云南云嶺牛桑葉營養價值的評價

王寧偉，黃先智，劉建勇，黃必志，沈以紅

（1.西南大學家蠶基因組生物學國家重點實驗室，重慶 400715；2.農業部蠶桑功能基因組與生物技術重點實驗室，重慶 400715；3.云南省草地動物科學研究院，云南 昆明 650212）

隨著我國養殖業的快速發展，飼料蛋白源不足問題日趨嚴重，開發新型飼料蛋白源迫在眉睫。桑樹已收錄于我國農業部列入飼料目錄中，粗蛋白含量在200 mg·g-1干物質以上[1]，具備作為飼料資源開發的潛力。桑樹作為我國本土樹種，具有適應性強，成園成本低廉，栽培技術成熟、病蟲害少等特點，利用非耕地發展飼料桑對保證我國糧食安全具有重要意義。

關于桑葉在畜禽水產飼料上的應用研究主要集中在其添加量的優化、添加后對動物生理指標、生產指標、畜禽水產品品質評價方面[2]。有研究表明，飼料中添加適量桑葉粉，可顯著提高動物生產性能和自增重等，改善動物肉質品質，提高機體抗氧化能力和免疫力等[3]。目前桑葉最常用的飼用形式是直接鮮食或刈割后粉碎添加至動物的飼料中。但是采用這一方法飼喂畜禽，會出現添加量低、適口性差等問題。馬恒甲等[4]發現，草魚飼料中添加10%桑葉，草魚的生長受到顯著影響，日增重和生長率受到抑制。目前關于蛋雞的研究表明，桑葉添加量超過一定比例后，蛋雞產蛋率及采食量顯著降低[5]。出現這種原因，猜測是由于桑葉中含有抗營養因子，影響動物的消化吸收。但目前關于桑葉中的主要抗營養因子和種類及綜合評價桑葉的飼用價值的研究資料甚少。

本研究通過測定和分析桑葉的營養成分、瘤胃降解特性、氨基酸組成、抗營養因子種類和含量，同時與“牧草之王”苜蓿進行比較，客觀地評價桑葉的飼用價值，為今后開展科學、合理對桑葉的培育、推廣以及綜合開發利用提供科學依據，有望彌補我國飼料蛋白源的不足。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 桑葉

桑葉為第5-10片成熟葉，桑品種為桐鄉青，于2017年7月中旬隨機采摘于重慶市蠶業科學研究院。試驗材料采收后經65 ℃烘干后，粉碎機粉碎，過0.613 mm篩，置密封袋中冷凍保存。

1.2 試驗動物及飼養管理

選用3頭安裝瘤胃瘺管、健康狀況良好、體重為400 kg左右的云南云嶺牛。每日基礎飼糧供給量為維持營養需要水平的1.3倍，日糧精粗比為1∶9，精料組成：每1 kg精料中含米糠100 g、麥麩80 g、玉米460 g、豆粕40 g、菜粕120 g、棉粕25 g、酒糟粉70 g、大麥50 g、預混料20 g、小蘇打5 g、鹽15 g、油5 g。粗料：青貯玉米秸稈。試驗于2017年10月在云南省草地動物科學研究院進行，預試期10 d，正試期3 d。試驗期間，試驗用牛圈養，分別于8:00和18:00飼喂，自由飲水，且進行免疫處理和驅蟲處理，保證試驗用牛的健康。

1.3 瘤胃降解率的試驗設計

準確稱取桑葉5 g裝入常規尼龍袋中，每個時間點分別設有4個重復，將每一組綁在50 cm的半軟質塑料管上，置于專用網袋中，按照規定，試驗用牛晨飼后，將裝有飼料的網袋放入肉牛瘤胃中，分別于放置瘤胃后的6、12、24、48及72 h后從瘤胃中取出，于室溫下用水沖洗所有尼龍袋，并在65 ℃條件下烘至恒重儲存待用，其中0時間點的桑葉樣品僅做放入39 ℃熱水中浸泡30 min處理，取出65 ℃烘干至恒重待用。

