苜蓿黃萎病的發生、危害及檢測

索南措，黃遠志，李彥忠,2，俞斌華,2

（1.蘭州大學草地農業生態系統國家重點實驗室/蘭州大學農業農村部草牧業創新重點實驗室/蘭州大學草地農業教育部工程研究中心，蘭州大學草地農業科技學院，甘肅 蘭州 730020；2.中國農業科學院草原研究所，內蒙古 呼和浩特 010010）

紫花苜蓿(Medicago sativa)是我國草產業的主要草種，在我國已有兩千多年的栽培歷史[1-2]。由于其營養價值高、適口性好、根系發達、再生性強、耐旱、抗寒、耐鹽堿、適應性廣的特點，是理想的飼料和水土保持植物，具有顯著的生態效益和經濟價值[3-4]。苜蓿是我國干旱半干旱地區生態建設和退耕還草的重要草種，在建設和保護生態環境[5]、調整種植業結構[6]、保持農業可持續發展等方面[7]均具有潛在的經濟效益和重要的社會效益[8]。因其產量高、營養豐富(粗蛋白質含量可高達22%)，綜合營養價值高于飼用玉米等，是奶牛養殖的理想飼料，是為我國人民提供優質健康原料奶的物質基礎[9]，被譽為“牧草之王”[1]。21世紀初，西部大開發戰略的實施，為我國苜蓿產業化發展拉開了序幕，伴隨著京津風沙源治理、退耕還林還草、退牧還草等重大生態工程的啟動和奶業的快速發展，我國苜蓿產業發展到了一個新的階段，苜蓿在畜牧業發展、種植業結構調整和生態治理以及保障邊疆地區經濟繁榮中，發揮著越來越大的作用，苜蓿產業已成為草產業的支柱產業，畜牧業(特別是奶牛業)的基礎產業，保障生態安全的重要產業，邊疆地區的民族產業[3,9-10]。隨著我國規模化、標準化奶牛養殖業的快速發展，對高品質植物性蛋白飼料的需求量將越來越大，苜蓿已成為不可替代的戰略性保障飼草[11]，并且在我國種植面積非常廣大。

據《全國苜蓿產業發展規劃(2016-2020)》，截至2015年底，全國苜蓿保留面積7 067萬畝(約471.1萬hm2)，產量3 217萬t；2016年底，全國苜蓿保留面積 6 562萬畝(約437.5萬hm2)，產量3 021萬t，主要栽培于甘肅、內蒙古、新疆、寧夏、黑龍江、河北等省(區)，其種植面積占全國的89.8%，形成了甘肅河西走廊、內蒙古科爾沁草地、寧夏河套灌區等一批10萬畝(約6 700 hm2)以上集中連片的優質苜蓿種植基地，是我國主要苜蓿種植區和種子生產基地，也是我國草食畜牧業主產區。

苜蓿栽培草地的種植規模和生產水平是衡量一個國家畜牧業現代化程度的重要標志[12]。然而目前我國苜蓿產業發展存在的突出問題是產不足需、質量水平不高[13-14]。我國畜牧業尤其是奶業的快速發展，使其對苜蓿的需求量逐年增加，而現階段國產苜蓿無論在數量上還是在質量上，均無法滿足畜牧業生產的消費需要[15-16]。2016年我國進口苜蓿近150萬t，進口量是2008年的近80倍。據估計近年我國苜蓿約50%的需求總量仍需依賴進口。

諸多因素導致我國苜蓿供不應求的局面，其中包括機械化程度低、栽培技術不到位等，對苜蓿病害防治缺失也是造成草產量不高，草品質不佳的主要原因[14,17]。隨著我國進口苜蓿種子和苜蓿草產品數量的激增(其中約90%來自北美)，以及我國栽培面積的擴大，外來入侵病害可能成為我國苜蓿生產的主要限制因素。

