繡球菌對腫瘤細胞的抑制作用

張作法，王富根，陳建飛，呂國英*

(1.浙江省農業科學院 園藝研究所，浙江 杭州 310021； 2.杭州千島湖興寶菇業專業合作社，浙江 淳安 311701；3.衢州菇樂農業開發有限公司，浙江 衢州 324000)

繡球菌(Sparassiscrispa)屬菌物界，擔子菌門，傘菌綱，多孔菌目，繡球菌科，也叫花椰菜菌、繡球蘑、地花蘑等。幼嫩的繡球菌子實體潔白細嫩、鮮美可口，野生分布較廣，我國主要分布在黑龍江、吉林、西藏、云南、河北、福建、廣東等林區中的云杉、冷杉或松林及混交林中；國外主要分布在日本、英國、美國、加拿大和澳大利亞等地。20世紀90年代繡球菌人工栽培在日本首獲成功，被譽為夢幻神奇之菇，并進入商業性生產。

近年來，隨著繡球菌人工栽培的成功，全球掀起了繡球菌的開發、應用和研究熱潮，不少與其相關的產品已經面世。我國對繡球菌的研究起步較晚，僅涉及繡球菌生物學特性、保鮮和人工栽培技術方面的研究[1-3]。經研究發現，繡球菌具有抗腫瘤[4-5]、抗氧化[6]、免疫調節[7]、促進傷口愈合[8]等廣泛的藥理活性。然而，繡球菌的諸多研究特別是開發應用方面尚屬空白。本研究比較了繡球菌水提物對4種常見的腫瘤細胞(人肺癌A549、人胃癌SGC-7901、人胰腺癌PANC-1和人肝癌HepG2)的抑制作用，以期為繡球菌產品的開發提供參考和理論依據。

1 材料與方法

1.1 試劑和耗材

DMEM高糖培養基(美國Hyclone公司，批號AD20616263)，DMEM基礎培養基(美國gibco公司，批號8118196)，1640培養基(美國gibco公司，批號8117177)，胎牛血清(杭州四季青公司，批號18040302)，胰酶(美國gibco公司，批號1953147)，MTT(ST316)，PBS(C0221A)和DMSO (ST038)均購于碧云天生物技術公司。

1.2 瘤株

人肝癌細胞HepG2、人胃癌細胞SGC-7901、人胰腺癌細胞PANC-1、人肺癌細胞A549購于浙江省醫學科學院。

1.3 水提物

水提物制備：稱取適量干燥繡球菌粉，置于圓底燒瓶中，加入50倍體積的蒸餾水，置于90 ℃的水浴鍋內浸提3 h，離心后，合并提取液。并將提取液經旋轉蒸發器濃縮至200 mg·mL-1，高溫高壓滅菌后，4 ℃保存備用。

1.4 儀器

BS124S電子天平，美國賽多利斯公司；DKB-600A型電熱恒溫水槽，上海森信實驗儀器公司；RE-52AA旋轉蒸發器，上海亞榮生化儀器廠；TDL-40C低速大容量離心機，上海安亭科學儀器廠；Thermo 3111培養箱，美國賽默飛公司；Synergy-2 SLFPA全波長多功能酶標儀，美國伯騰公司；DMI3000B倒置顯微鏡，美國萊卡公司。

1.5 實驗方法

選擇4種人腫瘤細胞(人胰腺癌細胞PANC-1、人胃癌細胞SGC-7901、人肝癌細胞株HepG2、人肺癌細胞A549)，采用DMEM培養基或RPMI1640(含10%胎牛血清)培養，37 ℃、5% CO2條件下傳代培養。MTT法[9]檢測腫瘤細胞的存活率：調整細胞為5×104mL-1，100 μL·孔-1接種于96孔板中。設立空白組、正常對照組、系列不同濃度藥物組，每孔加入含藥物培養基100 μL，于37 ℃，5% CO2培養箱中分別培養24和48 h后，每孔加入MTT(5 mg·mL-1)20 μL繼續培養4 h。以移液槍小心吸去上清，每孔加入150 μL DMSO，室溫置于搖床10 min，于酶標儀490 nm測定D值，計算細胞增殖抑制率和半數抑制濃度(IC50)。增殖抑制率(%)=1-(D樣品-D空白)/(D對照-D空白)×100。同時倒置顯微鏡觀察細胞形態采用物鏡20×，拍照記錄各組細胞形態。

1.6 數據處理

數據采用SPSS 軟件進行分析，P<0.05為統計學上有顯著差異，樣本數n≥3。

2 結果與分析

繡球菌水提物在0～6.4 mg·mL-1劑量下24和48 h時對4種腫瘤細胞存活率的影響，MTT結果如表1、表2所示。24 h時，當繡球菌多糖濃度在1.2 mg·mL-1時人胃癌SGC-7901細胞存活率與人胰腺癌PANC-1細胞接近，隨著濃度升高對細胞增殖抑制作用增強，均強于人肝癌HepG2和人肺癌A549。48 h時，當繡球菌多糖濃度在0.4 mg·mL-1時，人胃癌SGC-7901與人胰腺癌PANC-1細胞存活率均與正常組有顯著性差異，隨著濃度升高對人胃癌SGC-7901細胞增殖抑制作用高于人胰腺癌PANC-1細胞。

