骨髓激酶X對(duì)宮頸癌細(xì)胞增殖的影響及可能的作用機(jī)制

李曉蘭 趙駿達(dá) 馬俊旗

作者單位：830054 烏魯木齊 新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院婦科中心

宮頸癌是全球女性癌癥死亡的第四大原因［1］。有研究報(bào)道，一些癌基因和轉(zhuǎn)錄因子可能參與宮頸癌的發(fā)生和發(fā)展［2-3］。骨髓激酶X（bone marrow X-linked kinase，BMX）是Tec家族細(xì)胞內(nèi)非受體酪氨酸激酶成員［4-7］。BMX可介導(dǎo)前列腺癌和膀胱癌等細(xì)胞增殖、存活、遷移、侵襲和凋亡［8-9］。PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路對(duì)腫瘤發(fā)生、細(xì)胞周期進(jìn)展、細(xì)胞遷移、增殖和存活有重要作用［10］。研究［10-12］表明，PI3K/Akt/mTOR通路在結(jié)直腸癌、卵巢癌及乳腺癌等腫瘤中異常激活。本研究探討B(tài)MX在人宮頸癌增殖的影響及其可能的作用機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 主要試劑和儀器

人宮頸癌細(xì)胞系HeLa（HeLa-野生型細(xì)胞）購(gòu)自美國(guó)ATCC公司，10%胎牛血清購(gòu)自浙江天杭生物科技股份有限公司，DMEM培養(yǎng)基、MTT購(gòu)自美國(guó)Sigma Aldrich 公司，BMX、Akt、p-Akt、mTOR、p-mTOR、β-actin及二級(jí)抗體均購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司，辣根過(guò)氧化物酶購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher Scientifc公司，Trizol、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自日本Takara公司，Lipofectamine 2000試劑購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司，BMX-IN-1、LFM-A13購(gòu)自美國(guó)MCE公司，MK-2206和雷帕霉素購(gòu)自美國(guó)Selleck公司，APC-BrdU細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒購(gòu)自江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司，Olympus-Cx31顯微鏡購(gòu)自日本Olympus公司，F(xiàn)ACS Calibur流式細(xì)胞儀購(gòu)自美國(guó)BD Biosciences公司。

1.2 細(xì)胞系和組織樣本

將HeLa細(xì)胞接種在含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，并置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。收集2013—2017年本院34例正常子宮頸組織、25例原位宮頸癌組織和52例浸潤(rùn)性宮頸癌組織標(biāo)本。所有患者均未接受化療、免疫治療或放射治療。本研究經(jīng)本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有患者在采集標(biāo)本前均簽署知情同意書。

1.3 免疫組織化學(xué)法檢測(cè)BMX的表達(dá)

選取正常宮頸、原位宮頸癌及浸潤(rùn)性宮頸癌組織并用10%中性福爾馬林固定，常規(guī)脫水，石蠟包埋，制片。免疫組化染色采用En Vision兩步法，所用抗體包括BMX抗體及二級(jí)抗體，具體操作步驟參照試劑盒說(shuō)明及全自動(dòng)免疫組化標(biāo)準(zhǔn)操作流程。BMX染色結(jié)果采用IRS表示，IRS為每個(gè)樣本中的染色強(qiáng)度值（0分：無(wú)染色；1分：弱染色；2分：中度染色；3分：強(qiáng)染色）和陽(yáng)性細(xì)胞百分比值（0分：＜10%；1分：10%～25%；2分：26～50%；3分：51～75%；4 分：76～100%）的乘積，IRS＞3為陽(yáng)性，IRS≤3為陰性。

1.4 載體構(gòu)建和細(xì)胞轉(zhuǎn)染

采用TALEN敲除技術(shù)成功構(gòu)建BMX-TALEN重組質(zhì)粒載體。按照LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑說(shuō)明書轉(zhuǎn)染BMX-TALEN重組質(zhì)粒，BMX-TALEN重組質(zhì)粒與LipofectamineTM 2000的配制比例為1∶3，將其加入9孔板中構(gòu)建低表達(dá)BMX的HeLa-BMX+/-細(xì)胞。以含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)的野生型HeLa細(xì)胞為對(duì)照。轉(zhuǎn)染48 h后，采用Western blot檢測(cè)BMX蛋白的表達(dá)水平以鑒定轉(zhuǎn)染效率。