苜蓿黃萎病是世界上公認的苜蓿毀滅性病害，該病菌被我國列入《進境植物檢疫性有害生物名錄》(農業部第862號公告，2007年5月29日發布)中第276號檢驗對象。該病害最早于1918年發現于瑞典，1938年傳入德國，二戰之后在丹麥突然爆發，隨后入侵荷蘭、法國、英國等國家，繼而向東歐、南歐擴展[18]。1962年加拿大兩個農業研究站試驗地發現該病害，由于撲滅及時，病害未能定植。1976年在美國華盛頓首次報道該病原菌侵害，并發現大量苜蓿黃萎病植株，隨后病原菌在北美廣泛蔓延，次年加拿大再次發現多處病田[19-20]，1986年傳入日本[21]，1998年曾報道在我國新疆發生[22]。苜蓿黃萎病對北美地區苜蓿產業造成過巨大打擊。

本研究綜述了苜蓿黃萎病病原物的鑒定、病害的發生規律和侵染循環、病害的危險性、病害的檢測和防治技術及流行與蔓延過程等內容，并對該病害的研究趨勢以及在我國傳播的風險性提出一定的展望。

1 苜蓿黃萎病的病原菌

黃萎病是由輪枝菌屬(VerticilliumNees)真菌引致植株萎蔫枯死的一類病害，該屬有黑白輪枝菌(V.albo-atrum)、大麗輪枝菌(V.dahliae)、苜蓿輪枝菌(V.alfalfae)、三體輪枝菌(V.tricorpus)、云狀輪枝菌(V.nubilum)、長孢輪枝菌(V.longisporum)、V.zaregamsianum、V.isaacii、V.klebahnii以及V.nonalfalfae等10個種[23-25]，可侵染紫花苜蓿、紅豆草(Onobrychis viciaefolia)、馬鈴薯 (Solanum tuberosum)、棉花(Gossypiumspp.)、啤酒花(Humulus lupulus)、草莓 (Fragaria×ananassa)、煙草 (Nicotiana tabacum)、番茄(Lycopersicon esculentum)、大豆(Glycine max)、花 生(Arachis hypogaea)、萵 苣(Lactuca sativa)等400余種農作物和雜草[26-31]。黑白輪枝菌和大麗輪枝菌是農業生產中最主要的2種病菌，其中黑白輪枝菌可寄生啤酒花、紫花苜蓿、黃瓜(Cucumis sativus)、鼠李屬(Rhamnus)、天竺葵屬(Pelargonium)、牻牛兒苗科(Geraniaceae)等多種農作物，但不同寄主上的菌株存在不同融合型，2014年采用分子生物學手段將僅侵染紫花苜蓿的一類融合型描述為苜蓿輪枝菌 (V.alfalfae)[25,29,32](圖1)。

苜蓿輪枝菌為維管束寄生菌，菌絲無色，直徑2～4 μm，也產生暗色厚壁的休眠菌絲。由菌絲抽生輪狀分枝的分生孢子梗。分生孢子梗有隔，基部呈暗色，有1～4個分枝輪，每個分枝輪有1～5 個分枝梗，分枝梗長短 14～38 μm(平均 28 μm)，頂端著生無色透明的分生孢子，孢子連續產生，聚集成球狀。單個分生孢子橢圓形，大多數無隔，少數具 1隔，大小 (3.5～10) μm×(1.5～3.5) μm(平均均6.5 μm×2.4 μm)(圖2)。苜蓿輪枝菌在 PDA 平板上產生大量的氣生菌絲，1周后菌絲體由白色轉變為乳白色，2～3周后為乳褐色，底部零星出現黑色的休眠菌絲。另外也有白色的扇變體產生。后期產生少量黑色休眠菌絲，未發現厚垣孢子和微菌核的結構。生長溫度為15～30 ℃，最適溫為20～25 ℃，高溫30 ℃，33 ℃時即停止生長。病原菌對pH的適應性強，在pH為5.5～11.5的范圍內均能生長，最適pH為6.5～9.5，但pH在3.5以下不能生長[32-33]。

圖1 基于ACT, EF, GPD和TS構建的輪枝菌屬基因系統發育樹Figure 1 Phylogenetic relationship of the 10 Verticillium species based on the combined ACT, EF, GPD, and TS dataset of the 2 658 characters and 77 taxa with Gibellulopsis nigrescens as the outgroup

