一種新的犬膽管及十二指腸管插管模型的制作及可行性分析

邱智寅 艾曉杰 陳 瓊 （上海交通大學(xué)農(nóng)業(yè)與生物學(xué)院/上海市獸醫(yī)生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海市閔行區(qū) 0040；科文斯醫(yī)藥研發(fā) (上海) 有限公司,上海市浦東新區(qū) 08；上海醫(yī)藥工業(yè)研究院，上海市浦東新區(qū) 00)

藥物代謝是指藥物進(jìn)入機(jī)體內(nèi)吸收入血，并分布到各組織器官，經(jīng)肝、腎等代謝后，通過膽汁、糞、尿等途徑排泄（消除）的過程[1]；同時(shí)，藥物除了通過膽汁、糞、尿等途徑排泄外，還可通過呼吸道、唾液、乳汁、汗液等途徑排泄[2-7]。在臨床前和臨床早期階段，研究藥物在體內(nèi)的排泄過程，鑒定其代謝產(chǎn)物，比較推斷其吸收和分布，能客觀地了解候選藥物對(duì)機(jī)體的作用，有助于篩選出活性高、安全性好的新藥[8]。筆者以比格犬為試驗(yàn)對(duì)象，在參考借鑒現(xiàn)有藥理學(xué)和藥效研究中比格犬膽管插管和代謝模型的基礎(chǔ)上，研究制作了一種新的比格犬單向和雙向插管模型——犬膽管及十二指腸管插管模型，旨在提供一種新的模型用于藥物代謝研究和新藥篩選。現(xiàn)對(duì)該新模型的制作方法及可行性進(jìn)行總結(jié)分析，以供參考借鑒。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 動(dòng)物材料

選用5只6～7月齡、體重為7.5～7.9 kg的雄性健康比格犬[購(gòu)自北京瑪斯生物技術(shù)有限公司，許可證號(hào)SCXK（京）2016-0001]，編號(hào)1～5。試驗(yàn)前比格犬穿馬甲、佩戴伊麗莎白項(xiàng)圈適應(yīng)1周以上，手術(shù)按照Institutional Animal Care and Use Committee（IACUC）規(guī)范操作，由技術(shù)員和獸醫(yī)共同照料、護(hù)理。

1.1.2 其他材料

器械：腹壁牽開器、手術(shù)刀、敷料鉗、止血鉗、有齒鑷、組織鑷、巾鉗、持針鉗、手術(shù)剪、眼科鑷、顯微剪、顯微鑷、創(chuàng)巾、紗布，部分器械需高壓滅菌消毒45 min（蒸汽壓力108 kPa，溫度121 ℃）。

設(shè)備及耗材：手術(shù)室、手術(shù)臺(tái)、無影燈、保溫墊、心電監(jiān)測(cè)儀、注射泵、剃毛刀、無菌手套、腸溶縫線、縫針、不可吸收縫線、BICCS T導(dǎo)管等，部分設(shè)備及耗材需用0.2%過氧乙酸溶液滅菌消毒，并用紫外消毒燈照射30 min以上。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 術(shù)前準(zhǔn)備

術(shù)前比格犬要求禁食16 h以上，并提前將手術(shù)臺(tái)溫度設(shè)置在37 ℃。先對(duì)比格犬肌肉注射阿托品0.03 mg/kg，皮下注射拜有利8 mg/kg及通立定4 mg/kg鎮(zhèn)靜鎮(zhèn)痛；然后肌肉注射舒泰50 2.5 mg/kg麻醉，犬仰臥綁定，并拉出舌頭，于雙前肢頭靜脈植入留置針，靜脈注射丙泊酚2 mL/（kg·h）維持麻醉，靜脈注射乳酸林格氏液(LRS)10 mL/(kg·h)維持體液，涂眼藥膏防止眼部干澀；然后對(duì)術(shù)部進(jìn)行剃毛，用碘酊常規(guī)消毒，用75%酒精脫碘，然后鋪上創(chuàng)巾；最后用心電監(jiān)護(hù)儀動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)犬的生理指征。