1.4 相關指標測定

1.4.1 營養成分測定

采用飼料常規分析法[6]測定桑葉干物質(dry matter, DM)、粗蛋白 (crude protein, CP)、粗脂肪(ether extract, EE)、粗纖維(crude fiber, CF)、粗灰分(crush ash, ASH)和有機物 (organic matter, OM)含量，采用范氏測定法[7]測定中性洗滌纖維(neutral detergent fiber, NDF)、酸性洗滌纖維(acid detergent fiber, ADF)，參照GB/T 6436-2018《飼料中鈣的測定》采用高錳酸鉀法測定鈣含量，參照GB/T 6437-2002《飼料中總磷的測定》采用分光光度法測定磷含量。

1.4.2 水解氨基酸的測定

桑葉中氨基酸含量采用氨基酸自動分析法，參照GB/T 5009.124-2003《食品中氨基酸的測定》。

1.4.3 抗營養因子測定

采用硝酸鋁-亞硝酸鈉法[8]測定桑葉中黃酮含量，苯酚-硫酸法[9]測定桑葉中多糖含量，高效液相色譜-紫外檢測法[10]測定桑葉中DNJ含量，鎢酸鈉-磷鉬酸鹽比色法[11]測定桑葉中單寧含量，水楊酸鐵絡合比色法[12]測定桑葉中草酸含量；三氯化鐵比色法[13]測定桑葉中植酸含量，香草醛-高氯酸比色法[14]測定桑葉中皂苷含量。

1.5 數據處理

1.5.1 飼料相對值

粗飼料分級標準[15]采用飼料相對值(relative feed value, RFV)[16]評定粗飼料質量，將粗飼料一共分為特級(＞1.51)、1級(1.25～1.50)、2級(1.03～1.24)、3 級 (0.87～1.02)、4 級 (0.75～0.86)和 5 級 (＜0.75) 6個等級，特級飼料價值最高，5級飼料價值最低。

RFV=DMI×DDM/1.29。

式中：DMI(%BM)表示動物對粗飼料干物質的自由攝入量，DMI(%BM)=120/NDF；DDM(%DM)表示粗飼料中的可消化干物質，DDM(%DM)=88.9-0.779×ADF。

1.5.2 瘤胃降解率

每個時間點飼料的瘤胃降解率(%)可通過以下公式計算：

每個時間點飼料樣品中某一營養成分的降解率=[(飼料樣品未放入瘤胃前某一營養成分含量-飼料樣品從瘤胃中取出后某營養成分含量)/飼料樣品未放入瘤胃前某一營養成分含量]×100%。

1.5.3 瘤胃降解參數

參考Φrskov和McDonald[17]提出的瘤胃動力學數學模型，參照下述公式計算：dp=a+b(1-e-ct)。

式中：dp為t時的降解率，a為快速降解部分(%)，b為慢速降解部分(%)，c為慢速降解部分的降解速率常數(h-1)，t為飼料在瘤胃內的培養時間(h)。

粗飼料有效降解率(effective degradation, ED, %)：ED=a+b×c/(k+c)，其中k表示粗飼料被后反芻動物攝入，其在瘤胃中的流通速率，試驗條件下k取0.031/h。

1.5.4 氨基酸的評價

1)模糊識別法[18]

根據蘭氏距離法計算樣品蛋白的貼近度μ(a,u1)，計算方法如下：

式中：ak表示標準蛋白中各種必需氨基酸的含量，uik表示第i個待測樣品蛋白的第k個必需氨基酸的含量。

貼近度μ數值越大，表明待測樣品蛋白中氨基酸的平衡性越接近于標準蛋白，說明與動物的需要量越貼切，該待測樣品具有更高的飼用價值。

2)氨基酸比值系數法

由氨基酸平衡理論及FAO/WHO必需氨基酸模式[19]，計算待測樣品蛋白的氨基酸比值(ratio of amino acid, RAA)、氨基酸比值系數(ratio coefficient of amino acid, RCAA)及比值系數分(score of ratio coefficient of amino acid, SRCAA)，按下述公式進行計算:

