藍莓根際土壤真菌多樣性及根腐病拮抗菌的篩選

侯 瑞 王永燦 徐芳玲

( 貴州大學林學院，貴州 貴陽 550025)

藍莓（Vaccniumsp.）為杜鵑花科（Ericaceae）越桔屬（Vaccinium）多年生常綠或落葉灌木，具有很高的經濟價值[1]。由麗赤殼屬（Calonectria）、鐮孢屬（Fusarium）真菌引起的藍莓根腐病是藍莓主產區的重要病害。病原菌通過土壤進行傳播，侵染藍莓后可導致全株死亡[2-3]。貴州省藍莓根腐病由尖鐮孢菌（F. oxysporum）引起[4]，主要依靠傳統的化學防治，對藍莓果實品質會造成一定影響。因此，尋找環境中有益微生物是目前防治藍莓根腐病的發展方向[5-6]。

土壤真菌多樣性對植物的生長以及生態系統平衡等方面都起著重要作用[7-8]，植物根際土壤真菌多樣性改變，會影響植物的抗病性[9]。不同植物根際真菌土壤間差異較大[10-11]，目前已有較多的根際土壤真菌用于生物防治，防治效果優于化學試劑[12-13]。本研究對藍莓根際土壤進行分離培養，分析其多樣性，同時篩選藍莓根腐病拮抗真菌，為藍莓根腐病生物防治提供參考。

1 材料與方法

1.1 土壤樣品采集

于2017年4—7月，選擇貴陽麻江縣藍莓種植基地（東經 107°43′07″、北緯 26°25′49″）藍莓發病區附近健康藍莓植株，利用抖根法獲得根際土壤樣品，該基地藍莓根腐病發生率為18.5%左右。根際土壤樣品沿等高線分別設置5個樣地（5 m×5 m），在各樣方隨機選擇8株土壤樣品采集[14]。土壤樣品裝入無菌袋，便攜式低溫保溫箱中帶回實驗室，冰箱低溫保存（4 ℃）。

1.2 根際土壤真菌的分離培養

1.2.1 供試培養基

藍莓根際土壤真菌的分離和純化采用馬鈴薯葡萄糖培養基（PDA）、察氏培養基（Czapek）、馬丁氏培養基（Martin）和孟加拉紅培養基（PDAm）。

1.2.2 土壤真菌的分離培養

5個樣地采集到的根際土壤等量混合作為供試土壤。采用平板稀釋法，將土壤樣品稀釋至10-2倍，靜置5 min后選取200 μL上清液在PDA、Czapek、Martin和PDAm中進行涂布，每種培養基設置10個重復。利用菌絲末端挑取法，分別挑取4種不同平板培養基中生長形態差異典型[15-16]的真菌菌株轉接至PDA，28 ℃恒溫培養箱（黑龍江東拓儀器有限公司，中國）培養，純化3～5次。

1.3 真菌鑒定

1.3.1 土壤真菌的鑒定

使用CTAB提取法，并參考侯瑞[17]的方法提取土壤真菌DNA。利用真菌鑒定通用擴增引物ITS1和ITS4，土壤真菌菌株rDNA -ITS區段的PCR擴增、產物純化參考王娜等[10]的方法，PCR擴增產物直接送測試公司切膠、純化和測序。所有土壤真菌的測序片段修正后，利用NCBI數據庫中BLASTN對測序序列進行對比分析。

根際土壤中每克干土中的真菌數量=菌落平均數×稀釋倍數/干土質量(g)。按公式（1）～（3）計算Shannon-Wiener真菌多樣性指數（H）、Pielou真菌均勻度指數（J）和Margalef豐富度指數（M）[18-19]。

式中：Pi為第i種的多度比例，S為屬i所在根際土壤中屬的數目，N為菌落數量之和。

1.3.2 藍莓拮抗真菌鑒定

采用平板對峙法測定各分離菌株對藍莓根腐病菌尖鐮孢菌（貴州大學農學院植物病理學實驗室提供）的抑菌活性。在無菌條件下，利用打孔器（6 mm）選取活化于PDA中的分離菌株和病原菌邊緣新鮮菌絲，分別接種于90 mm PDA兩側，使得分離菌株和病原菌接種點直徑相距50 mm，只在平板右側接種病原菌為對照（CK）。設置3個重復，放置于28 ℃恒溫培養箱（RH=40%）中培養7 d。測量CK病原菌菌落直徑和處理組病原菌菌落直徑，按公式（4）計算抑制率。

1.4 數據分析

根際土壤真菌多樣性指數和抑菌率測定的數據采用Excel 2010和DPS v17.10軟件進行統計和分析。

2 結果與分析

2.1 根際土壤真菌種類鑒定和分離頻率

由表1可知，利用平板稀釋法共分離獲得的菌落形態具有明顯差異的真菌80株。通過rDNAITS序列進行比對分析后發現，80株真菌分別隸屬6個綱6個目11屬51種，這些菌株與NCBI數據庫中的已知真菌rDNA-ITS序列相似性都達到了99%和100%，同源性非常高。在分離得到的80株真菌中，青霉屬（Penicillium）14種、木霉屬（Trichoderma）13種、鐮孢屬（Fusarium）7種、孢球托霉屬（Gongronella）5種，籃狀菌屬（Talaromyces）3種、擬青霉屬（Purpureocillium）3種、毛殼屬（Chaetomium）2種，毛霉屬（Mucor）2種、曲霉屬（Aspergillus）、粘帚霉屬（Gliocladium）、擬小球殼孢屬（Microsphaeropsis）各1種。其中，青霉屬分離得到的菌株數量最多，為藍莓根際土壤真菌群落的優勢屬，占菌株總數的27.50%。子囊菌門中，木霉屬和鐮孢屬次之，均占菌株總數的16.25%。籃狀菌屬、毛殼屬均占菌株總數的5.00%。粘帚霉屬、擬青霉屬和曲霉屬分離得到菌株數相同，各占總菌株數的3.75%。小球殼孢屬只分離得到1株，占總菌株數的1.25%。接合菌門的孢球托霉屬分離得到13株，同樣為優勢屬，分離頻率為16.25%。毛霉屬真菌分離得到2株，分離頻率為2.50%。