1.2.2 手術(shù)過程

沿劍突下1 cm腹部中線縱向切開腹壁18～30 cm；于肝門處找到左側(cè)的肝總管和右側(cè)的膽囊管，選擇在肝管與膽管的匯入膽總管的Y型段下方插管，見圖1；以腸鉗固定十二指腸，將紗布?jí)|于肝臟及十二指腸間；在Y型下4～5 cm處插管，用止血鉗鈍性分離總膽管及周邊組織，將T型導(dǎo)管的膽囊端留5～7 cm，末端剪成斜面；在T型導(dǎo)管膽管遠(yuǎn)端和近端段放置2個(gè)縫線預(yù)節(jié)，見圖1中的位置1和2；用顯微剪在膽管端剪開1個(gè)小口，以眼科鑷將T型導(dǎo)管斜口緩緩插入膽管，至總膽管Y型口前，以縫線用方結(jié)來固定導(dǎo)管的1號(hào)和2號(hào)位置；膽汁流進(jìn)T型管后可用止血鉗使膽汁停止流入；在膽管通往腸端用不可吸收的縫線預(yù)打2個(gè)節(jié)，見圖1中的位置3和4；同樣，插入T型管的腸端，并用方結(jié)固定，確保導(dǎo)管末端位于十二指腸遠(yuǎn)端，且不折疊打結(jié)；用生理鹽水測(cè)試十二指腸導(dǎo)管是否通暢，然后將T型導(dǎo)管和大網(wǎng)膜進(jìn)行縫合固定，用縫線將十二指腸縫合到腹壁固定，將T型導(dǎo)管穿出肌肉層，連續(xù)縫合腹壁肌肉層；用手術(shù)刀柄鈍性分離左胸壁與肌肉層至第7肋處，開口（約3 cm），用來安裝導(dǎo)管裝置，見圖2；在開口處縫合導(dǎo)管，并連接導(dǎo)管及腸管至導(dǎo)管裝置，以生理鹽水測(cè)試導(dǎo)管是否通暢，然后在肌肉層縫合固定T型導(dǎo)管，最后縫合切口。

術(shù)后停止注射丙泊酚，并將犬移至加熱墊上保溫，監(jiān)測(cè)其體征。術(shù)犬蘇醒(約10 min) 后，停止注射乳酸林格氏液并帶上伊麗莎白項(xiàng)圈，穿上馬甲，隨即放回籠舍。

1.2.3 術(shù)后護(hù)理

術(shù)后對(duì)犬進(jìn)行消炎及鎮(zhèn)痛藥物治療，連續(xù)7 d口服甲硝唑片10 mg/kg、拜有利片5 mg/kg，若縫合部位有炎癥或化膿，可適當(dāng)延長(zhǎng)給藥時(shí)間。每天以碘酊清洗縫合部位及導(dǎo)管外出口，涂抗菌藥膏 (百多邦)，保持皮膚傷口清潔干燥。當(dāng)縫合部愈合后移除頸部項(xiàng)圈并拆線。

1.2.4 膽汁采集及膽鹽回補(bǔ)

采集膽汁時(shí)，更換圖2的左胸皮膚導(dǎo)管裝置，膽汁即可被引出體外，并可進(jìn)行膽鹽補(bǔ)充，采樣時(shí)，犬可在籠內(nèi)活動(dòng)。膽汁丟失會(huì)影響犬的正常消化及吸收，因此需要補(bǔ)充膽鹽，可喂食含有牛磺膽酸鈉的0.05%生理鹽水溶液，以0.6 mL/(kg·h)流速導(dǎo)入腸腔內(nèi)。

圖1 T導(dǎo)管及放置位置

圖2 BICCS T導(dǎo)管裝置

1.3 模型評(píng)價(jià)

可從以下幾方面對(duì)犬膽汁排泄試驗(yàn)?zāi)Ｐ瓦M(jìn)行評(píng)價(jià)：(1)膽管及腸管測(cè)試。一般術(shù)后每2～3 d查看1次連接導(dǎo)管套索裝置是否有膽汁流出，腸管可先用注入和回抽乳酸林格氏液來檢測(cè)，如果導(dǎo)管脫落及損壞，須手術(shù)調(diào)整復(fù)位。(2)術(shù)后創(chuàng)口觀察。觀察傷口是否有紅腫、化膿等，一旦發(fā)現(xiàn)可根據(jù)實(shí)際情況更換抗生素進(jìn)行治療。(3)整體觀察和指標(biāo)測(cè)定相結(jié)合。整體觀察包括觀察術(shù)犬的一般體征，是否有異常表現(xiàn)、疼痛或不適現(xiàn)象，指標(biāo)測(cè)定則是測(cè)定術(shù)犬的體重、采食量、血液生化指標(biāo)、膽汁量等。（4）兩周后是否可將狀態(tài)正常的術(shù)犬用于藥物的膽汁排泄試驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 一般狀況

據(jù)手術(shù)后觀察，在術(shù)后3 d內(nèi)術(shù)犬均出現(xiàn)了不同程度的活動(dòng)減少現(xiàn)象，隨后術(shù)犬活動(dòng)開始恢復(fù)正常；術(shù)后2 d傷口結(jié)痂，術(shù)部皮膚紅腫，術(shù)后4 d術(shù)部皮膚消腫，術(shù)后1周術(shù)部皮膚愈合良好，拆線；術(shù)后1周內(nèi)每隔2 d進(jìn)行1次膽管及腸管測(cè)試，均保持通暢。另外，手術(shù)后5只犬的整體狀況和采食情況均為正常。

