杭椒新品種H12純度的SSR快速鑒定技術

傅鴻妃

(杭州市農業科學研究院，浙江 杭州 310024)

辣椒是我國重要的蔬菜作物，目前全國辣椒種植面積超過200萬hm2，占蔬菜種植面積的12%，產量4 000萬t，是全球辣椒生產第一國[1]。辣椒是常異花授粉蔬菜，雜交種子生產絕大部分通過人工去雄后再授粉得到，因此，在生產過程中容易產生因去雄不干凈而造成自花授粉，昆蟲傳播和機械混雜也是導致花粉混雜的原因。雜交種子純度鑒定是保證種子質量和農民效益的有效手段，對于提高生產效益和利用雜種優勢具有非常重要的意義。

目前，我國雜交種子純度鑒定以田間栽培形態鑒定、實驗室同工酶電泳鑒定和分子標記鑒定為主。田間種植鑒定周期較長，需要花費大量的勞動力和土地資源，且易受到環境因素的影響。同工酶鑒定多態性信息相對較少，又具有組織器官特異性，隨著新品種數量的不斷增加和種質遺傳基礎越來越狹窄，這2種鑒定方法已經難以滿足純度鑒定的精確性要求。分子標記技術因快速、精確性高等原因被越來越多地應用在雜交種子純度鑒定上，SSR分子標記具有操作方法簡單、標記數量豐富、多態性穩定性和重復性好、條帶分布均勻等優點，本實驗利用該技術對杭椒雜交種子進行快速鑒定，以期可以有效加快種子鑒定速度，節約時間和成本。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本研究所用材料是課題組自留的自交提純辣椒品種H12母本、H12父本和雜交種H12。3份材料在當年11月份播種，于次年3月中下旬定植于杭州市農業科學研究院蔬菜基地。

1.2 DNA的提取與檢測

采用改良的CTAB法提取樣品心葉基因組DNA，用分光光度計NanoDrop2000檢測DNA質量和濃度，-20 ℃下保存備用。

1.3 PCR擴增體系和擴增程序

PCR擴增體系為總體積25 mL，其中10×PCR緩沖液2.5 mL，2.5 mmol·L-1dNTP 2.0 mL，SSR左右引物(10 mmol·L-1)各2.0 mL，Taq酶(5 U·mL-1)0.5 mL，模板DNA(25 ng·mL-1)2.0 mL，ddH2O 14.0 mL。

SSR-PCR擴增程序為94 ℃預變性60 s；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，35個循環；72 ℃延伸3 min。擴增產物30%聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測，快速銀染法染色。

1.4 引物的合成與篩選

參照發表的文獻和數據庫查找得到辣椒的SSR引物，經辣椒SSR遺傳多樣性研究選出多態性較好引物31對[2]，用于區分杭椒父母親本和雜交種，引物由上海生物生工公司合成。

1.5 雜交種SSR純度鑒定

將選出的能區分父母親本和雜交種的引物，用于雜交種的純度鑒定，雜交種純度(%)=同時具備父母親本特征條帶的植株數量/檢測的植株總數量×100%。

1.6 雜交種田間純度鑒定

定植后的雜交種植株進行常規田間管理，統計之前不去雜、不間苗。盛花期統計總株數和雜株數，統計雜交種田間純度，雜交種純度(%)=(總株數-雜株數)/總株數×100%。

2 結果與分析

2.1 提取的DNA質量分析

SSR標記的質量與DNA的質量息息相關，DNA純度用D260/D280值估算，D260/D280值為1.8的DNA質量很好，是純品。分光光度計NanoDrop2000測量得到H12母本辣椒、H12父本辣椒和雜交種H12辣椒的DNAD260/D280值分別為1.99、1.87和1.75，滿足SSR分子標記的需要。

2.2 SSR引物篩選

利用H12母本辣椒、H12父本辣椒和雜交種H12辣椒，以31對引物進行多態性挑選，31對引物均擴增出了清晰條帶，但大部分不能區分父母本辣椒和F1代雜交種，不適合用于父母親本與F1代雜交種的純度鑒定，只有Cams885和GP20036兩對引物在父母親本和雜交種之間擴增出典型的父母本互補條帶，可用于鑒定父母親本和F1代雜交種。圖1、圖2是在引物Cams885和GP20036下擴增出的區分H12和父母親本的圖譜。

a—母本；b—父本；c—H12。圖2同。圖1 引物Cams885區分H12和父母親本的圖譜

圖2 引物GP20036區分H12和父母親本的圖譜

2.3 雜交種SSR純度鑒定

分別取96株H12植株的心葉，利用引物Cams885和GP20036進行純度鑒定，結果發現96個H12植株中引物Cams885擴增出92個植株條帶清晰一致，引物GP20036擴增出86個植株條帶清晰一致，利用這2個引物檢測雜交種H12種子的純度分別是95.8%和89.6%。圖3、圖4分別是雜交種H12在引物Cams885和GP20036下擴增出的部分圖譜。

2.4 雜交種田間純度鑒定

辣椒盛花期時對定植的雜交種H12進行田間純度鑒定，對種植的每個單株進行植株、葉、花、果等性狀的逐一辨別和分析，記錄數據并統計結果。結果表明，田間種植的150株H12中，4株定植后死亡，剩余146株中有138株是雜交種H12，田間鑒定的純度是94.5%。

3 討論

3.1 SSR分子標記和田間表型性狀2種純度鑒定結果的一致性

本研究選出的引物Cams885能區分H12母本辣椒、H12父本辣椒和雜交種H12辣椒，這與張曼[3]的結果一致。選出的引物GP20036能夠區分H12母本辣椒、H12父本辣椒和雜交種H12辣椒國內還沒有人用于辣椒純度鑒定，這是國內首次利用該引物區分辣椒父母親本和其雜交種子。

圖3 引物Cams885檢測H12擴增部分的圖譜

利用引物Cams885和GP20036對雜交種H12的種子進行純度鑒定，結果發現，96個H12植株中引物Cams885擴增出92個植株條帶清晰一致，引物GP20036擴增出86個植株條帶清晰一致，純度分別是95.8%和89.6%。利用田間表型性狀檢測雜交種H12種子的純度，146株中有138株是雜交種H12，純度為94.5%。利用SSR分子標記檢測和田間表型性狀觀察雜交種H12種子的純度結果相近，說明實驗室利用SSR分子標記技術檢測雜交種子和利用田間性狀觀察杭椒雜交種子純度結果一致，實驗室SSR分子標記技術檢測杭椒雜交種子可以大大縮短純度鑒定的周期，節約時間和精力。

3.2 影響杭椒雜交品種種子純度的主要因素及解決方法

利用SSR分子標記技術檢測發現存在個別植株條帶缺失或條帶不一樣的情況，田間表型性狀觀察發現存在不一樣的表型性狀的植株，主要是非本雜交品種種子所致，存在雜株的主要原因是其他辣椒種子不經意的混雜，或者是母本沒有授粉結果所致，亦或是隔離不嚴密存在個別植株或果實被非父本雜交所致。解決這些問題的方法是嚴格隔離，不讓其他花粉混雜進來；仔細授粉，不漏下不授粉的母本；采收和烘曬種子盡量不讓別的種子混雜進來。