1.5 Western blot檢測(cè)蛋白表達(dá)水平

將隨機(jī)選擇的7例原位宮頸癌組織與7例正常宮頸組織，HeLa-野生型細(xì)胞和轉(zhuǎn)染后的HeLa-BMX+/-細(xì)胞，DMSO、Akt抑制劑(MK-2206)和 mTOR抑制劑雷帕霉素分別處理的HeLa-野生型和BMX+/-細(xì)胞，分別放入含有新加入的蛋白酶抑制劑混合物的裂解緩沖液中，冰上裂解30～45 min。BCA法測(cè)定蛋白濃度，將蛋白質(zhì)加入5×上樣緩沖液中，95℃ 煮沸10 min。通過(guò)SDS-PAGE分離等量的蛋白質(zhì)，印跡至活化的聚偏二氟乙烯膜。室溫封閉1 h，分別加入BMX抗體（稀釋比例為 1∶2 000）、Akt抗體（稀釋比例為1∶500）、p-Akt抗體（稀釋比例為 1∶1 000）、mTOR 抗體（稀釋比例為 1∶1 000）、p-mTOR 抗體（稀釋比例為1∶1 000）及 β-actin 抗體（稀釋比例為 1∶1 000），4 ℃溫育過(guò)夜。將印跡與偶聯(lián)于辣根過(guò)氧化物酶的第二抗體室溫孵育1 h，在X光片上采用ECL法顯影，用成像分析系統(tǒng)分析目的蛋白及內(nèi)參β-actin灰度值的比值，作為目的蛋白的相對(duì)表達(dá)水平。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.6 MTT檢測(cè)細(xì)胞的生長(zhǎng)速度及細(xì)胞活力

采用DMEM培養(yǎng)基調(diào)整各組細(xì)胞懸液濃度為2×103·mL-1，接種于 96 孔板，每孔體積 200 μL，每組3個(gè)復(fù)孔。分別于第1天、第3天、第5天和第7天用血細(xì)胞計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)，繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。

1.7 流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞周期變化

將BMX-IN-1處理后的HeLa細(xì)胞、DMSO處理后的HeLa細(xì)胞、HeLa-野生型細(xì)胞及轉(zhuǎn)染后HeLa-BMX+/-細(xì)胞接種在60 mm培養(yǎng)皿中24～48 h，并用30 μm BrdU標(biāo)記30～60 min。待生長(zhǎng)至50%～70%融合時(shí)收取細(xì)胞，置于4℃下的70%冷乙醇固定過(guò)夜。PBS洗滌2次，采用APC-BrdU細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒對(duì)細(xì)胞進(jìn)行抗APC-BrdU染色后，用FACS Calibur流式細(xì)胞儀分析，F(xiàn)lowjo 7.6軟件分析細(xì)胞周期的分布。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 19.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（χ±s）表示，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析；計(jì)數(shù)資料采用百分比表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 BMX在正常宮頸及宮頸癌組織中的表達(dá)

免疫組織化學(xué)法檢測(cè)結(jié)果顯示，正常宮頸組織BMX陽(yáng)性表達(dá)率為26.5%（9/34），原位宮頸癌組織BMX陽(yáng)性表達(dá)率為68.0%（17/25），浸潤(rùn)性宮頸癌組織BMX陽(yáng)性率為88.5%（46/52），組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=34.804，P＜0.001），兩兩比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)（P＜0.05），見圖 1。Western blot結(jié)果顯示，7例原位宮頸癌組織中BMX的表達(dá)明顯高于7例正常宮頸組織（P＜0.05），見圖 2。

2.2 轉(zhuǎn)染結(jié)果

Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，HeLa-野生型細(xì)胞中BMX蛋白的表達(dá)高于HeLa-BMX+/-細(xì)胞（t=9.527，P＜0.001），說(shuō)明本研究成功構(gòu)建低表達(dá) BMX的HeLa-BMX+/-細(xì)胞，見圖 3。

圖1 BMX在不同宮頸組織中的表達(dá)（×100）Fig.1 Expression of BMX in different cervical tissues（×100）

圖2 Western blot法檢測(cè)宮頸癌和正常宮頸組織中BMX的表達(dá)Fig.2 Western blot analysis of BMX expression in cervical cancer

圖3 Western blot檢測(cè)BMX蛋白的表達(dá)Fig.3 The expression of BMX detected by Western blot

2.3 BMX對(duì)宮頸癌細(xì)胞生長(zhǎng)速度及細(xì)胞周期的影響

MTT法檢測(cè)結(jié)果顯示，HeLa-BMX+/-細(xì)胞的生長(zhǎng)速度較HeLa-野生型細(xì)胞慢，見圖4。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示，與HeLa-DMSO細(xì)胞比較，HeLa-BMX-IN-1細(xì)胞中 G0/G1 期細(xì)胞比例較高［（50.4±5.7）%vs（42.5±4.3）%，t=7.234，P＜0.001］，而 G2/M 期細(xì)胞比例較低［（22.9±2.9）%vs（29.1±3.1）%，t=5.491，P＜0.001］；與HeLa-野生型細(xì)胞比較，HeLa-BMX+/-細(xì)胞中G0/G1期細(xì)胞比例亦較高［（52.1±6.5）%vs45.9±5.7）%，t=5.715，P＜0.001］，而 G2/M 期細(xì)胞比例較低［（19.5±1.4）%vs（25.4±3.6）%，t=5.873，P＜0.05］，見圖5。

圖4 HeLa-BMX+/-細(xì)胞和HeLa-野生型細(xì)胞的細(xì)胞生長(zhǎng)曲線Fig.4 The growths curve of HeLa-BMX+/-cells and HeLa-wild type cells

圖5 BMX對(duì)宮頸癌細(xì)胞周期的影響Fig.5 The effect of BMX on cell cycle of cervical cancer cells

