白魔芋花器官草酸鈣晶體對(duì)隱翅蟲(chóng)的潛在防御能力研究

黃保國(guó) 唐 榮 陳 高,4 李新輝

( 1. 西南林業(yè)大學(xué)生態(tài)與環(huán)境學(xué)院，云南 昆明 650233；2. 云南省極小種群野生植物綜合保護(hù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650233；3. 中國(guó)科學(xué)院大學(xué)，北京 100049；4. 中國(guó)科學(xué)院東亞植物多樣性與生物地理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650204)

草酸鈣晶體廣泛存在于植物組織中，研究發(fā)現(xiàn)至少有215科植物中含有草酸鈣晶體[1]，且在植物的根、莖、葉、花、種子等都有分布[2-3]。草酸鈣晶體在植物中具有多種不同的功能，如鈣調(diào)控、解毒、離子平衡、植物的剛性支撐等[4-6]。此外，多數(shù)植物中草酸鈣晶體的存在都具有保護(hù)植物不受動(dòng)物取食的功能[4]。植物組織中的草酸鈣晶體可以讓植物變的難以下咽或?qū)θ∈痴弋a(chǎn)生傷害進(jìn)而避免被大量取食，以達(dá)到保護(hù)自身的作用[2,4]。草酸鈣晶體的類(lèi)型、大小、位置和數(shù)量在對(duì)防止動(dòng)物取食的效果上都會(huì)有影響[7]。Ward研究發(fā)現(xiàn)脊椎動(dòng)物和無(wú)脊椎草食動(dòng)物都避免取食巨型彈簧草（Pancratium sickenbergeri）草酸鈣晶體含量最高的部位[8]。

天南星科植物組織中普遍存在草酸鈣晶體[3]。該科植物中的草酸鈣晶體存在于植物的各個(gè)部位，且具有非常豐富的變化[9]，Coté[10]研究了天南星科21種植物花序各部位中草酸鈣晶體的多樣性，發(fā)現(xiàn)不同部位的草酸鈣晶體含量與天南星科（Araceae）植物類(lèi)群傳粉策略存在一定的因果關(guān)系。對(duì)天南星科植物中草酸鈣晶體的研究主要集中在植物的營(yíng)養(yǎng)器官上，而對(duì)于繁殖器官中草酸鈣晶體的研究較少[10]。Prychid等[11]研究10種魔芋屬（Amorphophallus）植物發(fā)現(xiàn)其葉片上具有不同類(lèi)型的草酸鈣晶體，Bernardino-Nicanor等[12]也發(fā)現(xiàn)草酸鈣晶體的防御功能在植物體重要部位得到加強(qiáng)的現(xiàn)象。白魔芋（Amorphophallus albus）是天南星科魔芋屬多年生草本植物[13]，是劉佩瑛等[14]于1984年發(fā)表的新種。白魔芋特有分布在金沙江干熱河谷下游區(qū)域，如云南永善，四川金陽(yáng)、屏山等[15]，該物種是當(dāng)?shù)靥赜械慕?jīng)濟(jì)作物，相較于花魔芋來(lái)說(shuō)，白魔芋塊莖中葡甘聚糖含量更高，品質(zhì)更好[16]。在前期對(duì)白魔芋開(kāi)花過(guò)程的調(diào)查發(fā)現(xiàn)，白魔芋花期花序中聚集有大量的隱翅蟲(chóng)，隱翅蟲(chóng)在花序中交配、取食，并產(chǎn)卵，完成對(duì)白魔芋的傳粉。花期結(jié)束后，白魔芋花序不同部分（不育區(qū)、雄蕊、附屬物）均遭到不同程度的取食，但雌蕊區(qū)卻未受到影響。為探尋導(dǎo)致白魔芋傳粉昆蟲(chóng)產(chǎn)生取食偏好的原因，本研究通過(guò)分析花序各部位草酸鈣的含量差異，探討其與白魔芋花序不同部分被取食差異的潛在關(guān)系。

1 材料與方法

2018年7月，隨機(jī)選取四川省金陽(yáng)縣洛解村（103°13′52.75″E，27°38′20.73″N，海拔 1 404 m）種植的白魔芋50株，統(tǒng)計(jì)其花序中隱翅蟲(chóng)的數(shù)量并用游標(biāo)卡尺測(cè)量花序各部分（附屬器、雄蕊、不育區(qū)和雌蕊，圖1）被隱翅蟲(chóng)取食的比例。取食比例=被取食的長(zhǎng)度/總長(zhǎng)度。