圖2 苜蓿輪枝菌形態學特征Figure 2 Morphological features of Verticillium alfalfae

2 苜蓿黃萎病的侵染循環和發生規律

2.1 苜蓿黃萎病菌的越冬

苜蓿黃萎病菌以不同菌態在3種場所越冬：1)田間病株中的菌絲。菌絲可在病株的莖基部、根頸和主根中越冬，翌年植株返青后隨著新枝從刈割殘留的莖基部上生長，病菌擴展到新枝中，并隨著枝條的伸長而擴展到其它組織。2)田間病殘組織上的分生孢子。田間病殘體上的分生孢子可存活16個月以上，成為田間病菌在植株之間擴展的途徑，但隨著時間的推移，分生孢子的死亡率顯著增加。3)種子內的菌絲。雖然發病植株大多不開花結實，但發病輕的部分枝條也可能開花結實使種子攜帶病菌；也有報道分生孢子通過侵染健康苜蓿植株花期的柱頭進入種子[34]。但大部分籽粒秕瘦，在種子收獲處理中被淘汰，故飽滿種子上的帶菌率較低。由于帶菌種子是病害遠距傳播的主要途徑，在新建植的苜蓿地上，若使用帶菌的種子，則會生長出帶菌的幼苗，這些幼苗在生長后期死亡，病菌在死亡的幼苗上產生大量分生孢子，可能傳播到臨近植株上，故雖然種子的帶菌率較低，但在新建植苜蓿地中，少量的帶菌種子也會造成當地苜蓿黃萎病的遷入和持續危害[35-37]。該菌的分生孢子在土壤中存活時間尚不明確。

2.2 苜蓿黃萎病菌的傳播

學者們對于苜蓿黃萎病菌的傳播途徑有不同觀點，已明確病株上產生的種子攜帶此病菌，病菌在不同代的植株中傳遞，即通過種子帶菌垂直傳播。但也有學者認為該病菌在病株上可產生分生孢子，侵染苜蓿花期的柱頭進入種子[37]，也可直接侵染健康的植株。收割后的苜蓿干草、苜蓿粉或苜蓿顆粒等飼料中也混雜病菌的分生孢子，可通過氣流傳播造成新的侵染[38]。也有學者提出，田間分生孢子濃度低、侵染性弱，并不能作為病害傳播的主要方式[34,39]。但目前明確有以下幾種傳播方式：

1)人為遠距調運帶菌的苜蓿種子是造成新病區的主要途徑。加拿大疫區的苜蓿種子帶菌率為3.2%，美國疫區的苜蓿種子帶菌率為8.7%[26,38]；種子越小，帶菌率越高，當粒重小于1.28 mg時，帶菌率可達7.8%[39]。病菌主要分布于種胚中，美國和加拿大的苜蓿種子內部帶菌率約為0.4%[35,38-40]，種間混雜病株殘體也可傳播病菌[41-42]。

2)帶菌的苜蓿種子播種后在田間形成發病中心，病菌在發病植株中越冬，次年再發病，直至植株死亡。外表健康的苜蓿種子內部帶菌率雖然僅為0.03%[41]，但已可能在1 hm2的田間形成約750個初侵染點[43]。隨著發病植株死亡，病菌進入土壤可長期存活，隨流水、耕作農具、收獲粉塵和污染運輸工具而擴散至周圍植株甚至更大的區域[44]。

3)傳粉昆蟲、害蟲、捕食性昆蟲等，都有可能成為病害傳播的媒介，如苜蓿切葉蜂(Megachile rotundata)、豌豆蚜(Acyrthosiphon pisum)和苜蓿盲蝽(Adelphocoris lineolatus)等昆蟲可傳播此病菌[45]，豌豆蚜攜帶病原菌比例最高可達90%，切葉蜂切取病葉帶到較遠的地方，其他昆蟲的足部、下腹部粘附黃萎病原菌的孢子，在傳粉、取食、筑巢等活動中可能將黃萎病菌從病田傳至未發病田，從而加速了苜蓿黃萎病的大面積擴散(圖3)[24,26,38]。

圖3 昆蟲傳播苜蓿黃萎病菌Figure 3 Insect dissemination of Verticillium albo-atrum

2.3 初侵染和再侵染

田間病株上產生的分生孢子是主要初侵染來源之一，在苜蓿生長季節可造成侵染，尤以苜蓿生長中后期部分病株(枝)死亡后遇到連日陰雨，空氣濕度較大的條件下，有利于菌絲產孢、分生孢子萌發與侵染，因此秋季刈割后(刈割時機械損傷尤其利于孢子侵染，再生枝葉受侵染后病菌擴展到莖基部越冬)和春季返青后，可侵染莖、葉、葉柄等。土壤中的植物病殘體和分生孢子是另一主要來源，通過侵入苜蓿根部完成初侵染。大部分年份田間植株的發病主要依賴于田間病株莖基部和根頸內存留的菌絲，而非病株上的分生孢子[19,22,46-47]。

