七甲川菁類化合物在腫瘤模型活體成像研究中的應用

師長宏

(空軍軍醫大學實驗動物中心, 西安 710032)

近紅外熒光(near-infrared fluorescence, NIFR)染料有著較高的體內消除率和較大的斯托克斯位移(Stoke’s shift), 能夠誘發產生700～1 000 nm的強熒光[1]，為腫瘤診斷提供了可能性。該類染料應用于體內成像，顯示出諸多優勢，比如能夠標記配體、產生信號強、組織吸收好、背景自發熒光低等[2-3]。吲哚菁綠(ICG)是目前唯一被美國FDA批準可用于臨床診斷的NIFR染料, 被廣泛應用于鑒別良性或惡性腫瘤[4]。常規NIFR染料一般需要與腫瘤細胞特異靶向配體結合才能用于腫瘤成像, 靶向配體包括代謝底物[5]、細胞表面肽[6]、生長因子[7]、抗體[8]以及腫瘤細胞表面特異性抗原等[9]。因為靶向配體不同，而腫瘤細胞又具有異質性，所以只有一些特異型腫瘤細胞才能被該類染料識別。另外，配體與腫瘤細胞的化學結合可能會改變這類染料用于成像的靶向性。

七甲川菁(Heptamethine carbocyanine) NIFR染料兼具成像和腫瘤靶向的雙重功能，可用于腫瘤模型的活體成像。比如IR-780[10]，IR-783[11]，IR-808[12]和MHI-148[13]等。這些染料可直接被腫瘤細胞而不被正常細胞吸收，并集聚于線粒體和溶酶體中，不需要化學修飾便直接可識別腫瘤細胞。該類染料自發熒光低，但當它們與生物分子結合時，由于化學修飾便激發出較強的熒光。小鼠實驗[14]已證實這些染料細胞毒性較低，應用于臨床具有較好的安全性。

1 七甲川菁染料的理化特性

七甲川菁染料是由多聚甲炔構成的一個共振結構，兩側分別由一個氮原子參與形成共軛雜環[15](圖1)。傳統的花青染料光穩定性差，有自聚集效應并且在水溶液中光量子產率低。為了解決這些問題，人們嘗試對這些染料進行結構修飾。比如，在花青染料的多聚甲基炔鏈中引入環已烯基，其光穩定性和熒光強度都有了顯著提升。當引入了硫酸基團后，不僅有效避免了熒光信號的減弱，而且還可以減少染料的自聚集效應。結構中的多聚甲炔鏈可以抑制內部能量轉換和二聚體化，增加熒光信號的強度和穩定性[16]。一般化學結構中多聚甲炔鏈越長其結構越不穩定，但是移入環類基團，就可以提升結構的強度，減少內部能量轉化而增加內部量子的產率。

理想的NIRF染料不僅要能被腫瘤細胞直接靶向識別，而且還要有一定的水溶性和脂溶性，在體內清除效率適當，還易于進行結構修飾，如便于與標記探針、放射性核素和化療藥物等，從而提高識別腫瘤細胞的敏感性。比如一側修改為磺酸基提高其水溶性，另一側保持羧基結構，便于進行化學修飾。

2 NIRF染料在腫瘤移植模型中應用

七甲川菁類染料已被證實[15,17]能被多種不同類型腫瘤細胞而非正常細胞特異吸收，包括循環腫瘤細胞(CTC)、異種移植腫瘤和原發性腫瘤等，也可直接被裸小鼠體內原發灶或繼發灶中腫瘤細胞特異性攝取并聚集。在臨床工作中，這些具有腫瘤成像和靶向定位雙重特性的染料，為監測腫瘤生長和在外科手術中辨識腫瘤手術切緣提供了可能。通過實時NIRF成像，可以明確腫瘤組織病變邊緣的精確位置, 因而降低了漏檢陽性位點的可能性, 提升了腫瘤外科手術的治療效果[18]。手術切除肝轉移瘤時，通過NIRF成像，可以鑒別肝臟的良惡性病灶，尤其用于檢測小于5 mm的轉移瘤，具有明顯的優勢[19]。在兔VX2肝癌細胞原位移植模型中，注射腫瘤靶向性七甲川菁化合物DZ-1后，使用NIFR術中探測儀可清楚的探查到肝癌發生的部位及邊緣(圖2)，為手術切除提供依據[18]。

