互葉白千層粵北引種資源的表型評價

謝佩吾 曾慶團 白青松 陳一群 陳杰連 連輝明 何波祥 張 謙

( 1. 廣東省林業科學研究院廣東省森林培育與保護利用重點實驗室，廣東 廣州 510520；2. 廣東省天井山林場，廣東 韶關 512726)

互葉白千層（Melaleuca alternifolia），又名茶樹，原產于澳大利亞新南威爾士和昆士蘭，是桃金娘科（Myrtaceae）多年生木本植物[1-2]。因其葉片所含萜烯物質的不同，共分為6種化學型，其中3種為典型類型：4-松油醇型、1,8-桉葉油素型和異松油烯型，另外3種為雜合中間類型[2-3]。4-松油醇型精油價值最高，且3年生后每年可采收枝葉提取精油，開發潛力最大[4]。研究顯示，4-松油醇型茶樹油具有顯著的抗真菌和抗細菌功效，并且對皮膚腫瘤具有明顯抑制作用，已廣泛用于生產個人護理產品，并在室內清潔、農業生產和醫療等方面開發了系列產品[5-6]。

互葉白千層種源與單株間的精油含量和品質存在顯著差異[7]，選育葉片中4-松油醇含量高且1,8-桉葉油素和檸檬烯含量低的品系，是當前育種工作的主要目標[2]。澳大利亞于1993年啟動了互葉白千層良種選育研究，歷經4輪選育，將精油產量由最初的148 kg/hm2提高到250 kg/hm2[4,8]。精油中4-松油醇占比穩定在35.0%以上，最高可達48.0%，1,8-桉葉油素占比控制在10.0%以內，檸檬烯含量保持在安全水平的0.5%～1.5%[9]。

我國于20世紀90年開始互葉白千層引種試驗，目前已在廣東、廣西、福建等地建立了規模化種植基地，引種資源生長性狀以及精油產量與品質多呈現出良好的適應性[10-12]。鑒于種植苗木多為澳大利亞引進的商業化種子苗，其種質資源遺傳背景與遺傳豐富度不清晰，用于良種選育的潛力不明確，加上我國對互葉白千層選育研究的投入長期不足，致使我國在新種質創制研究領域遠落后于澳大利亞。近年來，受澳大利亞優質資源出口限制，我國互葉白千層種質資源面臨掣肘，林地經濟效益不能實現最大化，嚴重阻礙了我國茶樹油產業發展，迫切需要系統開展良種選育研究，培育一批具有自主知識產權的優異新品系，沖破國外對優質資源的壟斷和限制。為此，本研究以從澳大利亞引進的4-松油醇型互葉白千層種子園混合子代為材料，系統開展生長性狀、精油含量與有效成分的精準分析，從中篩選出一批表型優異的單株，為今后新種質創制研究儲備戰略遺傳資源。

1 材料與方法

1.1 研究對象

選擇2012年12月從澳大利亞茶樹油產業協會（ATTIA）引進的一批4-松油醇型互葉白千層種子園混合種子[4]，并于2013年2月人工播種育苗，共計繁育苗木10萬株。2014年3月，采用隨機混交種植的方式，在廣東省韶關市乳源瑤族自治縣太陽鎮營建互葉白千層人工林，種植密度為6 000株/hm2，最終建成互葉白千層的粵北資源林。試驗地海拔280～410 m，地勢較平坦，坡度小于3°。土壤為花崗巖風化的紅壤，土層厚超過90 cm，腐殖土超過12 cm。年平均氣溫15.8 °C，年降雨量1 170.5 mm，年日照時數為2 002 h。

1.2 待測單株選擇

鑒于試驗林譜系不清晰，課題組模仿天然林選優的方法[13-14]，于2017年12月采用隨機選擇的方式，在4年生試驗林中選擇立地條件基本一致的區域挑選211株待測單株。為了提高選擇群體的遺傳豐富度，兩兩入選單株之間的距離不小于25 m。