2.4 流行規律

產孢條件：該病菌在5～30 ℃下在發病葉片、莖稈上均可產孢，而最適宜溫度為25 ℃。病菌在枯死病枝、病葉上產孢量較大。

孢子萌發條件：孢子萌發需要高濕或水滴、水膜等有水的條件，在水中最適宜溫度是20～24 ℃，完成萌發需要8～24 h。因為空氣濕度是決定該病菌產孢和孢子萌發的主要條件，因此，凡是可形成高濕環境的因素均有利于病害的發生與危害，加快草地的衰退速度，如，栽培于降頻繁且年降水量大的地區，經常灌溉、密植的田塊等。另外，刈割收獲時田間留存的死亡病株在適宜條件下可產生大量分生孢子，增加田間菌源數量，并且伴有大量機械損傷，大幅增加侵染概率[46-48]。

同一種病害在不同環境下的越冬、傳播、侵染及發病條件等發病規律不盡相同，苜蓿黃萎病在我國發生規律的研究尚處于空白。

3 苜蓿黃萎病的危害

該病是世界上公認的苜蓿毀滅性病害，因此，該病菌被我國列入《進境植物檢疫性有害生物名錄》(農業部第862號公告，2007年5月29日發布)中第276號檢驗對象，其危險性體現在以下幾方面：1)降低苜蓿草產量降低15%～50%，甚至絕收[49-50]，在美國發病第2年1 hm2苜蓿黃萎病田可損失苜蓿干草產量超過2.5 t，第2年晚期至第3年早期病株衰弱死亡[51-54]。2)降低苜蓿種子產量，發病植株大多不開花結實，使種子產量逐年急劇下降，降幅可達50%[55]，繼而影響種子出口[56]。3)加速苜蓿草地早衰，發病田植株大量死亡，草地利用年限縮短為2～3年[21,57-58]。4)嚴重損害經濟效益。由于苜蓿種子和草產品攜帶檢疫病害，導致無法外銷，無經濟收益[56]，如美國哥倫比亞河流域成為苜蓿黃萎病的重病區后，苜蓿產業瓦解[18]。5)由于此病菌在土壤中長期生存，很難清除，發病田不能再播種苜蓿，至少需經過3年輪作后，存在于土壤中及凋落物中的病原菌才可能死亡。因而清除病原菌需要付出長期大量的工作，且經濟投入高昂。發病田沒有苜蓿根瘤菌的固氮作用，氮肥施用量也隨之上升，使每公頃地生產成本增加162 USD[18,26]。6)將促使畜牧業、奶業等下游產業生產成本大幅增加，導致人類對畜產品的消費量明顯降低[18,26,57]。雖然該病害在我國曾有過發生的報道，但其對草產量、種子產量和草地持久性等危害程度至今不詳。

4 苜蓿黃萎病菌的檢測與防治技術

快速診斷、準確檢測是防治苜蓿黃萎病的前提。目前關于病害的檢測方法眾多，但各有優缺點。發現疑似黃萎病植株后，可以通過分離病原菌采用形態學和分子生物學的鑒定方法，此方法準確度較高，也是目前應用最廣泛的一種方法，但從病原菌分離、純化、培養到形態學和分子生物學鑒定，往往需要幾周甚至一個月的時間，耗時非常多，不適用于海關進出口檢疫對時間性的要求。采用RFLP、RAPD、PCR、RPA等技術檢測，此方法優點是準確率較高，缺點是無法在田間或者基層生產中完成檢測[19,54,59-62]。采用同工酶鑒定法，優點為方法簡單實用，缺點為容易發生發生漏檢、錯檢的現象，準確率相對較低，不能滿足日趨繁忙的口岸檢驗要求[18,41]；采用基質輔助激光解吸電離技術(MALD-TOF-MS)、環介導等溫擴增技術(LAMP技術)[63]檢測，準確度很高，相應缺點為對操作的技術要求高，并且儀器設備昂貴、鑒定周期長、易產生假陽性等問題，不易在進境檢驗檢疫中普遍推廣使用。目前應該研究ELISA檢測法，并研制相應試劑盒，通過酶聯免疫吸附劑測定，可滿足苜蓿黃萎病快速、大量檢測的需要，并能夠明顯降低檢測成本；由顯色反應判斷結果，較簡單易行，可在基層生產和病害調查中使用。

