比色法測定豬飼料中亞硝酸鹽含量的不確定度評定

魏桂云，林艷秋，李郁，黃銘輝，劉芳，劉華豐

（福建省產品質量檢驗研究院，福建 福州 350002）

測量不確定度是一個合理表征測量結果分散性的參數，報告測量不確定度就是對測量結果質量的定量表征。測量不確定度的大小往往影響著科研試驗的水平，因此需要對測量結果的不確定度進行評定。JJF 1059.1-2012《測量不確定度評定與表示》中規定，完整的測量結果應報告被測量的估計值及其測量不確定度以及有關的信息[1]。試驗依據GB/T 13085-2018 《飼料中亞硝酸鹽的測定 比色法》[2]的測定原理和方法，建立相應的數學模型，運用測量不確定度評定的基本方法，對模型中各影響因素的不確定度進行計算和評定[3]。

1 材料與方法

1.1 試劑

硫酸鋅(120 g/L)、氫氧化鈉溶液(20 g/L)、乙酸溶液（60%）、氯化銨緩沖溶液（量取500 mL水于1 L容量瓶，加入20mL鹽酸，混勻，加入50mL氨水，用水定容至刻度，調節pH至9.6～9.7）、對氨基苯磺酸溶液(5g/L)、鹽酸萘乙二胺溶液(1gL)、顯色劑(臨用前將對氨基苯磺酸溶液和鹽酸萘乙二胺溶液等體積混合)。

1.2 儀器

紫外可見分光光度計（UV-2700）：日本島津公司(KYOTO)；

電子天平（感量0.0001g）：德國賽多利斯科學儀器（北京）有限公司。

1.3 標準溶液的配制

精確稱取250.0 mg經(115±5)℃烘至恒重的亞硝酸鈉，加水溶解，轉移至500 mL容量瓶中，加100 mL氯化銨緩沖液，加水稀釋至刻度，混勻，臨用前，移取1.00 mL上述溶液于100 mL容量瓶中，用水稀釋至刻度，混勻。

1.4 樣品處理

稱取約5 g試樣(精確到0.001 g)，置于200 mL錐形瓶中，加70 mL水和1.2 mL氫氧化鈉溶液，混勻，用氫氧化鈉溶液調節pH至8～9，加入10 mL硫酸鋅溶液，混勻，置于60 ℃水浴中加熱10 min，取出后冷卻至室溫，全部轉移至200 mL容量瓶中，加水至刻度，混勻。放置30 min，過濾，棄去初濾液約20 mL，收集剩余濾液為試液。分別移取2份10.0 mL試液于25 mL容量瓶a和b中，在容量瓶a中加入4.5 mL氯化銨緩沖溶液、2.5 mL乙酸溶液后用水定容至刻度，混勻；在容量瓶b中加入4.5 mL氯化銨緩沖溶液，2.5 mL乙酸溶液后立即加入5.0 mL顯色劑，用水定容至刻度，混勻，避光放置25 min后在波長538 nm處，以容量瓶a溶液為試樣參比，測定容量瓶b溶液的吸光度值。

1.5 亞硝酸鹽標準曲線的制備

分別準確移取0、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0 mL亞硝酸鈉標準工作液于25 mL容量瓶，各加入4.5 mL氯化銨緩沖液，2.5 mL乙酸溶液后，立即加入5.0 mL顯色劑，定容搖勻，避光靜置25 min，測定吸光度。

2 數學模型的建立與不確定度來源分析

2.1 建立數學模型

根據亞硝酸鹽（以亞硝酸鈉計）含量的計算公式建立數學模型，如下：

式中：

X為樣品中亞硝酸鹽的含量，mg/kg；

m1為試樣質量，g；

m2為測定用試液中亞硝酸鹽的含量，μg；

V1為樣品處理后試液的總體積，mL；

V2為測定用試液的體積，mL；

1000為單位換算系數。

2.2 識別和分析不確定來源

通過測量過程及數學模型分析，豬飼料中亞硝酸鹽含量測定的不確定度來源主要包括樣品質量的不確定度、測定用試液中亞硝酸鹽含量的不確定度、樣品定容體積不確定度、測定用試液體積的不確定度及重復性引起的不確定度。

3 不確定度分量的評定

3.1 樣品稱量的不確定度urel(m1)

樣品稱量質量為5 g，天平鑒定證書給出的質量允許誤差為±0.15 mg，為B類評定，假設在區間內為均勻分布，則：

相對標準不確定度

3.2 測定用試液中亞硝酸鹽的含量的不確定度urel(m2)

