MYC在彌漫大B細胞淋巴瘤的表達及其臨床意義

柯晴 段瑩 黃文強 譚曉虹 岑洪

作者單位：530021 南寧1廣西醫科大學附屬腫瘤醫院淋巴血液腫瘤科；柳州 5450012柳州市人民醫院腫瘤內科

彌漫大B細胞淋巴瘤（diffuselargeB-celllymphoma，DLBCL）是一種高度異質性的淋巴系統惡性腫瘤，也是非霍奇金淋巴瘤（non-Hodgkin lymphoma，NHL）最常見的類型，發病率占非霍奇金淋巴瘤的30%左右［1］。利妥昔單抗時代R-CHOP方案（利妥昔單抗聯合環磷酰胺、多柔比星、長春新堿、潑尼松）較傳統的CHOP方案可提高DLBCL患者的治療效果，然而仍有近40%的患者對治療反應差，預后欠佳［2］。因此，尋找用于識別這部分預后欠佳患者的標志物尤為重要。

MYC基因是1979年發現的一種原癌基因，其編碼的蛋白可作為轉錄因子參與細胞周期調控、細胞增殖與凋亡、能量合成代謝等［3-5］。2016年WHO淋巴組織腫瘤分類中將MYC遺傳學改變列為DLBCL的重要診斷指標之一［6］。多項研究結果顯示，MYC基因拷貝數增加及擴增是DLBCL預后不良的因素［7-8］。本研究回顧性分析220例初治DLBCL患者的臨床資料，采用免疫組織化學法檢測MYC蛋白表達及對預后的影響，并通過GEO數據庫分析數據集GSE10846中MYC基因在DLBCL組織中的表達及其與預后的關系，以期尋找DLBCL新的預后預測標志物。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

收集2011年2月至2018年8月廣西醫科大學附屬腫瘤醫院收治的220例彌漫大B細胞淋巴瘤患者的臨床病理資料。納入標準：⑴年齡≥18歲；⑵初治；⑶經病理組織形態學及免疫組化確診，診斷標準參照WHO（2008）淋巴造血系統腫瘤分類標準及2016年分類更新［6］；⑷治療前行組織活檢，并有福爾馬林固定石蠟包埋的組織標本；⑸臨床病理資料完整；⑹排除合并AIDS/HIV感染、合并第二腫瘤患者。

1.2 方法

1.2.1 免疫組織化學法檢測 采用免疫組織化學法檢測病理切片中MYC的表達。采用雙盲法，由2位病理醫師分別閱片評判。MYC蛋白陽性反應為棕黃色顆粒定位于細胞核，參照HORN等［9］報道，不考慮細胞染色強度，只計數細胞染色百分比進行半定量計數，以10%為間隔增量。高倍鏡（×200）視野下計數染色腫瘤細胞占所有腫瘤細胞的百分比。

1.2.2 生物信息學分析 從GEO公共數據庫（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo）中下載MYC基因mRNA表達譜數據集GSE10846，共包含414例DLBCL患者淋巴結組織樣本，其中活化B細胞樣（activated B-celllike，ABC）亞型167例，生發中心B細胞樣（germinal center B-cell-like，GCB）亞型183例，64例不能分類型。基于GSE10846數據集MYC的表達信息，使用R語言（版本：3.5.2）分析MYC基因表達與DLBCL患者預后的關系。

1.3 判定標準

療效評價采用2014年Lugano會議修訂標準［10］，分為完全緩解（CR）、部分緩解（PR）、疾病穩定（SD）、疾病進展（PD）。按基因表達譜將DLBCL分為ABC亞型、GCB 亞型和不能分類型（UC）［11］。Hans分類法［12］將DLBCL分為GCB型和非生發中心B細胞（non-GCB）型。

1.4 隨訪

所有病例均以病理確診當日為隨訪起點，隨訪截止時間為2019年6月31日。隨訪方式主要以化療后返院復診、電話隨訪為主。總生存期（overall survival，OS）指自病理確診至因任何原因死亡的時間；無進展生存期（progress-free survival，PFS）指自病理確診至出現腫瘤進展或死亡的時間。

1.5 統計學方法

采用SPSS 20.0軟件進行數據分析。采用受試者工作特征曲線（receiver operating characteristic curve，ROC）計算MYC蛋白陰性和陽性表達的閾值。計數資料組間差異比較采用χ2檢驗或Fisher確切概率法。單因素生存分析采用Kaplan-Meier法，并用Log-rank法比較組間生存率，采用Cox回歸模型分析MYC與DLBCL患者OS及PFS的關系。以雙側P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 MYC蛋白在DLBCL患者組織中的表達