2.2 體重變化

術(shù)犬體重在術(shù)后3 d內(nèi)均有不同程度的降低，5只犬中，有2只犬的體重下降0.3 kg，降幅分別為4.1%、3.7%，有3只犬的體重下降0.2 kg，降幅分別為2.6%、3.0%、2.6%。術(shù)后7 d，有1只犬的體重增長(zhǎng)0.1 kg，有2只犬的體重恢復(fù)至術(shù)前，有2只犬的體重仍未恢復(fù)至術(shù)前。術(shù)后14 d，有3只犬的體重超過術(shù)前，有1只犬的體重與術(shù)前持平，仍有1只犬的體重較術(shù)前下降0.1 kg。經(jīng)分析，該術(shù)犬的體重下降可能與手術(shù)相關(guān)。

2.3 采食變化

術(shù)犬在手術(shù)當(dāng)天因禁食及手術(shù)麻醉，所以未進(jìn)行采食數(shù)據(jù)采集。術(shù)后2 d，術(shù)犬的平均采食量由225 g/d下降到130 g/d，降幅為57.7%；術(shù)后3 d、4 d、5 d，術(shù)犬的采食量逐漸增加，平均采食量分別達(dá)到術(shù)前的65.3%、75.1%、84.4%，術(shù)后6 d采食量恢復(fù)至術(shù)前水平，術(shù)后7～14 d術(shù)犬的平均采食量均比術(shù)前高。經(jīng)分析，術(shù)后犬的采食量降低與術(shù)犬活動(dòng)減少、疼痛等有關(guān)。由圖3可知，術(shù)犬隨著身體逐漸恢復(fù)，采食也恢復(fù)正常。

注：-1 d表示術(shù)前1 d，2 d表示術(shù)后2 d，以此類推

2.4 血液生化指標(biāo)

由表1可知，術(shù)后犬的血液生化指標(biāo)有較明顯的變化。其中，丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）從術(shù)前1 d的32 U/L上升至術(shù)后7 d的55 U/L，上升幅度為71.88%；天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）從術(shù)前1 d的34 U/L上升至術(shù)后7 d的57 U/L，上升幅度為67.65%；術(shù)后7 d AST/ALT的比值＞1，說明手術(shù)對(duì)比格犬的肝臟有損害；術(shù)后14 d，AST及ALT的數(shù)值均低于術(shù)前，表明動(dòng)物恢復(fù)正常；肌酸激酶（CK）從術(shù)前1 d的134 U/L上升至術(shù)后7 d的359 U/L，上升幅度為167.91%，術(shù)后14 d又降低至123 U/L；總膽紅素（TBIL）從術(shù)前1 d的＜0.1 mg/dL上升至術(shù)后7 d的0.4 mg/dL，術(shù)后14 d又降低至術(shù)前水平；經(jīng)分析，CK及TBIL的數(shù)值升高是由插管、手術(shù)、抗生素使用導(dǎo)致的。

表1 手術(shù)前后比格犬血液生化指標(biāo)比較

2.5 膽汁排泄量

從術(shù)后8 d開始每天收集膽汁1次，連續(xù)收集7 d。導(dǎo)出的膽汁為棕黃色、質(zhì)粘稠，經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析，每天膽汁排出量間差異不顯著。見表2。

表2 術(shù)后比格犬膽汁排出量統(tǒng)計(jì)

2.6 評(píng) 價(jià)

根據(jù)試驗(yàn)觀察和檢測(cè)分析，術(shù)后14 d術(shù)犬的生理狀況、體重、采食量、血液生化指標(biāo)及膽汁量等各項(xiàng)指標(biāo)均恢復(fù)至正常水平，可用于藥物的膽汁排泄試驗(yàn)。

3 結(jié)論與討論

本試驗(yàn)探索并建立了新的比格犬單向和雙向插管模型——犬膽管及十二指腸管插管模型，術(shù)后術(shù)犬出現(xiàn)了術(shù)部紅腫、側(cè)臥、流涎、反應(yīng)遲緩、活動(dòng)減少等現(xiàn)象，且血液生化指標(biāo)（丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、肌酸激酶和總膽紅素）較術(shù)前有所升高，經(jīng)分析，這是由于麻醉、手術(shù)受創(chuàng)、術(shù)后疼痛及抗生素使用等引起的；但該造模手術(shù)時(shí)間短、創(chuàng)傷小，術(shù)后動(dòng)物活動(dòng)不受限制，且能保持正常的生理機(jī)能和代謝水平，各項(xiàng)生化指標(biāo)也逐日恢復(fù)，術(shù)后14 d術(shù)犬的各項(xiàng)指標(biāo)即可恢復(fù)至術(shù)前正常水平。因此，該模型可在臨床前藥代動(dòng)力學(xué)研究中進(jìn)行應(yīng)用，且其符合動(dòng)物福利及倫理的要求，也符合未來國(guó)內(nèi)臨床前藥動(dòng)學(xué)研究動(dòng)物試驗(yàn)的發(fā)展趨勢(shì)和潮流。