維生素D調控Wnt/β-catenin信號通路抑制乳腺癌干細胞活性

沙昱彤 黃家明 盧珍萍 梁歡 征宗梅 楊學攀 施洪飛 朱明明

作者單位：210023 南京 南京中醫藥大學第二臨床醫學院營養教研室

乳腺癌是常見的惡性腫瘤之一，我國乳腺癌死亡率位居全部惡性腫瘤第四位，嚴重威脅女性健康［1］。腫瘤干細胞是具有自我更新、快速增殖、多向分化和多藥耐藥等特性的腫瘤細胞亞群，是腫瘤形成及不斷生長的根源［2］。因此，靶向腫瘤干細胞被認為是腫瘤預防和治療的理想策略。維生素D為脂溶性維生素，是固醇類衍生物。近年研究發現，維生素D可抑制人乳腺癌細胞MCF-7遷移和侵襲［3］，且可減少MCF-7細胞的腫瘤干細胞數量［4］。然而，目前關于維生素D對乳腺癌干細胞的作用及其作用機制鮮有報道。本研究以乳腺癌SUM159細胞為研究對象，初步探討維生素D對乳腺癌干細胞活性的干預作用及其可能的作用機制，以期為闡明維生素D抗腫瘤活性提供新的依據。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑

乳腺癌細胞株SUM159購自中國科學院上海細胞庫。維生素D購自中國阿拉丁公司；胰蛋白酶、不完全RP-MI1640培養基（含雙抗）購自南京凱基生物科技發展有限公司；胎牛血清購自美國Gibco公司；四甲基偶氮唑鹽（MTT）購自中國索萊寶公司；逆轉錄試劑盒和qPCR試劑盒購自南京諾唯贊公司；蛋白提取試劑盒購自南京凱基生物科技發展有限公司；BCA蛋白測定試劑盒購自碧云天；CD133和CD44抗體購自北京博奧森生物技術有限公司；Oct-4、Nanog、p-GSK-3β、β-catenin和c-Myc抗體購自美國Cell Signaling Technology公司；GAPDH抗體購自中國proteintech公司；二甲基亞砜（DMSO）購自中國索萊寶公司。

1.2 乳腺癌SUM159細胞的培養

將乳腺癌SUM159細胞置于含10%胎牛血清、0.08 U/L青霉素、0.08 g/L鏈霉素的不完全RP-MI1640培養基，于37℃、5%CO2恒溫培養箱中培養，每2 d換液1次；待細胞長滿至80%左右，用0.25%胰蛋白酶溶液進行消化、傳代。取對數生長期細胞進行后續實驗。

1.3 MTT法檢測乳腺癌SUM159細胞的活力

取對數生長期乳腺癌SUM159細胞，制成細胞懸液，接種于96孔板，每孔1 500個細胞，置于37℃、5%CO2恒溫培養箱中培養。24h后，分別加入1 μmol/L、5 μmol/L、10 μmol/L 和 20 μmol/L 的維生素 D，同時設置0.1%DMSO對照組，每組設置6個復孔。培養48 h，避光加入5 g/L MTT溶液20 μL，繼續孵育4 h。棄上清液，加入 DMSO 200 μL，孵育震蕩 10 min，待結晶溶解后，用酶標儀測定490 nm波長處各孔的吸光度（OD）值，分別計算各組細胞存活率。細胞存活率=（處理組OD值/對照組OD平均值）×100%。根據MTT結果篩選最佳藥物濃度梯度進行后續實驗。

1.4 無血清乳腺癌細胞干細胞CSCSUM159的懸浮培養

將SUM159細胞接種于無血清培養基（serum-free medium，SFM）中，于 37℃、5%CO2恒溫培養箱中連續懸浮培養5 d，富集乳腺癌干細胞CSCSUM159。于接種細胞1 d和5 d觀察腫瘤干細胞球的形成情況，并在顯微鏡下獲取圖像。SFM成分：含雙抗無血清培養基RP-MI1640、1%B27、5 μg/mL 胰島素、4 g/L BSA、10 ng/mL人堿性成纖維細胞生長因子和20 ng/mL表皮生長因子。