作為一種檢疫性病害，苜蓿黃萎病在防治上應以預防為主，需采取科學的方法對苜蓿種子和草產品進行檢驗，將病菌攔截在國門之外是最關鍵的措施。一旦該病害已發生，必須采取多種措施盡快鏟除。美國、加拿大等國家首先采取隔離措施，禁止疫區苜蓿種子與草產品外銷，能夠在一定程度上減緩病害傳播。同時還應做好農業機械的清潔工作，如收割機、打捆機、刀具等需要定時消毒，也能夠有效降低病害在田間的傳播速度。但化學防治方面，并沒有非常有效的方法，如用甲基溴熏蒸后，植株凋落物中的病原菌仍然存活；用克菌丹、甲基托布津、苯菌靈、福美雙等傳統化學殺菌劑，仍然不能殺滅種子中攜帶的病原菌[19]。因此，利用抗病或耐病品種是控制牧草病害最經濟、最安全、最有效的措施，有時，甚至是控制病害的唯一有效措施[64-66]。在美國、加拿大等國家，已對苜蓿抗黃萎病的機理有較深了解[66-69]，也挖掘出了多個苜蓿抗黃萎病菌的基因[50,69-72]，且選育出Barrier、AC Blue J、Pioneer5444等多個抗黃萎病的苜蓿品種，平均產量比感病品種高15%～20%(圖4)，發病率僅為感病品種的20%～40%(圖5)[19,43,67,73-75]。在疫區較其他品種而言，使用高抗品種使每公頃苜蓿地年平均收益提高21～44 USD[49]。

圖4 田間自然侵染的苜蓿黃萎病對12個苜蓿品種產量的影響Figure 4 Effects of verticillium wilt on forage yield of 12 alfalfa cultivars in a field naturally infested with Verticillium albo-atrum

而我國育成的苜蓿品種多為感病品種[58,76]，目前尚無專門抗黃萎病菌的品種，一旦苜蓿黃萎病由國外疫區傳入，現有品種的抗病性遠不足以遏制該病害的傳播蔓延。為及時有效地應對外來入侵生物可能造成的巨大災害，必須依賴精準檢測技術的研發和綜合防治技術的研究。

5 苜蓿黃萎病在我國的發生狀況

5.1 內憂重重

苜蓿黃萎病最早于1996年發現于新疆阿克蘇地區溫宿縣托乎拉鄉[22]。2003-2005年，又相繼在巴州、伊犁州、阿勒泰地區發現39個疫情發生點，分布于4地(州)9個縣(市)35個鄉鎮的37個村的苜蓿植株上，阿克蘇地區溫宿縣托乎拉鄉苜蓿被侵染后植株死亡率為35%～70%[28,48]。此后再無發生的報道，實地調查時也未發現病株。而且，由于該病害在新疆報道時僅采用形態學方法鑒定，未通過分子生物學手段檢測基因，故其是否為苜蓿輪枝菌尚不得而知。

XU等[77]2014年在甘肅張掖地區發現的疑似苜蓿黃萎病菌，經形態學和分子生物學鑒定，證明為2014年Inderbitzin描述的苜蓿輪枝菌(V.alfalfae)，發表于Plant Disease期刊上。此前國際上公布發現此菌的國家有美國、加拿大和日本[19,21]，故我國為發現此菌的第4個國家。