式中：CV(coefficient of variation)表示RC的變異程度，CV=標準偏差/平均數值。

1.6 數據整理與統計分析

采用EXCEL 2013 和SPSS 21.0軟件對試驗結果進行統計，結果用平均數 ± 標準差(±s)來表示。

2 結果與分析

2.1 桑葉的營養成分

桑葉的粗蛋白、粗脂肪和粗纖維含量分別為22.50%、2.20%和13.52% (表1)，鈣和磷含量分別為2.42%和5.65%。

2.2 桑葉各營養成分在肉牛瘤胃中不同時間點的降解率及有效降解率

桑葉各營養成分在肉牛瘤胃中的降解率具有相同趨勢 (表2)，即隨其在瘤胃中時間的延長而逐漸增大，于72 h時降解率最大，其中CP、OM、DM的降解率均達到90%左右，接近于完全降解，而ADF、NDF的降解率分別為77.75%、85.69%，降解率相對較低。12 h時，各營養物質降解率均未達到72 h時最大降解率的一半，24 h時，各營養物質降解率均達到72 h時最大降解率的70%以上，12-36 h，CP、NDF和OM降解率變化較大(P＜0.05)，所有指標48 h及以后降解率趨于穩定(P＞0.05)，可以看出，桑葉各營養成分在瘤胃中的降解點是12 h，各營養成分在36 h基本降解完成，其降解速率較快。桑葉中各營養物質的有效降解率分別為CP 65.02%、OM 59.42%、DM 58.56%、ADF 48.39%和NDF 56.42%。

表1 桑葉的營養水平(干物質基礎)Table 1 The nutrient levels in mulberry leaves (DM basis)

表2 桑葉中各營養成分的瘤胃動態降解率及有效降解率Table 2 The ruminal degradability and effective degradation rate of different nutritional components in mulberry leaves

2.3 桑葉蛋白的氨基酸組成

對桑葉蛋白中所含的氨基酸種類及含量采用氨基酸自動測定法測定，檢測指標中包括的17種氨基酸桑葉中均可以檢測到，其中包括7種動物機體的必需氨基酸(essential amino acid, EAA) (表3)。桑葉蛋白中含有的氨基酸含量為144.1 mg·g-1，其中EAA含量為61.5 mg·g-1，在總氨基酸中所占比例為42.7%，EAA與非必需氨基酸(non-essential amino acid, NEAA)的比值達到0.746，桑葉蛋白中氨基酸含量在0.13%～1.76%，其中谷氨酸和天冬氨酸的量最大，分別占總量的14.8%和19.1%。

2.4 桑葉蛋白的平衡性分析

2.4.1 模糊識別法的評價結果

由模糊識別法計算得出桑葉蛋白貼近度u1為0.524，說明桑葉蛋白與標準蛋白的貼近度較高。

2.4.2 氨基酸比值系數法的評價結果

在桑葉蛋白中，賴氨酸的RAA值最低，僅為0.04，說明其為第一限制性氨基酸(表4)。將桑葉蛋白與標準模式蛋白進行氨基酸組分對比發現，桑葉蛋白與標準模式蛋白差異性不大，含量最高的氨基酸為蘇氨酸，RAA值為0.26。

2.5 桑葉的抗營養因子

經測定，桑多糖含量為159.33 mg·g-1，黃酮、單寧和皂苷含量分別為31.75、19.95和14.50 mg·g-1，DNJ和植酸含量分別為1.63和3.75 mg·g-1，草酸含量最低，僅為 0.27 mg·g-1(表5)。

表3 桑葉蛋白的氨基酸含量Table 3 Amino acid content of mulberry leaves

表4 桑葉蛋白的氨基酸比值系數分數值Table 4 Amino acid ratio coefficients of proteins from mulberry leaves

3 討論

3.1 桑葉的營養價值評價

評判飼料營養價值的基礎是對飼料中的營養物質進行常規的化學分析，這也是后續采用尼龍袋半體內法測定飼料在肉牛瘤胃中降解率的前提。與苜蓿[20]相比，桑葉具有粗蛋白含量、RFV值高，酸性洗滌纖維、中性洗滌纖維含量較低的特點，說明桑葉屬于蛋白質飼料[21]，具有較高的營養價值。

3.2 桑葉的瘤胃降解特性

評判粗飼料的營養價值由某一單個因素(如粗飼料的常規營養成分)決定具有很大的片面性，動物機體對粗飼料中各種物質的攝入量及消化利用程度是評價粗飼料營養特性的又一重要因子，可通過飼料的降解特性反映飼料消化率的高低[22]，綜合兩個因素更能夠全面地評價粗飼料的營養價值。