將SUM159細胞接種到無血清培養基，分別加入1 μmol/L、5 μmol/L 和 10 μmol/L 維生素 D，同時以0.1%DMSO培養SUM159細胞作為對照，于37℃、5%CO2恒溫培養箱中連續懸浮培養5 d。顯微鏡下觀察CSCSUM159細胞數量及成球大小變化，并于第5天收集細胞，分析維生素D對乳腺癌干細胞的干預作用。

1.5 Western blot法檢測蛋白表達水平

收集各組細胞，加入IP裂解液，裂解40 min，收集上清液作為細胞總蛋白，并根據BCA法進行蛋白定量。取40～60 μg蛋白質樣品進行聚丙烯酰胺凝膠電泳、轉膜、封閉，加入一抗（孵育的一抗分別為CD133、CD44、Oct-4、Nanog、p-GSK-3β、β-catenin、c-Myc和GAPDH，稀釋比例為1∶1 000），4℃冰箱過夜。用1×TBST洗滌液洗滌3次，每次5 min。加入二抗（稀釋比例為1∶5 000），室溫孵育1 h。用1×TBST洗滌液洗滌6次，每次5 min。采用ECL化學發光液顯影。以GAPDH作為內參。

1.6 Real-time qPCR法檢測mRNA表達水平

常規收集各組細胞，按照TRIzol法提取總RNA，測定RNA濃度，并逆轉錄合成cDNA，按Real-time qPCR試劑盒說明書配置反應體系。Real-time qPCR反應條件：預變性95 ℃ 30 s，1個循環；95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，40個循環；95 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s，95 ℃ 15 s。引物序列見表1。采用2-△△Ct計算目的基因的相對表達量。△△Ct值=（處理組靶基因Ct值-處理組GAPDH Ct值）-（對照組靶基因Ct值-對照組GAPDH Ct值）。實驗重復3次。

表1 Real-time qPCR引物序列Tab.1 Sequence of Real-time qPCR primers

1.7 統計學方法

采用GraphPad Prism 5.0和SPSS 21.0進行數據分析。計量數據采用均數±標準差（χ±s）表示，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，若組間差異有統計學意義，則采用Dunnett-t檢驗進行多重比較。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 維生素D對乳腺癌SUM159細胞活力的影響

MTT結果顯示，對照組、1 μmol/L維生素D組、5 μmol/L維生素D組、10μmol/L維生素D組和20μmol/L維生素D組的細胞存活率分別為100.00%、83.70%、76.71%、65.03%和37.89%，組間比較差異有統計學意義（F=79.01，P＜0.01）。與對照組比較，1 μmol/L、5 μmol/L、10 μmol/L 和 20 μmol/L 維生素 D 組細胞的存活率均顯著降低（P＜0.01），見圖1。顯微鏡下觀察發現，隨著維生素D濃度增加，SUM159細胞數逐漸減少，見圖2。以上結果表明，不同濃度維生素D均可抑制乳腺癌SUM159細胞的活力，因此本研究選擇1 μmol/L、5 μmol/L 和 10 μmol/L 維生素 D 進行后續實驗。

圖1 維生素D對乳腺癌SUM159細胞存活率的影響Fig.1 Effect of Vitamin D on the viability of SUM159 cells

圖2 顯微鏡下觀察不同濃度維生素D作用乳腺癌SUM159細胞的情況（×100）Fig.2 Effect of Vitamin D on the viability of SUM159 cells by microscope（×100）

2.2 無血清懸浮培養富集乳腺癌干細胞CSCSUM159

顯微鏡下觀察可見SUM159細胞在SFM中懸浮培養5 d可形成懸浮腫瘤細胞球，且隨著培養天數增加，腫瘤細胞球體積增大、數目增多，見圖3。Western blot檢測結果顯示，與乳腺癌SUM159細胞比較，懸浮細胞球腫瘤干細胞特性標志物CD133、CD44、Oct-4以及Nanog蛋白表達上調，蛋白條帶顏色加深、條帶變寬，見圖4。Real-time qPCR檢測結果顯示，與乳腺癌SUM159細胞比較，乳腺癌干細胞CSCSUM159中CD133、CD44、Oct-4和Nanog的mRNA表達水平分別為 3.32±0.93、14.46±3.15、7.48±0.64、19.71±1.01，差異均有統計學意義（t=6.20，7.94，20.13，30.88；P=0.025，0.015，0.002，0.001），見圖 5。上述結果表明無血清懸浮培養可有效富集乳腺癌干細胞。