MYC蛋白陽性表達為棕黃色顆粒定位于細胞核（圖1）。應用ROC曲線，以MYC蛋白表達值為檢驗變量，OS為狀態變量，以約登指數最大的點作為MYC蛋白陽性和陰性表達的閾值，即以30%的腫瘤細胞出現MYC蛋白表達為最佳閾值，其靈敏度為52.2%，特異度為97.0%，ROC曲線下面積為0.751（0.681～0.812），見圖 2。本組 220例DLBCL 患者 MYC蛋白陰性表達179例，MYC蛋白陽性表達41例，陽性表達率為18.64%（41/220）。

圖1 MYC蛋白在彌漫大B細胞淋巴瘤患者中的表達Fig.1 MYC protein expression in DLBCL patients

圖2 確定MYC蛋白陽性表達閾值的ROC曲線Fig.2 The ROC curve for determining the threshold of positive MYC protein expression

2.2 MYC蛋白表達與DLBCL患者臨床病理特征的關系

MYC蛋白表達陰性組DLBCL患者及MYC蛋白表達陽性組患者的性別、年齡、Ann-Arbor分期、結外受累器官數目、LDH、B癥狀、免疫亞型、化療方案、化療周期數、近期療效等比較差異無統計學意義（P＞0.05），MYC蛋白表達陽性組的ECOG評分和IPI評分較陰性組更高，差異有統計學意義（P＜0.05），見表1。

表1MYC蛋白表達與DLBCL患者臨床病理特征的關系Tab.1 The relationship between MYC protein expression of DLBCL patients and its clinical pathological characteristics

2.3 MYC蛋白與DLBCL患者預后的關系

與MYC蛋白表達陰性的DLBCL患者相比，MYC蛋白表達陽性患者的OS及PFS顯著縮短，差異有統計學意義（P＜0.001），見圖3。亞組分析顯示，在GCB免疫亞型中，MYC蛋白陽性表達患者較陰性表達患者OS顯著縮短（P＜0.001），見圖4；在non-GCB免疫亞型中，MYC蛋白陽性表達患者OS及PFS亦較陰性表達患者顯著縮短，差異有統計學意義（P＜0.001），見圖5。

Cox比例風險回歸模型分析結果顯示，MYC蛋白表達、免疫亞型是影響DLBCL患者預后的獨立危險因素（P＜0.05），見表 2～3。

圖3MYC蛋白表達對DLBCL患者OS及PFS的影響Fig.3 The influences of MYC protein expression on the OS and PFS of DLBCL patients

圖4MYC蛋白表達對GCB亞型DLBCL患者OS及PFS的影響Fig.4 The influences of MYC protein expression on the OS and PFS of patients with GCB subtype of DLBCL

圖5MYC蛋白表達對non-GCB亞型DLBCL患者OS及PFS的影響Fig.5 The influences of MYC protein expression on the OS and PFS of patients with non-GCB subtype of DLBCL

表2 影響DLBCL患者OS的單因素及多因素分析Tab.2 Univariate and multivariate analysis of prognostic factors for OS in DLBCL patients

表3 影響DLBCL患者PFS的單因素及多因素分析Tab.3 Univariate and multivariate analysis of prognostic factors for PFS in DLBCL patients

2.4 GEO數據庫中MYC基因表達與DLBCL患者預后的關系

基于GEO數據庫GSE10846數據集中MYC基因的表達信息，采用R語言（版本：3.5.2）進行分析。將MYC基因表達量按照中位數劃分為高表達組和低表達組，結果顯示，與MYC基因低表達組的DLBCL患者相比，MYC基因高表達組患者的OS顯著縮短，差異有統計學意義（P＜0.01），見圖6A。在GCB免疫亞型患者中，MYC基因高表達患者較低表達患者的OS顯著縮短，差異亦有統計學意義（P＜0.05），見圖6B；在ABC免疫亞型患者中，MYC基因高低表達患者的OS差異無統計學意義（P＞0.05），見圖6C。

圖6GEO數據庫中MYC基因表達對DLBCL患者OS的影響Fig.6 The influences of MYC gene expression on the OS of DLBCL patients in GEO database