世界主要病區都采用以選育和使用抗病品種為主的綜合防治策略，而我國初步評價的部分苜蓿品種，對苜蓿黃萎病多為感病品種[20,27,58]。因此我國缺少抗病品種，一旦苜蓿黃萎病由國外疫區傳入，現有品種的抗病性遠不足以遏制該病害的傳播蔓延。邵剛等[78]通過模擬研究寄主植物、溫度、pH等數據，針對苜蓿黃萎病在我國的適生性分析，結果表明，從氣候條件分析，該病害在我國的適生范圍廣、適生程度高、定殖風險大。每年4～9月份，該病在我國西北、東北以及華北地區的適生程度處于較高水平。我國許多苜蓿種植區的氣候條件與歐洲、北美洲種植區極其相似，這就預示著苜蓿黃萎病一旦傳入就可能有擴展蔓延的危險[27]，將對我國的生態保護、國民經濟、尤其是畜牧業生產造成嚴重打擊。

5.2 外患不斷

隨著國際貿易的不斷發展，國外植物及其產品在對國內農業生產造成了強烈沖擊的同時，附帶復雜危險性病蟲害的進境植物、植物產品及攜帶物數量大增，有害生物來源國家和地區不斷擴大，植物檢疫性有害生物隨進口植物、植物產品及旅客攜帶物擴散傳播的隱患也日益加大，防范外來有害生物傳入的形勢較為嚴峻[79]。苜蓿黃萎病傳播途徑較多，種子帶菌是黃萎病遠距離傳播、特別是傳入無病地區的主要途徑。干草等草產品中植物病殘體也可實現遠距離傳播。隨著畜牧業的發展，我國苜蓿干草和苜蓿種子進口數量逐年激增，其中大約80%來自于北美。2002年7月，新疆檢驗檢疫局自加拿大進口的80 t普通紫花苜蓿種子中，首次截獲國家一類危險性病害苜蓿黃萎病菌，國家質檢總局據此發布《關于苜蓿黃萎病的風險預警通報》，要求各地檢驗檢疫局切實加強對來自疫區國家的苜蓿種子等貨物的檢驗檢疫[80]。隨后，2010年1月，江蘇出入境檢驗檢疫局從一批重197 t進境美國的苜蓿草樣品中截獲了苜蓿黃萎病菌[60]；2010年10月，廣西防城港檢驗檢疫局截獲了一批重118.6 t美國進口的苜蓿草[61]；2011年1月遼寧省檢驗檢疫局從美國進口的2批次重達215 t苜蓿草產品中，檢出苜蓿黃萎病菌。北美地區是苜蓿黃萎病的主要病原疫區，大量進口苜蓿的結果就是引入新病害，讓我國本不夠強大的牧草產業雪上加霜。

6 問題與展望

倘若1998年在新疆發生的是由苜蓿輪枝孢(V.alfalfae)引致的苜蓿黃萎病，而非大麗輪枝孢或黑白輪枝孢(除去苜蓿輪枝孢后的菌種)等其他輪枝孢引致的黃萎病，則該病害經過多年后徹底消失的原因是否如同美洲斑潛蠅(Liriomyza sativae)(1994年傳入我國，曾一度擴展至全國各地，約8年后消失)等其他外來入侵生物一樣，因不能適應而消失；抑或是在強大的防治、撲滅措施下被動消亡，不得而知。而甘肅張掖地區的自然條件與新疆阿克蘇地區不同，該病害是否會逐漸消亡，還是會繼續擴展蔓延，仍需嚴陣以待，制定切實有效的應對措施。

目前國內針對苜蓿黃萎病的研究非常有限，多集中在環境模擬、病原物生理生化、檢測方法等幾方面，而針對紫花苜蓿黃萎病的侵染循環和發生規律的研究均來自國外或我國學者在國外開展的研究。我國的土壤、氣候和苜蓿栽培模式與國外存在一定差異，該病害傳入我國后其發生和危害與國外有無差異尚不明晰，即作為一種外來入侵生物，其能否適應并在我國生存及擴張蔓延，是否對我國的苜蓿產業造成重大影響，均有待深入研究。

為此，應盡快開展苜蓿黃萎病發生規律的研究及該病害在我國的風險性評價，也就是針對病害的發生范圍、嚴重程度、傳播方式、侵染循環、檢測技術、抗病育種等多方面開展系統性調查與研究，在此基礎上，研發行之有效的防治措施。通過研究，如果該病害已經對我國苜蓿帶來巨大損失，在當地也可長期生存并且存在有效越冬場所與傳播途徑，則說明其對我國苜蓿產業將帶來巨大風險，必需盡早開展綜合防治。