1.3 指標測定

1.3.1 單株生物量測定

選定待測單株后，測定樹高（m）、胸徑（cm）、縱向和橫向冠層寬（m），并依據縱向和橫向冠層寬計算樹冠截面積（m2），計算公式為：

1.3.2 單株精油提煉

在待測單株樹冠西側向下1/2處采集同等成熟度的枝葉，用塑料袋密封后帶回實驗室，4 °C冰箱保存。鮮葉精油提煉采用隔水蒸餾法[15]。首先將采集的枝葉進行分揀，剔除直徑2 mm以上的枝條，保留新鮮葉片，精準稱量700 g，裝入10 L自制圓柱狀蒸餾鋼瓶，鮮葉與鋼瓶底部保留2 L隔離區，滿足隔水蒸餾鮮葉精油的需要；隨后在蒸餾鋼瓶上安裝揮發油測定器和冷凝管，加熱蒸餾到揮發油不再增加時，停止加熱，冷卻到室溫；最后分離精油，稱量并計算鮮葉含油量（g/kg）。

與警察高校而言，獨立設課后的實驗教學學時數應有理有據，合理安排，尤其如犯罪現場勘查、痕跡檢驗、交通事故處置等實踐應用性強的專業課程，其實驗教學學時應調整為原總學時（原課堂理論教學學時與原教學實驗學時之和）的40～50%。沒有必須的實驗教學學時作保障，警察高校應用型專業人才培養目標就難以實現。

1.3.3 化學成分分析

依據全部測定單株鮮葉含油量，按從高到低排序，挑選含油量前166名的茶樹油為樣品，采用氣-質聯用法進行精油化學成分定性和定量分析。分析參照的標準為國際標準ISO4730—2017，組分含量用氣相色譜的面積歸一法確定[3]。另外，依據鮮葉含油量與精油中4-松油醇占比，計算鮮葉4-松油醇含量（g/kg）。

1.4 數據分析

選用Excel 2016整理原始數據，采用SAS 9.4軟件進行數據統計分析。計算生長性狀、鮮葉含油量和主要化學成分的均值、中位數、標準誤、最大值、最小值和變異系數[13]。采用主成分分析法，計算樹高、胸徑、樹冠截面積、鮮葉含油量、4-松油醇占比共5個性狀的綜合變量及分量[13]，并求出權重[16]。優良單株篩選采用綜合選擇指數法[14]，計算公式如下：

式中：IC為綜合選擇指數；為了避免選擇結果受目標性狀觀測值數量級的影響，5個性狀采用群體校對均值與單株觀測值比值的百分數；字母a，b，c，d和e為5個性狀的權重。

2 結果與分析

2.1 生長性狀與化學成分分析

圖1列出了互葉白千層測定單株9個目標性狀的統計值。在生長量方面，4年生單株的平均樹高、胸徑和樹冠截面積分別為5.92 m、7.09 cm和2.07 m2，其變異系數分別達到15.38%、16.66%和44.74%，說明互葉白千層測定單株生長性狀具有中等和較高程度的遺傳分化，具有可觀的遺傳選育潛力。

圖1 互葉白千層測定群體9個性狀的數據分布Fig. 1 Data distribution graph of 9 traits for studied M. alternifolia population

測定鮮葉精油含量發現，211株測定樣品的鮮葉平均含油量為10.27 g/kg，其中位數為10.21 g/kg，鮮葉最低和最高含油量分別為5.01 g/kg和17.01 g/kg，變異系數達到18.44%，說明引種資源的鮮葉含油量亦具有較豐富的遺傳分化。

精油化學成分分析結果顯示，各單株精油中1,8-桉葉油素、異松油烯、4-松油醇和檸檬烯占比差異較大，表明不同單株精油的有效成分含量與品質存在明顯差異。主要化學成分4-松油醇占比較高，達到29.90%～48.67%，占比均值與中位數分別為40.26%和40.56%，說明絕大部分單株4-松油醇占比達到國際標準ISO4730—2017[9]規定的35%～48%的要求；單株間4-松油醇占比變異系數較低，僅為8.81%，說明單株間4-松油醇占比穩定在一個較高水平。

精油（茶樹油）品質方面，1,8-桉葉油素占比平均值為3.00%，但單株間差異明顯，在0.19%～9.19%之間，變異系數高達50.80%；對比國際標準發現，全部單株的1,8-桉葉油素占比處于≤10%的合格范圍。檸檬烯占比相對集中，在1.12%～2.08%之間，變異系數為11.40%，其平均值與中位數分別為1.54%和1.51%；參照國際標準0.5%～1.5%發現，94株（56.62%）檸檬烯占比未達標。異松油烯占比分布較為集中，在2.86%～5.01%之間，變異系數僅為9.14%，平均值為3.74%，對比國家標準1.5%～5.0%發現，僅有單株T075的占比（5.01%）未達規定要求，剩余165株全部達標。