圖3 顯微鏡觀察乳腺癌中腫瘤干細胞球的生長情況（×100）Fig.3 The growth of breast cancer stem cell spheres observed by microscope（×100）

圖4 SUM159和CSCSUM159細胞中腫瘤干細胞標志物的蛋白表達水平Fig.4 The protein expression levels of breast cancer stem cells markers in SUM159 and CSCSUM159 cells

圖5SUM159和CSCSUM159細胞中腫瘤干細胞標志物的mRNA表達水平Fig.5 The mRNA expression levels of breast cancer stem cells markers of SUM159 and CSCSUM159 cells

2.3 維生素D對乳腺癌干細胞CSCSUM159活力的影響

顯微鏡下觀察可見，與對照組相比，1 μmol/L、5 μmol/L和10 μmol/L維生素D作用均使乳腺癌干細胞CSCSUM159的成球數量減少，且成球大小較對照組小；乳腺癌干細胞成球的數量和大小隨著維生素D濃度的增加而減少和變小，見圖6。Western blot檢測結果顯示，與對照組比較，不同濃度維生素D作用均可降低乳腺癌干細胞CSCSUM159干性標志物CD133、CD44和Nanog的表達水平，且隨著維生素D濃度增加，抑制效果增強，見圖7。以上結果表明，維生素D可抑制乳腺癌干細胞CSCSUM159的活力。

圖6 顯微鏡觀察維生素D干預對乳腺癌干細胞CSCSUM159生長的影響（×100）Fig.6 Effect of Vitamin D on growth of CSCSUM159 observed by microscope（×100）

圖7 維生素D對乳腺癌干細胞CSCSUM159干性標志物蛋白表達的影響Fig.7 Effect of Vitamin D on the protein expression of breast cancer stem cells markers of CSCSUM159 cells

2.4 維生素D對乳腺癌干細胞CSCSUM159中Wnt/β-catenin信號通路活性的影響

Western blot檢測結果顯示，與對照組相比，不同濃度維生素D均可下調Wnt/β-catenin信號通路中p-GSK-3β、β-catenin和c-Myc蛋白的表達水平，見圖8。Real-time qPCR檢測結果顯示，與對照組相比，不同濃度維生素D亦可下調CSCSUM159細胞中β-catenin、c-Myc和 cyclin-D1的 mRNA表達水平（P＜0.05），見表 2、圖 9。

圖8 不同濃度維生素D對乳腺癌干細胞CSCSUM159中Wnt/β-catenin信號通路相關蛋白表達水平的影響Fig.8 EffectofVitamin D on the protein expression of Wnt/β-catenin signaling pathway in CSCSUM159 cells

表2 不同濃度維生素D對乳腺癌干細胞CSCSUM159中β-catenin、c-Myc和cyclin-D1 mRNA表達的影響Tab.2 Effect of Vitamin D on the mRNA expression of β-catenin，c-Myc and cyclin-D1 in CSCSUM159 cells

3 討論

腫瘤干細胞是腫瘤組織中極少的一部分腫瘤細胞，具有與干細胞相似的生物學特性，如無限增殖、自我更新和多向分化潛能等。研究表明，腫瘤干細胞在腫瘤發生發展過程中發揮關鍵調控作用［2］。腫瘤干細胞表達特征性標志物，其中乳腺癌干細胞標志物包括CD133、CD44、Oct-4、Nanog和 ALDH1A1 等［5-6］。無血清懸浮培養法是目前分離乳腺癌干細胞最常用的方法之一［7-8］。本研究采用無血清懸浮培養方法獲取乳腺癌干細胞，發現與常規貼壁培養相比，無血清懸浮培養可富集腫瘤細胞球，且分離的腫瘤細胞球中乳腺癌干細胞標志物CD133、CD44、Oct-4以及Nanog的蛋白和mRNA表達水平均顯著上調，說明該培養模型可有效富集乳腺癌干細胞CSCSUM159。

