杭菊滅菌方式與再生植株體系的探討

孟肖，陳娜，程磊，姚潔

(亳州職業技術學院 藥學院，安徽 亳州 236800)

菊花來源于菊科植物菊(Chrysanthemummorifolium)的干燥頭狀花序。藥材按產地和加工方法不同，分為亳菊、滁菊、貢菊、杭菊、懷菊[1]。其中，杭菊主產于浙江，為我國藥茶兩用菊花，首載于明代《萬歷嘉善縣志》，距今約有400 a栽培歷史。其花瓣潔白如玉，花蕊黃如純金，為道地藥材“浙八味”之一，素有“西湖龍井，杭白貢菊”之美譽。杭菊繁殖過程中主要采用分根和扦插2種方式進行，長期的無性繁殖使得杭菊攜帶多種病菌，植株在生長過程中出現大面積的死亡，嚴重制約著杭菊的發展。傳統的繁殖方式已不能滿足急劇增長的市場需要，杭菊再生體系研究逐漸受到重視。再生體系的外植體多取自田間，表面上附著大量的微生物，因此，外植體滅菌成為組織培養的一大障礙。本文主要對杭菊組培過程中的滅菌方式進行研究，為后期杭菊再生體系的建立與組織快速繁殖技術提供一定理論依據。

1 材料與方法

1.1 供試材料

試驗于2017年3—6月在亳州職業技術學院組織培養室進行。杭菊材料采自亳州職業技術學院藥用植物園，經程磊副教授鑒定為杭菊(ChrysanthemummorifoliumRamat.)。選生長健壯無病蟲害的杭菊植株，取當年生的幼嫩帶尖莖段約10 cm作為外植體。

1.2 處理設計

1.2.1 材料預處理

將剪取的嫩莖帶回實驗室，用自來水沖洗去除表面灰塵，再用洗衣粉浸泡約20 min，最后用流水洗凈，放入無菌的三角瓶中等待滅菌。

1.2.2 滅菌方式

在無菌操作臺內，對外植體進行滅菌[2-3]：先用70%乙醇浸泡20～30 s，無菌水沖洗3次，再用0.1% HgCl2溶液處理6～8 min，無菌水沖洗5次。將材料切成1～2 cm的帶尖莖段，接入滅菌好的MS培養基中，每組接種20瓶，每瓶接種4個外植體。接種20 d后，調查每組植株的生長情況，包括基本形態、存活率、污染率。本試驗重復3次，統計結果取3次的平均值。

1.2.3 增殖培養

將獲得的無菌側芽從外植體上輕輕切下，接入增殖培養基中，每瓶接種2棵。增殖培養以MS為基本培養基(含25 g·L-1蔗糖、8 g·L-1瓊脂粉)[4]，添加不同濃度的6-BA和NAA (6-BA的1、2、3水平分別為1.0、2.0、3.0 mg·L-1，NAA的1、2、3水平分別為0.1、0.2、0.3 mg·L-1)，培養20 d后觀察增殖情況。

1.2.4 生根培養

選擇增殖的杭菊試管苗，切去基部的愈傷組織，接入到生根培養基中，以MS為基本培養基(含25 g·L-1蔗糖、8 g·L-1瓊脂粉，1.0 mg·L-16-BA)，添加不同濃度的NAA和IBA(NAA的1、2、3水平分別為0.1、0.2、0.3 mg·L-1，IBA的1、2、3水平分別為0、0.05、0.10 mg·L-1)。每個處理接種10瓶，每瓶接種5棵，培養14 d后統計生根情況。

2 結果與分析

2.1 外植體培養

外植體滅菌接種1 d后，部分植株出現泛黃、萎蔫現象；接種3 d后，部分植株出現細菌或真菌感染；接種7 d后，部分植株側芽長出；接種15 d后，外植體情況基本穩定。滅菌并接種20 d后對試驗植株進行統計。由表1可以看出，隨70%乙醇和0.1% HgCl2滅菌時間延長，外植體污染率顯著降低，但也導致外植體逐漸萎蔫、死亡率逐漸增加。其中，70%乙醇滅菌25 s結合0.1% HgCl2溶液浸泡7 min處理的污染率為18.8%，死亡率為10%，滅菌效果比其他8組處理好(圖1)。

表1 杭菊不同滅菌方式的死亡率和污染率

圖1 杭菊外植體形態(培養20 d)和培養后形成的叢生芽

2.2 增殖培養

切取上述處理的植株側芽分別轉接到9種培養基中進行增殖，培養14 d觀察植株增殖情況。外植體出現2種生長方式：①在外植體基部形成愈傷組織，經過分化進而長出叢生芽；②外植體基部直接長出叢生芽，且生長迅速。不同培養基中杭菊分化的方式有一定區別： 6-BA濃度為2.0 mg·L-1、NAA濃度為0.2 mg·L-1時外植體形成大量愈傷組織，幾乎沒有叢生芽的形成。隨著6-BA和NAA濃度逐漸降低，叢生芽數量逐漸增加。6-BA濃度為1.0 mg·L-1、NAA濃度為0.1 mg·L-1時杭菊外植體形成大量叢生芽，且芽體健壯、深綠色，并有少量根毛長出。

將增殖培養過程中形成的愈傷組織轉接到MS培養基(6-BA 1.0 mg·L-1，NAA 0.1 mg·L-1)上，如圖1中C所示，30 d后有大量叢生芽形成。

2.3 生根培養

將誘導產生的叢生芽轉接到生根培養基中，以MS為基本培養基并加入適量活性炭，6-BA 0.1 mg·L-1、NAA 0.1 mg·L-1、IBA 0.05 mg·L-1，培養4 d后，叢生芽出現白色根毛，15 d后植株長勢旺盛，根系發達(圖2)。

3 小結

以杭菊莖尖為外植體進行組織培養，最佳滅菌方式為先用75%乙醇浸泡25 s，無菌水沖洗3次，再用0.1% HgCl2溶液滅菌7 min，無菌水沖洗5次，杭菊植株生長狀況良好，成活率最高，污染率僅為18%。杭菊增殖過程中，MS+6-BA 1.0 mg·L-1+NAA 0.1 mg·L-1+蔗糖25 g·L-1+瓊脂8 g·L-1能分化出大量叢生芽；MS+6-BA 2.0 mg·L-1+NAA 0.2 mg·L-1+蔗糖25 g·L-1+瓊脂8 g·L-1有大量愈傷組織形成。以MS+6-BA 1.0 mg·L-1+NAA 0.1 mg·L-1+IBA 0.05 mg·L-1+蔗糖25 g·L-1+瓊脂8 g·L-1為培養基，對杭菊叢生苗進行生根培養，培養4 d杭菊叢生苗開始出現根毛，植株長勢明顯。

圖2 叢生芽接種到生根培養基中不同天數的生根情況

杭菊外植體被絨毛造成滅菌困難，在處理過程中也可加入適量洗衣粉或用毛刷輕輕刷去絨毛以便于進行滅菌。同時，試驗過程中分別在3月、4月、5月從田間選取杭菊植株進行滅菌培養，隨著時間的推移，菊花在大田中生長加快，取樣的外植體在培養過程中增殖和生根所需要的時間也逐漸縮短，這可能與外植體內激素水平有一定聯系，需進一步進行研究。