3 討論

DLBCL是最常見的非霍奇金淋巴瘤類型，其臨床表現、病理形態學、免疫表型、細胞遺傳學、分子生物學、治療反應及疾病轉歸等均有顯著異質性。在利妥昔單抗前時代，多項研究已證實MYC基因重排的DLBCL患者采用標準CHOP方案化療預后不良［13-14］。在利妥昔單抗時代，標準R-CHOP方案使 DLBCL患者治療效果較前改善，但仍有一部分患者治療反應差，容易復發及進展［15-16］。有效篩選這部分預后欠佳的患者，將有助于進一步改善其療效和預后。目前臨床上評估預后較多采用IPI。IPI主要強調年齡、臨床分期、ECOG評分、結外侵犯器官數目等臨床因素對患者預后的影響，但并未反映疾病的生物學異質性，因此不能有效指導疾病的治療及預后評估。MYC基因定位于染色體8q24.1，其編碼的轉錄因子在細胞核內結合于單鏈或雙鏈DNA上，可調控轉錄過程，廣泛參與細胞生長、分化、凋亡等，在腫瘤細胞增殖和癌細胞轉移中發揮關鍵作用［17］。研究發現MYC基因異常與DLBCL患者的病理形態、化療療效及預后密切相關［18］。HORN 等［9］對 442例 DLBCL患者的石蠟包埋腫瘤標本進行MYC檢測，多因素分析顯示MYC基因重排是影響預后的因素。SAVAGE等［19］對135例DLBCL患者研究亦發現8.8%的患者存在MYC基因重排，且伴MYC基因重排的患者多表現為侵襲性臨床進程，對治療反應差，5年PFS及OS較差。ZHOU等［20］對4 662例患者進行回顧性分析，結果亦顯示MYC基因突變為DLBCL的獨立預后因素，且利妥昔單抗不能改善伴MYC基因突變患者的預后，認為MYC基因異常可作為DLBCL高危患者的篩查指標。目前用于檢測MYC基因的方法主要有核型分析方法和FISH，但兩者均具有成本高，不利于在基層醫院推廣應用等特點。免疫組織化學技術是臨床病理診斷常用的技術，耗時短、費用低、操作方便，且有成熟的針對MYC蛋白的單克隆抗體，可利用免疫組織化學法對福爾馬林固定及石蠟包埋的DLBCL患者活檢組織中的MYC蛋白進行測定，但目前尚無統一判斷MYC蛋白陽性的閾值。本研究參考DONIZY 等［21］和 YUAN 等［22］研究，通過 ROC 曲線計算MYC蛋白表達閾值為30%，免疫組織化學法檢測結果顯示MYC蛋白陽性表達率為18.64%。分析MYC蛋白表達與DLBCL患者臨床病理特征的關系，發現MYC蛋白表達陽性患者ECOG評分和IPI評分更高，提示MYC蛋白表達陽性患者預后更差，與GUPTA等［23］研究結果一致。進一步進行生存分析發現MYC蛋白表達陽性DLBCL患者的OS及PFS均較陰性患者明顯縮短，多因素分析結果亦顯示MYC蛋白陽性表達是影響DLBCL患者OS和PFS的獨立危險因素，分析GEO數據庫中DLBCL基因表達譜數據集GSE10846，結果同樣顯示MYC基因高表達的患者OS明顯縮短，再次印證MYC高表達的DLBCL患者預后較差，與國內外臨床研究結果相符［18-23］。

OKI等［24］報道伴MYC基因重排的DLBCL患者，尤其是MYC基因重排同時伴BCL-2基因或（和）BCL-6基因重排的患者（即“雙打擊”或“三打擊”的淋巴瘤）多為GCB表型，這部分患者具有高度侵襲性，預后較差，對目前標準的R-CHOP方案治療反應差，CR率僅為40%，5年OS及PFS分別為22%和20%。MYC蛋白與BCL-2蛋白共表達稱為“雙表達淋巴瘤”，多見于ABC/non-GCB亞型。有研究顯示“雙表達淋巴瘤”患者預后較差，且具有更高的中樞神經系統復發風險［25］。基于不同免疫亞型DLBCL患者預后的差異，本研究對220例DLBCL患者進行亞組分析，結果顯示GCB免疫亞型中MYC蛋白陽性表達患者的OS明顯縮短，數據集GSE10846分析亦同樣證實這一結果，與多項研究［26-27］結果一致。提示MYC為GCB亞型預后不良的影響因素，有望作為識別GCB亞型預后不良患者的指標。但在ABC免疫亞型中，本研究結果與數據集GSE10846中關于MYC對OS的影響結果不一致，考慮可能與本研究納入的病例數較少有關，兩者的關系有待進一步驗證。值得注意的是，在當前使用R-CHOP方案的治療策略下，MYC高表達的DLBCL患者預后欠佳，因此尋找新的治療策略尤為必要。有研究發現MYC基因重排DLBCL患者一線使用DA-EPOCH-R［28］、聯合來那度胺與化療［29］或者一線治療后予自體造血干細胞移植作為鞏固治療［30］等可帶來更好的生存獲益。但目前針對此類患者尚無統一的治療方案，在強調個體化治療的時代，尚需開展大樣本、多中心、前瞻性的臨床試驗，以尋找最佳治療方案。

綜上所述，本研究發現采用免疫組織化學法檢測DLBCL組織中MYC蛋白簡便、經濟、可行，MYC蛋白陽性表達與DLBCL患者不良預后有關，MYC蛋白有望成為預測預后不良DLBCL患者的指標。但本研究屬回顧性分析，臨床資料收集過程可能存在偏倚，病理蠟塊存放時間不一，MYC蛋白不同程度丟失，可能影響其陽性表達率。在精準醫學時代，識別預后不良DLBCL患者并給予相應的個體化治療對提高DLBCL療效或治愈率至關重要。因此，今后仍需對患者進行精準分類、分型，給予最佳的個體化治療方案，使患者獲益最大化。