2.4 BMX通過(guò)激活PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞活力

Western blot結(jié)果顯示，BMX和p-Akt在HeLa-BMX+/-細(xì)胞中的表達(dá)低于HeLa-野生型細(xì)胞，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=6.282，8.117，均P＜0.001）；兩種細(xì)胞的總Akt表達(dá)水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=2.035，P=0.126），見圖6A。DMSO處理后HeLa-BMX+/-細(xì)胞中p-Akt和p-mTOR的表達(dá)低于HeLa-野生型細(xì)胞；與DMSO處理組比較，MK-2206處理和雷帕霉素處理后HeLa-野生型和BMX+/-細(xì)胞中p-Akt和p-mTOR的表達(dá)均受抑制，見圖6B。MTT檢測(cè)結(jié)果顯示，DMSO處理后，HeLa-BMX+/-細(xì)胞生長(zhǎng)速度較HeLa-野生型細(xì)胞慢；MK-2206和雷帕霉素處理后，HeLa-野生型和HeLa-BMX+/-細(xì)胞生長(zhǎng)均較DMSO處理的細(xì)胞慢，見圖6C。

圖6BMX對(duì)PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路的影響Fig.6 Effect of BMX on the PI3K/Akt/mTOR signaling pathway

3 討論

TEC激酶家族是第二大非受體蛋白酪氨酸激酶家族，BMX是該家族的成員之一。研究報(bào)道BMX可能參與造血細(xì)胞、心內(nèi)膜、動(dòng)脈內(nèi)皮以及其他細(xì)胞的免疫反應(yīng)、炎癥和細(xì)胞因子信號(hào)傳導(dǎo)［13］。此外，BMX在腎癌、膀胱癌等腫瘤中表達(dá)，參與細(xì)胞生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)化、遷移、存活、凋亡［8-9］。本研究用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)正常宮頸、原位宮頸癌和浸潤(rùn)性宮頸癌組織樣本中BMX的表達(dá)。結(jié)果顯示，BMX在宮頸癌組織中的表達(dá)高于正常子宮頸組織，隨機(jī)選擇正常子宮頸組織和宮頸癌組織各7例，然后采用Western blot法檢測(cè)BMX的表達(dá)，亦發(fā)現(xiàn)BMX在宮頸癌組織中高表達(dá)，提示BMX可能參與宮頸癌的發(fā)生發(fā)展。為此，本研究構(gòu)建重組BMX-TALEN質(zhì)粒并轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞，成功構(gòu)建低表達(dá)BMX的HeLa-BMX+/-細(xì)胞，然后采用Western blot檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)HeLa-野生型細(xì)胞中BMX的表達(dá)明顯高于HeLa-BMX+/-細(xì)胞，而 HeLa-BMX+/-細(xì)胞生長(zhǎng)較HeLa-野生型細(xì)胞慢，且BMX-IN-1處理的HeLa細(xì)胞G0/G1期細(xì)胞比例明顯增加，而G2/M期細(xì)胞比例明顯降低，說(shuō)明敲低BMX表達(dá)后，細(xì)胞被阻滯在G0/G1期，從而抑制了腫瘤細(xì)胞增殖，減弱細(xì)胞增殖和活力。

目前，研究已證實(shí)的宮頸癌發(fā)展機(jī)制主要與PI3K/Akt/mTOR、絲裂原活化蛋白激酶（MAPKs）細(xì)胞外信號(hào)相關(guān)激酶（ERK1/2）、Janus激酶 2（JAK2）/信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子-3（STAT3）、JAK3/STAT5、NF-κB、Wnt/β-catenin 和 c-Jun N-末端激酶（JNK）/p-38 等信號(hào)通路有關(guān)［14-15］。尤其PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路與腫瘤細(xì)胞增殖和存活密切相關(guān)［10］，其活性異常可導(dǎo)致細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞遷移、黏附、腫瘤血管生成和細(xì)胞外基質(zhì)降解［16］。GUO等［9］研究發(fā)現(xiàn)膀胱癌細(xì)胞中BMX過(guò)度表達(dá)可提高Akt的活性，而敲除BMX則抑制Akt的活性。本研究Western blot結(jié)果顯示，HeLa-BMX+/-細(xì)胞中BMX和p-Akt表達(dá)較HeLa-野生型細(xì)胞降低，兩種細(xì)胞的Akt表達(dá)水平相當(dāng)，說(shuō)明敲除BMX可以降低HeLa-BMX+/-細(xì)胞中p-Akt/Akt的表達(dá)，BMX能增強(qiáng)p-Akt/Akt的活性。進(jìn)一步采用MK-2206和雷帕霉素作用HeLa-野生型和HeLa-BMX+/-細(xì)胞后，發(fā)現(xiàn)p-AKT和p-mTOR表達(dá)受抑制，且細(xì)胞生長(zhǎng)變緩，提示BMX可能激活A(yù)kt的磷酸化，而mTOR作為一個(gè)典型的下游因子亦受到影響，BMX可能通過(guò)PI3K/Akt/mTOR途徑促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞增殖和腫瘤形成，但BMX如何調(diào)節(jié)這一通路仍有待進(jìn)一步研究。