2.2 化學類型分析

4-松油醇、1,8-桉葉油素和異松油烯是劃分互葉白千層精油類型的3種決定性化學成分[3]。為了明確本試驗中互葉白千層的化學類型，構建了166株單株3種決定性化學成分占比的三維分布圖（圖2），發現157株（94.58%）的精油符合“化學1型”（Chemotype 1 ‘Type'）要求，屬于4-松油醇型，即4-松油醇占比在34%～54%之間，1,8-桉葉油素占比在0～8%之間，異松油烯占比在1%～5%之間。剩余9株（5.42%）屬于雜合類型，無法劃分成6種主要化學類型中的任何一種，其4-松油醇占比低于34%（為29.90%～33.82%），其中單株T075的異松油烯占比超過5%（為5.01%），單株T207的1,8-桉葉油素占比超過8%（為9.19%）。

2.3 相關性分析

表1列出了互葉白千層測定群體9個性狀間的Pearson相關系數。生長性狀方面，樹高、胸徑和樹冠截面積相互間具有極顯著正相關關系，相關系數為0.334～0.611。鮮葉含油量與3個生長性狀間均無明顯相關性，與精油中1,8-桉葉油素、異松油烯和4-松油烯占比亦無明顯相關性，但與檸檬烯有顯著負相關關系（R2=-0.178）。精油核心有效成分4-松油醇與樹高存在極顯著正相關性（R2=0.219），與胸徑、樹冠截面積和鮮葉含油量均無明顯關系，與精油中1,8-桉葉油素、異松油烯和檸檬烯均存在極顯著負相關關系，相關系數為-0.807～-0.227。鮮葉4-松油醇含量取決于鮮葉含油量和4-松油醇占比，所以與二者均具有極顯著正相關關系，相關系數分別高達0.900和0.531；鮮葉4-松油醇含量與3個生長性狀均呈現負相關性，其中與胸徑的負相關性達到顯著水平（R2=-0.170）；另外，鮮葉4-松油醇含量與精油中1,8-桉葉油素、異松油烯和檸檬烯均存在顯著或極顯著負相關關系，相關系數為-0.468～-0.190。

表1 互葉白千層測定群體9個性狀Pearson相關分析Table 1 Pearson correlations of 9 traits for testing M. alternifolia population

2.4 主成分分析及性狀權重測算

為了鑒別互葉白千層最關鍵的表型性狀，構建優良單株的選擇指標體系，并測算各性狀的權重，本研究對影響單位面積4-松油醇產量的5個性狀進行主成分分析[13,16]。從表2可知，前4個主成分分別解釋了總變異的40.44%、22.31%、16.65%和12.97%，累計解釋了總變異中的92.38%。第1個主成分主要貢獻性狀為3個生長性狀，第2個主成分主要貢獻性狀為鮮葉含油量和精油中的4-松油醇占比。依據累計貢獻率超過85%的標準，選擇前4個主成分及相應分量計算各性狀選擇權重，構建優良單株評選公式，根據公式（2）測算出綜合選擇指數，其中a為0.219，b為0.286，c為0.107，d為0.310，e為0.070。

表2 互葉白千層測定單株5個主要性狀主成分分析Table 2 Principle component analysis of 5 main traits for testing M. alternifolia individuals

2.5 優良單株選擇

依據優良單株評選公式，測算166株測試單株的綜合選擇指數IC，從高到低排序，按照15%入選率評選生物量、鮮葉含油量和4-松油醇占比綜合表現優異的單株。表3列出了互葉白千層25株（15%）最優單株的IC值，優良單株IC值分布在110.55～130.63之間，明顯大于全體平均指數值100。同時，按照國際標準ISO4730—2017要求，分析了影響精油品質的化學成分占比，發現25株測試單株1,8-桉葉油素占比均小于6%，異松油烯占比均在1.5%～5.0%之間，即此2種化學成分占比均達到了國際安全標準（數據未列出）。但分析檸檬烯占比發現，25株中僅有12株達到國際標準，即占比在0.5%～1.5%之間。這12株符合國際標準的單株依次為：T129、T127、T158、T137、T176、T192、T201、T152、T211、T183、T159 和 T156。

表3 互葉白千層15%最優單株綜合選擇指數Table 3 Composite selection indices for top 15% M. alternifolia individuals