3.2.1 桑葉粗蛋白的降解特性

在所有評價粗飼料營養價值的指標中，CP的參考意義較高，動物對粗飼料中CP的消化利用程度可以直接反映動物機體中瘤胃微生物蛋白的合成情況及體內氮元素的聚集情況，CP的降解率主要由粗飼料自動物攝入后在瘤胃中的停留時間及飼料發酵的難易程度所決定[23]。本研究中，桑葉CP的有效降解率高于50%，但低于苜蓿(77.94)[20]，表明桑葉具有提高動物品質的功能，但略低于苜蓿。

3.2.2 桑葉中性洗滌纖維、酸性洗滌纖維的降解特性

NDF、ADF降解率是評價反芻動物對粗飼料中營養物質利用的重要指標，NDF降解率可準確反映動物對粗飼料中纖維的利用率。NDF、ADF及日糧組分是影響飼料中NDF、ADF降解率的主要原因，從而能夠影響NDF和ADF的瘤胃有效降解率[24]。ADF是粗飼料中消化率最低的成分，主要包括木質素(ADL)纖維素及二氧化硅等，因木質素結構特殊，瘤胃微生物對其降解率較低，故瘤胃微生物對粗飼料中ADF的降解率一般不高[25]。本研究中桑葉的NDF和ADF的最終降解率及有效降解率均低于其他3種營養物質，與苜蓿（Medicago sativa）[20]相比，桑葉的有效降解率顯著高于苜蓿(NDF、ADF的有效降解率分別為26.47%和26.14%)，這些結果說明桑葉中NDF和ADF比較利于動物的消化吸收。

表5 桑葉中的抗營養因子含量(干物質基礎)Table 5 Anti-nutrient levels of mulberry leaves (DM basis)

3.2.3 桑葉干物質、有機物的降解特性

飼料中DM和OM的降解速率可以直接影響和說明反芻動物在一定的時間內對飼料干物質的總攝入量，DM和OM的有效降解率越高，反芻類動物對粗飼料的采食量越高及對粗飼料的消化利用程度越高，更有利于動物的生長育肥[26]。桑葉的DM和OM的有效降解率高于苜蓿(DM和OM的有效降解率分別為56.24%和53.15%)[20]，說明肉牛瘤胃內微生物能更好地利用桑葉中的營養物質，且桑葉更有利于反芻類動物的生長育肥。

3.3 桑葉蛋白的氨基酸組成

粗蛋白的營養價值與其氨基酸組成密切相關，特別是必需氨基酸的含量和比例[27]。本研究測得，桑葉蛋白中EAA/TAA和EAA/NEAA值均高于FAO/WHO標準所規定的最小值(0.4和0.6)[19]，EAA/TAA和EAA/NEAA與苜蓿(0.435和0.771)接近，且桑葉蛋白中含有動物機體所需的全部種類的氨基酸，氨基酸含量也滿足動物的需求，必需氨基酸含量較高，表明桑葉屬于優質蛋白源[28]。

3.4 桑葉蛋白的平衡性分析

3.4.1 模糊識別法評價桑葉蛋白

模糊識別法是評價待測蛋白與標準蛋白中各種氨基酸的接近程度，數值越大，表明待測蛋白中氨基酸與標準蛋白差異性越小，則待測蛋白中氨基酸品質越好[29]。桑葉蛋白與標準蛋白的貼近度差值大于0.5，這說明桑葉蛋白中氨基酸品質較高。

3.4.2 氨基酸比值系數法分析桑葉蛋白中氨基酸的平衡性

必需氨基酸的種類、含量及組成平衡性是影響粗飼料中蛋白質品質的主要因素，其中必需氨基酸的平衡性與FAO/WHO氨基酸模式越接近，表明該飼料蛋白品質越好，能夠提供動物機體的營養需求[30]，故世界衛生組織和聯合國糧農組織于20世紀70年代提出一個全新的方法——氨基酸比值系數法來評價某種粗飼料中蛋白的品質高低[30]。氨基酸的吸收過程之間彼此影響，其中限制性氨基酸是影響蛋白質營養價值的主要原因。桑葉中的第一限制性氨基酸為賴氨酸，在使用過程中應注意與其他葉蛋白或富含賴氨酸的蛋白質混合使用，提高桑葉蛋白質的利用率及營養價值。