選擇12株2018年7月從四川省金陽(yáng)縣采集的帶花序白魔芋植株，將整個(gè)花序的雌蕊區(qū)、退化雄蕊區(qū)、雄蕊區(qū)及附屬物區(qū)采用手術(shù)刀片切割成1 cm的小塊。然后用10% NaOH溶液浸泡48 h，再置于飽和的NaClO溶液中脫色48 h。脫色完成后在清水中進(jìn)行漂洗，隨后采用25%、50%、75%、100%梯度的乙醇進(jìn)行脫水，最后采用純二甲苯透明后用中性樹(shù)膠封片，自然風(fēng)干后在光學(xué)顯微鏡（OLYMPUS-BX51）10倍目鏡下搭配佳能數(shù)碼相機(jī)（CANON-EOS550D）下進(jìn)行觀(guān)察和拍照。每個(gè)植株不同部分的樣品觀(guān)察至少3個(gè)視野（每個(gè)視野面積1 250 μm2），花序不同區(qū)域一共觀(guān)察累計(jì)不少于36次，統(tǒng)計(jì)樣品內(nèi)的草酸鈣針晶胞的平均數(shù)量。

采用手術(shù)刀片分別將4株白魔芋花序中4個(gè)部分切割下來(lái)，每株的不同部分分別稱(chēng)取1 g鮮質(zhì)量組織，用研缽搗碎之后用60%甲醇溶液5 mL過(guò)夜提取12 h。將各部位提取物過(guò)濾，濃縮后定容到2.5 mL；然后用移液槍吸取5 μL滴于隱翅蟲(chóng)頭部，記錄隱翅蟲(chóng)的活躍情況；同時(shí)用甲醇溶劑作為對(duì)照記錄隱翅蟲(chóng)的行為。用秒表記錄隱翅蟲(chóng)的死亡時(shí)間，如果超過(guò)1 min，隱翅蟲(chóng)繼續(xù)爬行，則認(rèn)為提取液不能殺死隱翅蟲(chóng)（5 μL溶液1 min后通常已經(jīng)揮發(fā)完）。所用隱翅蟲(chóng)為2018年7月從四川金陽(yáng)縣帶回昆明植物園進(jìn)行飼養(yǎng)的成熟個(gè)體（數(shù)量大約5 000頭，為金陽(yáng)縣白魔芋最主要的傳粉昆蟲(chóng)）。樣品加對(duì)照共計(jì)5個(gè)處理，每個(gè)處理用20只隱翅蟲(chóng)，重復(fù)3次。

上述研究中所有數(shù)據(jù)采用SAS 9.4進(jìn)行單因素方差分析并進(jìn)行LSD多重比較，同時(shí)采用Origin 8.0對(duì)所有數(shù)據(jù)進(jìn)行作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 白魔芋花序各部位草酸鈣晶體的含量及分布

白魔芋花序各部位草酸鈣晶體的含量見(jiàn)表1。由表1可知，雌蕊子房中所含草酸鈣晶體的數(shù)量最多，平均每個(gè)視野約為188.4個(gè)，LSD多重比較的結(jié)果表明其含量顯著高于其他3個(gè)部位中草酸鈣晶體的含量，見(jiàn)圖1；其次含量高的部位是雄蕊區(qū)，平均含37.6個(gè)草酸鈣晶體。而佛焰苞苞片和附屬器中的草酸鈣晶體的平均含量分別為25.3個(gè)和29.7個(gè)，多重比較分析表明雄蕊區(qū)、佛焰苞苞片與附屬器三者之間的草酸鈣晶體含量并無(wú)顯著差異；花序各部位中草酸鈣含量最低是不育區(qū)，平均僅11.8個(gè)，與雌雄蕊區(qū)均存在顯著性差異。草酸鈣晶體的形狀主要有2種，存在一定的大小差異，長(zhǎng)針晶80～120 μm，短簇晶胞針晶長(zhǎng)度 30～50 μm（圖1）。

表1 白魔芋花序各部分草酸鈣晶體的含量Table 1 The content of calcium oxalate crystals in different sections of A. albus inflorescence 個(gè)/視野