表1 繡球菌水提物在24 h時對4種腫瘤細胞抑制率的影響 單位：%

注：*、**分別表示與空白對照相比，差異達顯著(P<0.05)、極顯著水平(P<0.01)。表2同。

表2 繡球菌水提物在48 h時對4種腫瘤細胞抑制率的影響 單位：%

隨著藥物濃度增加和作用時間延長，光鏡下觀察人肺癌A549和人胃癌SGC-7901細胞數量減少，皺縮，變圓，貼壁不緊密，部分脫落，形態損傷程度逐漸加深(圖1～4)。繡球菌水提物濃度在6.4 mg·mL-1時作用48 h，對人肝癌HepG2細胞抑制率約89%，人肺癌A549約32%，人胰腺癌PANC-1約68%，人胃癌SGC-7901約49%。48 h時，繡球菌多糖對人肺癌A549和人胃癌SGC-7901細胞的IC50分別為5.016和6.981 mg·mL-1。

可見在本實驗條件下，高濃度時，繡球菌水提物對4種腫瘤細胞增殖的抑制作用由強到弱依次表現為：人肺癌A549>人胃癌SGC-7901>人胰腺癌PANC-1>人肝癌HepG2；低濃度時，繡球菌多糖對人胃癌SGC-7901的抑制作用強于人肺癌A549細胞。

A～H依次表示0、0.4、0.8、1.2、1.6、2.4、3.2、6.4 mg·mL-1。圖2～4同。圖1 繡球菌水提物24 h對人胃癌細胞SGC-7901光鏡下形態的影響(200×)

圖2 繡球菌水提物48 h對人胃癌SGC-7901細胞光鏡下形態的影響(200×)

圖3 繡球菌水提物24 h對人肺癌A549細胞光鏡下形態的影響(200×)

圖4 繡球菌水提物48 h對人肺癌A549細胞光鏡下形態的影響(200×)

3 討論

惡性腫瘤是嚴重威脅人類生命健康的主要疾病之一，為全球人類死亡的第二大原因。目前藥物治療是腫瘤綜合治療的重要手段之一。從天然動植物或菌類中提取的天然活性物質是抗癌藥物的重要來源。MTT法是1983年Mosmann提出的用于快速測量細胞增殖、細胞活性及細胞毒性的方法，因其價格低廉、簡單靈敏而被廣泛用于抗腫瘤藥物篩選[10]。菌類食品的營養價值介于動物性食品和植物性食品之間，兼具動物食品的高蛋白和植物食品的低脂肪的優點。隨著社會的進步和國民生活水平的提高，人們對飲食的綠色、天然和保健功能的追求越來越高，綠色、天然、功能性菌類食品越來越受到消費者的青睞。

繡球菌香味怡人，口感鮮美，是國內外美食家公認的山珍美味。同時其營養、保健價值高，富含β-葡聚糖、腺嘌呤核苷、麥角固醇、超氧化物歧化酶等多重營養成分，因而具有強身健體、防癌抗癌的特殊功能，同時具有抗衰老、美容等功效，對高血壓、糖尿病等疾病的預防及改善有很大的作用，是一種藥食兼用的珍稀菌類。

葡聚糖是由葡萄糖單體聚合而成的多糖，分為α型和β型，α型葡聚糖作為機體能量的主要來源，不具備生物活性。β型葡聚糖是一種生物活性物質，具有廣泛的藥理活性。多糖是繡球菌中的主要活性物質，據日本食品分析中心報道，繡球菌中的β型葡聚糖含量達到43.6%，比靈芝和姬松茸高出3～4倍，其含量為菇類之最。

目前對于繡球菌的抗腫瘤作用已經進行了廣泛的研究，Hasegawa等[11]研究發現，繡球菌粉能夠顯著減小荷瘤S-180小鼠的肉瘤大小，且生命延長。Ohno等[12]對14例癌癥患者進行口服繡球菌粉臨床實驗，其中9例病人病情得到了緩解。Harada等[13]發現，繡球菌β-葡聚糖對肺癌、乳腺癌、胃癌等有明顯的抑制作用。Yamamoto等[14]發現，繡球菌多糖能夠有效抑制血管生成和轉移。同時有研究還表明，繡球菌多糖的抗腫瘤機制是刺激細胞因子的產生來對抗腫瘤[15]。宋文榮等[16]研究了繡球菌超細粉能夠通過改善機體免疫力和抗氧化作用來達到對H22荷瘤小鼠的抑制作用。于韋韋[17]發現，繡球菌多糖能通過線粒體凋亡通路誘導乳腺癌細胞凋亡，并通過誘導免疫因子的分泌實現對腫瘤細胞的抑制和殺傷。Rui等[18]研究表明，用繡球菌具有良好的抗腫瘤效果。Kim等[19]研究發現，繡球菌的葡聚糖能夠通過激活巨噬細胞和樹狀突細胞來提高抗腫瘤效果。

本實驗經MTT法檢測發現，繡球菌水提物對不同組織來源的腫瘤細胞均有一定的增殖抑制作用，其中對人肺癌A549細胞抑制作用最強，對人肝癌HepG2抑制作用最弱，表明其具有一定的組織選擇性。據測定，繡球菌中的β葡聚糖含量達到了40%以上，而水提物中以多糖類物質為主，考慮到β-葡聚糖卓越的藥理活性，所以水提物中的β-葡聚糖起到重要的作用。由于水提物成分復雜，具體起作用活性物質的鑒定及抗腫瘤的作用機理將是下一步研究的重點。