維生素D為一組含環戊氫烯菲環結構，并具有鈣化醇生物活性的一類物質，是人體必需的營養物質之一。維生素D可調節體內鈣磷代謝，參與細胞代謝和組織功能的調節，且在細胞的分化增殖中發揮重要的調節作用［9］。近年來，有研究發現維生素D還具有抗腫瘤作用，可抑制腫瘤細胞的增殖、遷移、侵襲及血管生成［9］。流行病學研究表明，乳腺癌患者往往表現為低維生素D水平，呈現血清維生素D缺乏狀態［10］，且維生素D缺乏可增加乳腺癌發病風險［10-11］。據報道，維生素D可抑制人乳腺癌細胞MCF-7的遷移和侵襲［3］，同時可減少MCF-7細胞中腫瘤干細胞的數量［4］。查閱相關文獻［12-13］發現，維生素D 在10 μmol/L濃度范圍即可對腫瘤發揮抑制作用，本研究采用不同濃度維生素 D（1 μmol/L、5 μmol/L、10 μmol/L 和 20 μmol/L）干預乳腺癌SUM159細胞，結果亦發現不同濃度維生素D均可抑制乳腺癌細胞SUM159活力。進一步采用 1 μmol/L、5 μmol/L 和 10 μmol/L 濃度的維生素 D干預乳腺癌干細胞CSCSUM159，發現均可抑制乳腺癌干細胞球形成，且隨著濃度升高，其對乳腺癌干細胞球數量和大小的抑制作用增強；同時維生素D還可顯著下調乳腺癌干細胞標志物CD133、CD44和Nanog的表達，說明維生素D對乳腺癌干細胞CSCSUM159的活性具有抑制作用，與上述文獻報道一致。

圖9 不同濃度維生素D對乳腺癌干細胞CSCSUM159中β-catenin、c-Myc和cyclin-D1 mRNA表達的影響Fig.9 Effect of Vitamin D on the mRNA expression of β-catenin,c-Myc and cyclin-D1 in CSCSUM159 cells

有研究發現腫瘤干細胞活性受Wnt、Notch、Hedgehog和Bmi等信號通路調控，其中Wnt/β-catenin信號通路是調控多種腫瘤干細胞活性的關鍵信號通路［14］。LIU 等［15］研究發現，miR-221/222可通過抑制Wnt/β-catenin信號通路的負調節因子，激活Wnt/β-catenin信號通路，從而促進乳腺癌的侵襲性。XIONG等［16］發現，通過調控乳腺癌細胞LRP6和DVL2的磷酸化水平，可抑制Wnt/β-catenin信號通路活性，進而抑制乳腺癌細胞生長。而ZHENG等［17］研究亦發現維生素D可通過抑制Wnt/β-catenin信號通路誘導乳腺癌MCF-7干細胞對他莫昔芬的敏感性。以上研究結果表明，Wnt/β-catenin信號通路在乳腺癌及乳腺癌干細胞中具有調控作用。c-Myc和 cyclin-D1［18］是Wnt/β-catenin信號通路的下游靶基因，而p-GSK-3β和β-catenin是該信號通路的關鍵分子［19］。本研究結果顯示，維生素D可下調乳腺癌干細胞CSCSUM159中p-GSK-3β、β-catenin及c-Myc的蛋白表達水平，同時下調β-catenin、c-Myc和cyclin-D1的 mRNA表達水平，表明維生素D對Wnt/β-catenin信號通路活性具有調控作用，提示維生素D可能通過調控Wnt/β-catenin信號通路對乳腺癌干細胞活性發揮干預作用。

綜上所述，本研究發現維生素D可抑制乳腺癌干細胞活性，可能與其調控Wnt/β-catenin信號通路活性有關，為維生素D應用于乳腺癌治療提供新的思路。