圖1 草酸鈣在白魔芋花序不同部位的分布情況Fig. 1 Distribution of calcium oxalate crystals in different sections of A. albus inflorescence

圖1 白魔芋花序中草酸鈣晶體的分布情況Fig. 2 Distribution of calcium oxalate crystals in A. albus inflorescence

2.2 白魔芋花序中隱翅蟲(chóng)的數(shù)量及取食比例

本研究統(tǒng)計(jì)白魔芋花序中隱翅蟲(chóng)的數(shù)量顯示，花序中隱翅蟲(chóng)的平均數(shù)量為293只（n=50），其中最多可達(dá)1 300余只，隱翅蟲(chóng)數(shù)量在白魔芋花序中的分布情況見(jiàn)圖3。由圖3可知，花序中隱翅蟲(chóng)的數(shù)量通常為100～700只，數(shù)量在100只以下或700只以上的植株相對(duì)較少。花序中不同部位被隱翅蟲(chóng)取食的比例見(jiàn)圖4。由圖4可知，隱翅蟲(chóng)主要取食部位是不育區(qū)，取食比例達(dá)到100%；其次是附屬器（70%±30%，n=37），雄蕊區(qū)取食較少（23%±22%，n=37）而雌蕊區(qū)完全未被取食。多重分析結(jié)果表明4個(gè)部位被取食的比例均存在顯著性的差異（P＜0.05）。

圖3 白魔芋花序中隱翅蟲(chóng)數(shù)量的分布情況Fig. 3 Distribution of the amount of rove beetles in the inflorescence of A. albus

圖4 白魔芋花序被隱翅蟲(chóng)取食的不同比例Fig. 4 Different proportion of the inflorescences of A. albus consumed by rove beetles

2.3 花序各部位甲醇提取物毒殺隱翅蟲(chóng)的效果

采用白魔芋花序4個(gè)部分60%濃度的甲醇提取物觸殺白魔芋有效傳粉者隱翅蟲(chóng)的結(jié)果見(jiàn)表2。由表2可知，附屬器、雄蕊區(qū)、不育區(qū)及對(duì)照4個(gè)處理1分鐘內(nèi)均不能殺死隱翅蟲(chóng)，而雌蕊區(qū)的甲醇提取物對(duì)隱翅蟲(chóng)具有明顯的毒殺效果，隱翅蟲(chóng)平均在14.5 s的時(shí)間范圍內(nèi)死亡。

表2 花序各部位甲醇提取物毒殺隱翅蟲(chóng)的效果比較Table 2 Comparison of kill ability of methanol extracts from different sections of A. albus inflorescence to rove beetles

3 結(jié)論與討論

天南星科植物與其傳粉者之間通常存在著互惠互利的作用關(guān)系，天南星科通過(guò)提供熱量、食物或者產(chǎn)卵地吸引傳粉昆蟲(chóng)訪(fǎng)花并達(dá)到為其傳粉的目的[17]。通過(guò)調(diào)查發(fā)現(xiàn)白魔芋在其盛花期時(shí)，花序中存在著大量的隱翅蟲(chóng)，隱翅蟲(chóng)在花序中主要行為是取食。統(tǒng)計(jì)隱翅蟲(chóng)對(duì)白魔芋花序不同部位的取食結(jié)果表明，隱翅蟲(chóng)主要取食的部位是不育區(qū)，取食比例通常達(dá)到100%，其次是附屬器，當(dāng)花序中隱翅蟲(chóng)數(shù)量過(guò)多而不育區(qū)作為食物不足時(shí)，隱翅蟲(chóng)會(huì)轉(zhuǎn)而取食附屬器（70%±30%，n=37）和一部分雄蕊區(qū)（23%±22%，n=37），但完全不會(huì)取食雌蕊區(qū)，這種情況在天南星科其他植物中也同樣存在[18]。