3.2.1 亞硝酸鈉純度引起的不確定度urel1(m2)

分析純亞硝酸鈉含量(≥99.0%)引起的不確定度，允許誤差為1%，按照矩陣分布處理，包含因子

相對標準不確定度

3.2.2 標準使用液配制帶來的不確定度urel2(m2)

標準使用液配制帶來的不確定度包括標準物質稱量帶來的不確定度、定容所用容量瓶不確定度及稀釋過程移液管帶來的不確定度。

3.2.2.1 標準物質稱量不確定度urel2.1(m2)

標準物質稱取量為250.0 mg，天平鑒定證書給出的質量允許誤差為±0.15 mg，為B類評定，假設在區間內為均勻分布，則:

相對標準不確定度

3.2.2.2 定容用500 mL容量瓶體積帶來的不確定度urel2.2(m2)

⑴根據JJG 196-2006《常用玻璃量器檢定規程》[4]的規定，A級500 mL容量瓶的容量允差為±0.25 mL，假設按照三角形分布處理，則：

容量瓶體積帶來的不確定度

⑵溫度引起體積變動的不確定度u2.2b(m2)：使用容量瓶校準是在20℃條件下，而實驗室的溫度在±4 ℃之間變動，該影響引起的不確定度可通過估算該溫度范圍和體積膨脹系數來進行計算。液體的體積膨脹明顯大于容量瓶的體積膨脹，因此只需要考慮前者即可。水的體積膨脹系數為2.1×10-4/℃，產生的體積變化量為：

體積×膨脹系數×ΔＴ=500×2.1×10-4×4=0.420 mL

假設溫度變化是矩形分布，則

⑶定容至刻度的變異性引起的不確定度u2.2c(m2)：通過對典型的500 mL容量瓶充滿10次并稱量（表1），得出標準偏差為0.0328 mL，由此引入的不確定度分量u2.2c(m2)=0.0328 mL。

所以500 mL容量瓶帶來的不確定度：

表1 500 mL容量瓶定容重復性數據

3.2.2.3 定容用100 mL容量瓶體積帶來的不確定度urel2.3(m2)

⑴根據JJG 196-2006《常用玻璃量器檢定規程》[4]的規定，A級100 mL容量瓶的容量允差為±0.10 mL，假設按照三角形分布處理則：

容量瓶體積帶來的不確定度

⑵溫度引起體積變動的不確定度u2.3b(m2)

使用容量瓶校準是在20 ℃條件下，而實驗室的溫度在±4 ℃之間變動，該影響引起的不確定度可通過估算該溫度范圍和體積膨脹系數來進行計算。液體的體積膨脹明顯大于容量瓶的體積膨脹，因此只需要考慮前者即可。水的體積膨脹系數為2.1×10-4/℃，產生的體積變化量為：

體積×膨脹系數×ΔＴ=100×2.1×10-4×4=0.0840 mL

假設溫度變化是矩形分布，則

⑶定容至刻度的變異性引起的不確定度u2.3c(m2)

通過對典型的100 mL容量瓶充滿10次并稱量（表2），得出標準偏差為0.0443 mL，由此引入的不確定度分量u2.2c(m2)=0.0443mL。

所以100mL容量瓶帶來的不確定度:

表2 100 mL容量瓶定容重復性數據

3.2.2.4 稀釋過程移液管帶來的不確定度urel2.4(m2)

⑴根據JJG 196-2006 《常用玻璃量器檢定規程》[4]的規定，A級1 mL移液管的容量允差為±0.007 mL，假設按照三角形分布處理則：

⑵溫度引起體積變動的不確定度u2.4b(m2)

移液管校準是在20 ℃條件下，而實驗室的溫度在±4 ℃之間變動，該影響引起的不確定度可通過估算該溫度范圍和體積膨脹系數來進行計算。液體的體積膨脹明顯大于容器的體積膨脹，因此只需要考慮前者即可。水的體積膨脹系數為2.1×10-4/℃，產生的體積變化量為:

體積×膨脹系數×ΔＴ=1×2.1×10-4×4=0.000840 mL

假設溫度變化是矩形分布，則

則1mL移液管帶來的不確定度:

標準溶液配制帶來的不確定度

3.2.3 繪制標準曲線帶來的不確定度urel3(m2)

3.2.3.1 移液管使用帶來的不確定度urel3.1(m2)

