部分的基底層細胞異常增生，大量細胞極性消失，散亂排列(圖1E)。

圖 1 中國倉鼠頰囊黏膜癌變的組織病理學觀察 (HE×200)Figure 1 Histopathological observation of mucosal carcinogenesis in Chinese hamsters (HE×200)

2.2miR-504前體序列的克隆及測序驗證

測序結果去除載體后顯示片段大小為325 bp,將該序列在miRBase(http://www.mirbase.org/)數據庫進行BLAST分析，結果顯示該序列與野豬、獼猴、黑猩猩、犬、牛、人、小鼠等的miR-504具有同源性。測序比對結果如下(紅色為miR-504前體序列):

2.3 miR-504前體二級結構預測

通過 The mfold Web Server 分析, 頰囊 miR-504前體序列的二級結構有6個，其中由最小折疊自由能(Δ G =-76.40 kcal/mol)形成的二級結構最穩定 (圖 2)，可以看出口腔頰囊miR-504 前體序列二級結構具有典型的頸環結構特征。經二級結構分析和 miRBase 前體序列同源性分析，在前體序列中發現了miR-504的成熟體序列，確認克隆得到的序列為miR-504 前體序列。

2.4miR-504在OSCC頰囊組織四個階段表達量

采用qRT-PCR方法檢測頰囊樣本中miR-504的表達量，miR-504和內參U6特異性擴增，熔解曲線均為單一峰，特異性較好。采用2-ΔΔct法計算相對表達量，每周組織的個體數為3只，每個至少重復3次，可以準確反映miRNA的表達情況。經過統計學分析，miR-504在頰囊組織中的表達特征如下：在6周、12周和18周時，實驗組的表達量約是空白組的0.83、0.33，0.23倍; 12周時的表達量顯著低于前一個時間段(P＜0.001)，其余兩組兩兩比較差異有顯著性(P＜0.05); 相對于空白組，實驗組miR-504的表達水平均較低(圖3左)。

圖 2 miR-504 前體序列形成的頸環結構Figure 2 Hairpin structures formed by precursor sequences of miR-504

圖 3 中國倉鼠OSCC的miR-504相對表達量Figure 3 Relative expression of miR-504 in OSCC of Chinese hamster

經過統計學分析, miR-504在舌組織中的表達特征如下：在6周、12周和18周時，miR-504在舌組織的相對表達量約是正常舌組織的0.92、0.84、0.27倍， 12周和18周miR-504的相對表達量差異性極顯著(P＜0.01)，相應的miR-504的表達水平不斷降低(圖3右)。

2.5中國倉鼠OSCC模型中癌組織頰囊和癌旁組織舌中miR-504表達差異比較

結果顯示, 相對于正常組織, 在6周、12周、18周的實驗組頰囊和癌旁舌組織中miR-504的表達水平在不斷下調，且差異有顯著性(圖4)。

圖 4 中國倉鼠OSCC的miR-504表達水平Figure 4 Expression of miR-504 in OSCC of Chinese hamster

3 討論

近年來，除了基于臨床的對OSCC相關病因、診斷標準和預后的回顧性研究，研究人員越來越重視OSCC動物模型的建立，旨在進行OSCC發病機制與抗癌藥物藥理學的研究。目前關于OSCC動物模型方面有注射法建立金黃倉鼠頰囊癌模型[13]，質量分數0.002%的4-硝基喹林-1-氧化物(4-NQO)飲水法誘導Wistar大鼠舌白斑癌變動物模型[14]等。每種方法有各自的特點，相對于飲水法，涂抹法能有效避免OSCC癌變以外的并發癥。本研究使用的中國倉鼠源于我國，具有中國特色的實驗動物，利用其兩側大頰囊的特點制備OSCC動物模型具有顯著優勢。

前期的研究采用二代高通量測序技術篩選出與OSCC通路相關的差異表達的基因miR-504[11],本文研究了miR-504在中國倉鼠頰囊和舌組織中的表達特征。首先克隆得到中國倉鼠miR-504前體,經The mfold Web Server對前體進行二級結構預測,miR-504能形成經典的頸環結構。初級miR-504經過2個步驟的剪切最終形成成熟的miR-504。第一步在細胞核中，初級miR-504由RNase Ⅲ內切酶家族的Drosha酶剪切成頸環結構的miR-504前體; 第二步在細胞質中，由RNase Ⅲ內切酶家族的Dicer酶剪切成RNA雙鏈復合體，該復合體在Dicer酶作用下解旋, 其中一條或者兩條與AGO蛋白形成RNA的沉默復合體(RNA-induced silencing complex，RISC)。包含RNA的RISC通過成熟miRNA識別沉默靶標，并與靶標基因的mRNA的3’非編碼區域進行互補配對，引導RISC與靶標基因結合或將靶標基因降解，從而達到調控靶標基因表達的目的[15]。與人類基因組的其他區域或基因座相比，miRNA基因的單核苷酸多態性(single nucleotide polymorphism, SNP)較低[16,17]。此外, Han等[18]通過NCBI和UCSC數據庫挖掘數據和分析指出miRNA的保守性, 概因二級結構及其功能的重要性影響了miRNA基因中SNP的積累。

目前, 關于miR-504在其他疾病及相關信號通路中的研究有不少。如miR-504通過抑制Frizzled-7介導的Wnt /β-連環蛋白信號傳導而在肝細胞癌中起腫瘤抑制劑的作用[21]; miR-504通過在非小細胞肺癌中靶向賴氨酰氧化酶樣蛋白2(LOXL2)來抑制細胞增殖和侵襲[22]; miR-504通過靶向腫瘤蛋白p53誘導的核蛋白1(TP53INP1)促進人骨肉瘤中的腫瘤生長和轉移[23]; miR-504還是一種腫瘤抑制性microRNA，通過靶向人腦膠質瘤中的FOXP1來抑制細胞增殖并促進細胞凋亡[19]; 結締組織生長因子(CTGF)通過激活miR-504 / FOXP1信號傳導來調節OSCC的侵襲性[24]。這些研究為探討miR-504在OSCC發生發展中分子機制提供了借鑒。

本實驗顯示, DMBA涂抹過的頰囊中miR-504的表達下調, 而癌旁舌組織中miR-504的表達先降低后升高。有文獻[19]報道, miR-504在FOXPI(FOX家族基因)的相關通路中高表達并發揮促癌作用;在周期蛋白依賴性激酶6(cyclin-dependent kinases 6, CDK6)的相關通路中低表達并發揮抑癌作用[20]。癌組頰囊和癌旁組舌中miR-504的表達出現的差異，可能與相關信號通路上的調控機制相關。

綜上所述，DMBA涂抹法建立的中國倉鼠OSCC動物模型為研究OSCC的發病機理提供了可靠的材料，顯著下調的miR-504與OSCC的發生機制有關，可能是OSCC診斷的潛在標志物。因此，從miR-504對OSCC的致病機制及相關信號通路的研究具有重要意義，可為臨床OSCC的早發現早治療提供依據。