本研究通過(guò)比較白魔芋花序不同部位中草酸鈣晶體含量的差異發(fā)現(xiàn)，其雌蕊區(qū)草酸鈣含量最高（188.4），而雄蕊區(qū)中草酸鈣晶體的含量顯著少于雌蕊。但雄蕊區(qū)草酸鈣含量和附屬器及佛焰苞苞片中的含量并無(wú)顯著差異。考慮到白魔芋花序中雌蕊數(shù)量較少，通常為20～60個(gè)，而雄蕊數(shù)量在200個(gè)以上，花粉數(shù)量更是多達(dá)幾十萬(wàn)個(gè)[15]，推測(cè)是否是過(guò)多的花粉也是傳粉隱翅蟲(chóng)的傳粉回報(bào)，因此沒(méi)有太強(qiáng)的防御物質(zhì)。畢竟傳粉昆蟲(chóng)取食花粉并不會(huì)像取食胚珠那樣對(duì)植物的繁殖產(chǎn)生明顯影響。此外，投資是需要代價(jià)的，植物只需要在最需要保護(hù)的部位投資最多的防御物質(zhì)，就能保護(hù)植物正常的繁殖過(guò)程。就整個(gè)花序而言，各個(gè)部分均含有草酸鈣晶體，其中佛焰苞苞片可以保護(hù)花序展開(kāi)前不受昆蟲(chóng)的干擾、雄蕊中的草酸鈣晶體可以在其散粉前避免被取食掉所有花粉、附屬器是天南星科植物特有的結(jié)構(gòu)，也需要受到一定的保護(hù)作用（通常在傳粉過(guò)程中扮演著氣味散發(fā)和溫度升高的作用[19]）。花序中草酸鈣晶體含量最少的部位是不育區(qū)（退化雄蕊），該部位通常是天南星科植物提供給傳粉昆蟲(chóng)的食物報(bào)酬，因此保護(hù)需求最低。植物由于附著生長(zhǎng)不能運(yùn)動(dòng)，而只能通過(guò)物理防御或化學(xué)防御以防止被昆蟲(chóng)取食，在化學(xué)防御中草酸鈣晶體通常扮演著重要的作用。Coté[10]研究21種天南星科植物也發(fā)現(xiàn)在重要的胚珠和花粉部分都有高含量的草酸鈣晶體以保護(hù)該部位避免被昆蟲(chóng)取食，而退化雄蕊在不同種之間草酸鈣晶體含量差異較大，其作用尚不明確。天南星科植物草酸鈣在花序不同部位的結(jié)構(gòu)組成變化及其不均勻分布的防御功能值得開(kāi)展進(jìn)一步的研究。

此外，為了驗(yàn)證花器官中甲醇提取物對(duì)隱刺蟲(chóng)的毒殺作用，采用花序各部位的甲醇提取物直接接觸性毒殺白魔芋的傳粉昆蟲(chóng)（隱翅蟲(chóng)），結(jié)果發(fā)現(xiàn)草酸鈣晶體含量最高的雌蕊提取物能快速殺死隱翅蟲(chóng)。表明草酸鈣晶體單獨(dú)或與其他防御成分一起對(duì)隱翅蟲(chóng)具有較強(qiáng)的毒性。以前的研究發(fā)現(xiàn)草酸鈣晶體的形態(tài)特征可以起到防御作用。如Tragia ramosa表明覆蓋由伸長(zhǎng)的刺細(xì)胞構(gòu)成的蟄毛，細(xì)胞內(nèi)含有大量草酸鈣針狀晶體，晶體側(cè)緣形成溝槽。一旦動(dòng)物碰到蟄毛會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞破裂，針狀晶體會(huì)刺破動(dòng)物的真皮，而毒素沿著晶體表面的溝槽流到傷口會(huì)引起皮膚的刺痛感[6]。而Riuz等[20]對(duì)百合科植物葉片中草酸鈣含量與動(dòng)物的攝食量進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)較高的晶體含量與攝食減少之間存在明顯相關(guān)性。上述研究均揭示草酸鈣晶體的防御功能。

在植物的防御選擇中，草酸鈣晶體的防御過(guò)程是普遍的進(jìn)化策略。一方面，草酸鈣晶體可以通過(guò)本身的形態(tài)特征和數(shù)量來(lái)對(duì)取食的動(dòng)物造成物理傷害；另一方面，在晶體周?chē)€存在毒性蛋白[21]或者其他毒素物質(zhì)[22]，對(duì)草食動(dòng)物、嚙齒類(lèi)動(dòng)物、真菌和昆蟲(chóng)也能起到防御作用[23]。本研究通過(guò)比較白魔芋花序不同部位草酸鈣晶體的含量揭示了植物可能夠通過(guò)草酸鈣晶體的含量差異來(lái)選擇性地保護(hù)其繁殖器官。