⑴根據JJG 196-2006《常用玻璃量器檢定規程》[4]的規定，A級2 mL移液管的容量允差為±0.010 mL，假設按照三角形分布處理則：

⑵溫度引起體積變動的不確定度u3.1b(m2)

實驗室的溫度變化±4 ℃，水的體積膨脹系數為2.1×10-4/℃，產生的體積變化量為

體積×膨脹系數×ΔＴ=2×2.1×10-4×4＝0.00168mL

假設溫度變化是矩形分布，則

則2 mL移液管帶來的不確定度

3.2.3.2 標準曲線擬合引入的不確定度urel3.2(m2)，B類不確定度

⑴按試驗方法測得標準系列的吸光度（表3）。

表3 標準系列及對應吸光度

由表3得曲線回歸方程：

y=0.0178x-0.0003，曲線斜率b=0.0178，曲線截距a=-0.0003

對測定用樣液進行2次測量，即p=2，測得樣液中亞硝酸鹽含量c0=1.76 μg。

標準不確定度

由此繪制標準曲線帶來的不確定度urel3(m2)

根據上述各影響因素的不確定度求得試液中亞硝酸鹽的含量的不確定度urel(m2)

3.3 樣品定容體積不確定度urel(V1)

3.3.1 根據JJG 196-2006《常用玻璃量器檢定規程》[4]的規定，B級200 mL容量瓶的容量允差為±0.30 mL，假設按照三角形分布處理則：

容量瓶體積帶來的不確定度

3.3.2 溫度引起體積變動的不確定度u2(V1)

使用容量瓶校準是在20 ℃條件下，而實驗室的溫度在±4 ℃之間變動，該影響引起的不確定度可通過估算該溫度范圍和體積膨脹系數來進行計算。液體的體積膨脹明顯大于容量瓶的體積膨脹，因此只需要考慮前者即可。水的體積膨脹系數為2.1×10-4/℃，產生的體積變化量為：

體積×膨脹系數×ΔＴ=200×2.1×10-4×4＝0.168 mL

假設溫度變化是矩形分布，則

3.3.3 定容至刻度的變異性引起的不確定度u3(V1)

通過對典型的200 mL容量瓶充滿10次并稱量，（見表3）得出標準偏差為0.0387 mL，由此引入的不確定度分量u3(V1)=0.0387 mL。

所以200mL容量瓶帶來的不確定度:

表3 200 mL容量瓶定容重復性數據

3.4 測定用試液體積的不確定度urel(V2)

3.4.1 根據JJG 196-2006《常用玻璃量器檢定規程》[4]的規定，A級10 mL移液管的容量允差為±0.020 mL，假設按照三角形分布處理則

3.4.2 溫度引起體積變動的不確定度u2(V2)

移液管校準是在20 ℃條件下，而實驗室的溫度在±4 ℃之間變動，該影響引起的不確定度可通過估算該溫度范圍和體積膨脹系數來進行計算。液體的體積膨脹明顯大于容器的體積膨脹，因此只需要考慮前者即可。水的體積膨脹系數為2.1×10-4/℃，產生的體積變化量為：

體積×膨脹系數×ΔＴ=10×2.1×10-4×4＝0.00840 mL

假設溫度變化是矩形分布，則

測定用試液體積的不確定度urel(V2)

3.5 檢測方法重復性引入的不確定度urel(X)

在重復性條件下，獨立測試豬飼料樣品T=6次，結果分別為6.43、6.50、 6.60 、6.79 、6.88、6.68 mg/kg，其算術平均值為X=6.65 mg/kg。

以極差法求其不確定度，極差R=0.45 mg/kg,極差系數C=2.53，則

3.6 合成標準不確定度u(X)

根據各分量的相對不確定度，合成標準不確定度

4 結果的報告

取置信概率95%，包含因子k=2，評定擴展不確定度

豬飼料中亞硝酸鹽（以亞硝酸鈉計）含量檢測結果：（6.65±0.45）mg/kg

5 討論

圖1 urel(X)合成不確定度分量

圖2 urel(m2)試液中亞硝酸鹽含量的不確定度分量

豬飼料中亞硝酸鹽含量為6.65 mg/kg時，擴展不確定度U(X)=0.45 mg/kg，包含因子k=2。通過對各不確定度分量的識別、分析和量化，可以知道測定用試液中亞硝酸鹽含量的不確定度占比最大（圖1），在urel(m2)中又以繪制標準曲線帶來的不確定度為最(圖2)，因此在試驗過程中要嚴格控制好標準曲線繪制，從而得到更精準的試驗結果。