圖 1 七甲川菁NIFR染料的基本化學結構

圖 2 七甲川菁化合物DZ-1在兔VX2肝癌移植模型手術探查中的應用[18]

由于犬的原發和繼發性腫瘤的發展過程和人體十分相似，為了評估七甲川菁染料在大型動物體內的腫瘤特異性靶向能力，選擇自發性腫瘤犬作為模型，通過光學成像和正電子發射計算機斷層顯像/X線計算機體層成像儀(PET/CT)掃描兩種方式同時來判定NIRF染料的攝取和聚集特性[20],為其臨床應用提供了可行性。七甲川菁染料IR-783與化療藥物吉西他濱(NIRG)共軛結合成為IR-783-NIRG, 該染料作為藥物載體能通過血腦屏障和血腫屏障(圖3)，將藥物轉運至腦腫瘤部位，結果顯示IR-783-NIRG能顯著抑制顱內膠質瘤的生長[21]。上述結果為七甲川菁染料的臨床應用和未來發展都提供了重要的實驗依據。

將臨床新鮮的腫瘤標本移植到裸小鼠腎包膜建立人源腫瘤組織異體移植(patient derived tumor xenograft, PDX)模型, 可以使用七甲川菁染料進行活體成像確認該部位腫瘤的形成[22]。使用該方法,已經篩選出多個不同類型的PDX模型, 包括胃癌、肝細胞癌和腎癌等[17,18,22]。在移植部位均可早期檢測到較強的NIRF信號, 通過HE染色進一步確認了腫瘤組織的形態。

圖 3 IR-783通過血腦屏障與SCID小鼠顱內移植膠質瘤的靶向結合[21]

3 七甲川菁染料結合同位素用于PET成像

核素成像用于腫瘤的探查具有較多的優勢，但該類探針用于PET示蹤時常表現出半衰期短、空間分辨率低和射線下暴露等缺點，而且高基礎代謝率的組織如大腦會攝取較多的核素。 七甲川菁染料可以直接靶向定位腫瘤細胞，所以，NIRF聯合同位素成像將可能替代傳統的核素成像用于腫瘤的早期診斷[23]。核素標記七甲川菁染料，可以提升該類染料探查深層組織內腫瘤的敏感性。比如將高表達RNKL的人前列腺癌細胞LNCaP皮下接種裸小鼠制備移植模型, 使用七甲川菁染料PC-1001進行活體成像顯示了裸小鼠體表的2處腫瘤，而PC-1001/PET成像則還可以探查到一個更深部位的腫瘤[24]。多種PET示蹤元素已經被應用在NIRF核素成像的實驗性腫瘤模型上,包括18 F、11 C、99 mTc、64 Cu和 111 In[25]等。

最近，有人合成了一種用于乳腺癌PET成像的PET/NIRF探針PC-1001/64Cu，該探針由七甲川菁染料PC-1001和64 Cu經化學修飾合成[24]，在人乳腺癌細胞和裸小鼠移植模型中均表現出較高的腫瘤特異性攝取率和聚集特性, 而正常組織攝取率較低。也有報道[26]將七甲川菁染料PC-1007和99 mTc化學修飾合成，這種探針在腫瘤細胞和移植模型上均表現出較好的靶向性，并能在腫瘤部位特異性聚集。為了進一步評估七甲川菁染料在大型動物體內的腫瘤特異性靶向能力, PC-1001/68Ga成功應用于自發腫瘤犬的PET和熒光成像，PET/CT圖像顯示出了七甲川菁染料聚集部位，病理分析確認了二者的一致性[20]。