進一步分析發現，25株優良單株5個性狀平均值分別為7.00 m、8.35 cm、3.13 m2、11.80 g/kg、41.81%，其群體現實增益分別為14.50%、15.20%、46.21%、11.66%和3.85%；12株符合國際安全標準單株的性狀均值分別為7.15 m、8.42 cm、3.16 m2、11.95 g/kg和42.92%，其群體現實增益分別為16.96%、 16.07%、 47.63%、 13.08%和 6.61%（表4）。

表4 互葉白千層優良單株現實增益分析Table 4 Realistic gain for selected superior individuals of M. alternifolia

3 結論與討論

1）本研究系統分析了粵北互葉白千層引種資源中211株單株的9個重要經濟性狀，綜合評選出12株生長迅速、鮮葉含油量高、精油中4-松油醇占比大、精油品質達到國際標準ISO4730—2017要求的單株，為發展互葉白千層無性系資源林提供了重要物質保障。我國20世紀90年代引進互葉白千層后，主要栽種在廣東惠州和肇慶、廣西平南和欽州等南亞熱帶地區[10-12]。本研究將互葉白千層引種到粵北中亞熱帶地區，并通過生長性狀測定與精油化學成分分析，證實其具有良好的生長適應性，且精油含量與廣西等地同類研究的9.1～13.5 g/kg近似[10,12]，這為拓寬我國互葉白千層生產區域提供了重要的基礎數據。

2）引種資源目標性狀遺傳變異程度與選育潛力緊密相關[13,17]。本研究發現，互葉白千層樹高和胸徑具有中等水平的遺傳分化，影響鮮葉產量的樹冠截面積分化非常明顯，變異系數達44.74%，為選育高生物量的無性系奠定了基礎。在精油產量方面，重要性狀鮮葉含油量與鮮葉4-松油醇含量均呈現出較高的遺傳分化，且4-松油醇占比穩定在較高水平（變異系數僅為8.81%），為選育高產、穩產、優質互葉白千層單株提供了保障。

3）互葉白千層精油化學類型及其品質與經濟價值緊密相關[4]。當前茶樹油產業發展的關鍵是選育4-松油醇型優良品系，即選育4-松油醇占比高、1,8-桉葉油素和檸檬烯占比低的品系[7-8]。本研究分析發現，粵北引種群體中94.58%為4-松油醇型，5.42%為雜合類型。雜合類型的產生可能與種子園天然授粉過程中參雜其他類型花粉有關，這要求種植業主須進一步優化種植品系。精油品質分析發現，1.20%的單株異松油烯或1,8-桉葉油素超標，56.62%的單株檸檬烯占比超標，進一步說明粵北發展互葉白千層種植業需優化遺傳材料的品質。為了規避有性繁殖過程中的遺傳分化，建議選種高產、穩產、優質的互葉白千層組培苗[11,18]，發展無性系原料林。

4）選育互葉白千層優良單株，一個關鍵是選定影響單位面積4-松油醇產量與品質的重要經濟性狀，另一個關鍵是科學確定各經濟性狀的權重[16]。本研究在構建優良單株評選指標體系過程中，綜合考慮了單株生物量、鮮葉含油量、精油中4-松油醇占比、精油品質關鍵成分占比等因素，并采用主成分分析法科學確定各經濟性狀的權重。影響生物量的3個生長性狀、鮮葉含油量和4-松油醇占比被選為正向選擇經濟性狀，納入綜合選擇指數計算公式；影響精油品質的1,8-桉葉油素、異松油烯和檸檬烯占比不直接決定4-松油醇產量，不宜作為正向選擇性狀，故未納入綜合選擇指數計算公式，但被選為評選體系的逆向淘汰性狀。經濟性狀權重分析發現，4-松油醇占比權重偏低，僅0.070，這可能與全體測試單株精油中4-松油醇占比較高且變異幅度不大有關，亦再次說明測試單株的4-松油醇占比穩定在較高水平。

5）鑒于粵北引種資源的遺傳背景不清楚，其雜交親本、組合配置、雜交數量不清晰，因而不能確定各單株表型性狀產生分化的遺傳機制。因此，有必要采用細胞學、生理生化以及分子生物學等方法，深入探索粵北互葉白千層的遺傳背景、遺傳變異規律及其產生的調控機理，同時系統開展基因型與環境互作研究，為各發展區域選育適宜的優良品系。