表1 分離藍莓根際土壤真菌的rDNA-ITS序列相似性分析Table 1 Similarity analysis of partial rDNA-ITS sequences from rhizosphere soil fungi isolates from Vaccnium sp.

續表1

續表1

由圖1可知，不同培養基分離得到的真菌數量和真菌屬的數量也不同。其中，PDA和PDAm分離得到的真菌數量為26株和19株，真菌屬的數量最多，共8屬。Czapek次之，分離到19株真菌、6個真菌屬的類群。Martin分離得到16株真菌、5個真菌屬，但其分離得到接合菌門孢球托霉屬的真菌數量最多，其余培養基均是青霉屬或木霉屬的真菌數量最多。

圖1 藍莓根際土壤真菌菌群的分離頻率Fig. 1 The isolation frequency of rhizosphere soil fungi from Vaccnium sp.

2.2 根際土壤真菌的多樣性分析

由表2可知，藍莓植株根際土壤中的真菌數量總數為2.96×105cfu/g，H為2.046 1，J為2.282 0，M為0.853 3。

表2 藍莓根際土壤真菌多樣指數Table 2 The diversity index of rhizosphere soil fungi of Vaccnium sp.

2.3 根際土壤真菌對藍莓根腐病病原菌的抑制效果

由表3可知，TP1、TPM1、TM1、TC1等80個菌株與藍莓根腐病病原菌在PDA中對峙培養7 d后，藍莓根腐病病原菌菌落生長直徑與CK直徑差異均顯著（P＜0.05）。其中，抑制率在50%以上的菌株有22株，抑制率在70%以上的有 8株，分別是 TP6、TP14、TP16、TPM3、TPM8、 TPM24、 TM11、 TM23。其 中 ，TPM8、TPM24和TM23均屬于日本曲霉（Aspergillus japonicas），TP6、TP14、TP16、TPM3、TM11 則為木霉屬真菌，棘孢木霉（Trichoderma asperellum）TM11明顯抑制病原菌的生長，抑制率達到79.66%，長枝木霉（Trichoderma longibrachiatum）TP6，木霉屬NECC40034TP14，蓋姆斯木霉（Trichoderma gamsii）TP16，擬康寧木霉（Trichoderma koningiopsis）TPM3的抑制率也均為70%以上。藍莓根腐病菌與6株土壤根際真菌對峙培養形成的菌落見圖2，根際土壤真菌均抑制了病菌生長。

表3 藍莓根際土壤真菌抑制效果Table 3 The inhibition effects of Vaccnium sp. rhizosphere soil fungi

續表3

圖1 藍莓根腐病菌與土壤根際真菌對峙培養形成的菌落Fig. 2 Colonies on dual-cultured plates between Fusarium oxysporum strain and rhizosphere soil fungi

3 結論與討論

有關藍莓根際土壤真菌研究的較少。雖然藍莓為栽培種植，但了解藍莓根際土壤真菌多樣性對其土壤真菌種群特性研究具有重要意義。本研究從藍莓根腐病發生區附近健康藍莓根際土壤中分離得到的真菌，主要屬于青霉屬（27.50%）、木霉屬（16.75%）、鐮孢屬（16.75%）、孢球托霉屬（16.75%），籃狀菌屬（5%）、曲霉屬（3.25%）和小球殼孢屬（1.25%）等，與研究的其他物種根際土壤真菌相近[20-21]。藍莓根際土壤真菌的優勢屬與其他物種根際土壤的優勢種群相似，但在種群組成上存在一定差異，可能是由于藍莓菌根菌的存在所致[22]。

藍莓根際土壤中分離獲得的80株真菌對藍莓根腐病病菌抑制效果，抑制率在70% 以上的有8株，其中，3株均屬于曲霉屬，木霉屬有5株。曲霉屬真菌主要為工業用途，用于生防的研究并不多，但叢銘等[23]發現黑曲霉可以防治煙草青枯病。木霉屬真菌主要用作生防，5株木霉分別鑒定為棘孢木霉、長枝木霉、蓋姆斯木霉，擬康寧木霉和未知木霉屬，已知的4種木霉都曾被報道用于生防，對三七灰霉病菌（Botrytis cinerea），花生菌核菌（Sclerotinia sclerotiorum），立枯絲核菌（Rhizoctonia solani）和尖鐮孢菌有很好的防治效果[24-27]。其次，本研究還發現金色毛殼屬（Chaetomium aureum）TPM21、TP10、TP13菌株可以產生紅色素，因為其生長速度較慢，所以抑制率并不高，但其產生紅色素后，根腐病病原菌生長會被抑制，與滕懷麗[28]研究金色毛殼真菌具有抑菌活性相似，后期會做進一步研究。本研究通過對藍莓根腐區附近健康藍莓根際土壤真菌的分離、鑒定和篩選，獲得了藍莓根際生防真菌，但生防真菌如何大量定殖于藍莓根部，使植株免遭病原菌侵染危害，是后期研究需要解決的問題。