4 七甲川菁染料靶向識別腫瘤細胞的機制

腫瘤組織缺氧環境是調控七甲川菁染料特異性識別腫瘤細胞的重要機制[27], 而吲哚青綠(ICG)染料識別腫瘤細胞主要通過與血漿蛋白質的物理性結合來實現[28]，尚無證據表明ICG特性吸收與腫瘤組織缺氧環境有直接關聯。在裸小鼠腫瘤移植模型的活體成像中，ICG只有相對較低的腫瘤組織/背景組織比率(tumor-to-background ratio)，24 h時維持在1.4～1.7[18], 而七甲川菁染料MHI-148的比率卻高達9.1，當與缺氧相關的低氧誘導因子1α(HIF1α)蛋白高表達時, 該比率可進一步提升2倍, 這也是七甲川菁類染料相比于其他NIRF染料在腫瘤成像中的優勢所在。有機陰離子轉運肽(OATPs)在轉運七甲川菁染料進入腫瘤細胞的過程中也起到重要作用[27]。OATPs介導兩性化合物的細胞轉運, 包括藥物和其他一些外源性物質[16,29]。目前已報道[30]的人類OATPs有11種，按其氨基酸序列的同源性被分成6個家族。其中OATP1B3可有效調控七甲川菁染料IR-780和IR-783在腫瘤細胞內的轉運, 如果使用OATP1B3競爭性抑制藥物—碘溴酞鈉(bromsulphthalein sodium, BSP), 可明顯減弱腫瘤細胞對七甲川菁的特異性攝取[15,20]。

缺氧是腫瘤組織普遍存在的現象, 通常與新陳代謝、血管形成、腫瘤轉移和藥物抗性的形成等密切相關, 文獻[31]報道HIF1α直接促進了OATP1B3的表達。HIF1α的活性核蛋白與OATP1B3啟動子中的HRE相互作用，增強了OATP1B3基因的轉錄功能。而在有氧的環境中(正常組織)，HIF1α通過PHD/VHL途徑迅速被降解而變得不穩定[32]，這也是正常組織OATP1B3處于較低水平的主要原因。因此，正常組織和細胞中HIF1α/OATPs信號失活, 轉運和集聚七甲川菁染料的能力減弱。當使用HIF1α穩定劑(DMOG和氯化鈷)時,可以促進腫瘤細胞內OATP1B3的轉錄, 增強腫瘤細胞對七甲川菁染料的吸收; 與此相反, 當抑制腫瘤細胞內HIF1α水平時, OATP1B3和OATP2B1表達降低, 對七甲川菁染料的吸收減弱[14,27]。盡管上述結論是從前列腺癌細胞和腫瘤移植模型中獲得,但由于組織缺氧和HIF1α/OATPs信號的活化是大部分腫瘤細胞中普遍存在的現象, 可進一步測試七甲川菁染料結合其它腫瘤細胞的能力, 將NIRF活體成像技術用于不同類型腫瘤模型的檢測。

5 結論和展望

七甲川菁染料兼具腫瘤成像和靶分子的雙重功能，基于該類染料的NIRF活體成像技術已成功應用于腫瘤模型的檢測，但應用于臨床前仍面臨諸多問題。如: 現有的七甲川菁染料通透性和敏感性需要進一步提升; 還需要通過化學修飾來進一步增強它的靶向性; 還需要調整染料的脂溶性和水溶性，使其能更有效地穿透細胞膜識別胞內分子; 需要進一步降低染料與血液蛋白的非共價結合，以降低背景的干擾。未來的化學修飾將進一步提升七甲川菁類化合物在腫瘤細胞中靶向性，降低背景熒光信號。同時，隨著多模態影像技術的應用，基于七甲川菁類化合物的多模態探針將會從分子、解剖結構和功能等方面呈現腫瘤模型的變化，并加速推動其臨床應用。