3.5 桑葉中的抗營養因子

抗營養因子是植物在代謝過程產生，以不同形式對機體吸收營養物質產生拮抗作用的物質，目前研究較多的有單寧、草酸、植酸、生物堿、皂苷等[31]。

桑葉中活性物質較多，其中具有強α-糖苷酶抑制活性的物質有桑黃酮、桑多糖和1-脫氧野尻霉素，并且這3類物質相互作用，共同抑制α-糖苷酶活性。張鴻等[32]研究發現，桑樹中這3類物質會顯著影響動物機體中葡萄糖和糖原等碳水化合物在體內的一系列生化反應，當動物攝入體內的碳水化合物因腸粘膜細胞中缺乏相應的營養物質水解酶導致其吸收率降低甚至為零時，會出現腸道內容物的滲透壓高于正常水平的情況，這時需吸收大量的水分而導致動物出現腹瀉現象，故具有一定的抗營養特性。目前的研究表明，植物中桑是DNJ最主要的來源，故在桑葉利用時尤其需注意DNJ的抗營養特性。

本研究測得桑葉中單寧含量為19.95 mg·g-1，高于高粱 (Sorghum bicolor, 10.50 mg·g-1)[33]和苜蓿(10.03 mg·g-1)[34]。飼料中單寧經動物口腔咀嚼后與口腔中的糖蛋白作用，生成影響動物適口性的苦味和澀味物質；與金屬離子、蛋白質、多糖等物質結合，從而降低動物對營養物質的吸收與利用；還會抑制消化酶的活性，降低大部分營養物質的消化率，尤其是蛋白質和碳水化合物[35]，Donnelly和Anthony[36]發現，對食草動物而言，單寧含量達2%干物質時，可產生明顯的阻食現象。桑葉使用時應注意單寧的影響。

飼料中的皂苷與動物口腔中的蛋白酶作用后，分解為具有苦味、澀味和辛辣味的小分子物質，導致動物出現適口性降低的情況，進而影響動物對飼料中營養物質的攝入量，生長速率降低，皂苷還具有溶血活性，引起紅細胞溶血，且會引起反芻動物的瘤胃鼓氣[37]。桑葉中皂苷含量高于苜蓿(8.79 mg·g-1)[34]，且高于魏伯平等[38]分析的9種豆科牧草中皂苷含量最高的紫云英(Astragalus sinicus, 12.65 mg·g-1)，故桑葉作為飼料時應注意皂苷對動物生長性能的影響。

植酸與飼料中的礦物元素結合為不溶性復合物，降低腸道對植酸的吸收，還與蛋白、淀粉等營養成分結合，阻礙動物對營養成分的利用[39]。與吳德錦[34]測定的粗莖象草(Pennisetum purpureum)和細莖象草中植酸含量接近，但極顯著低于苜蓿含量(11.26 mg·g-1)，桑葉中的植酸可能對日糧中的大量添加有限制作用。

Hang等[40]發現草酸和草酸鹽會影響礦物元素的利用，是飼料作物中的一種抗營養因子。草酸影響動物對礦物元素的利用，草酸與日糧中的Ca結合，形成草酸鈣，干擾Ca、P的新陳代謝，包括骨中礦物元素的代謝，骨骼中礦物質的消耗使骨骼纖維化和畸形化，造成動物殘疾。一般當水溶性草酸含量在達到約2%時才會嚴重影響反芻動物的健康[34]，桑葉中草酸遠低于2%，其抗營養特性不明顯。

4 結論

桑葉CP含量高于20%，屬于蛋白質飼料，其飼料相對等級屬于特級，且桑葉中各營養成分在肉牛瘤胃中的72 h時基本接近完全降解，各營養成分的有效降解率分別達到CP 65.02%、ADF 48.39%、NDF 56.42%、DM 58.56%、OM 59.42%，在肉牛瘤胃中，桑葉的消化率高，綜上，桑葉飼用營養價值較高。

桑葉蛋白中含有被檢測的17種氨基酸，EAA/TEAA為0.427，EAA/NEAA為0.746，但桑葉蛋白與標準蛋白的貼近度僅為0.524，SRCAA值僅為65.02，桑葉蛋白中RAA值最小的為賴氨酸(0.04)，說明桑葉蛋白中含有的氨基酸種類完整，包括動物需要的所有種類的氨基酸，且其中氨基酸的含量相對較高，能夠滿足動物的最低要求，但是其營養價值并不能歸于高營養價值一類。賴氨酸是桑葉中的第一限制性氨基酸，且桑葉中含有多種抗營養因子。鑒于桑葉中存在氨基酸不均衡和抗營養因子的問題，在桑葉應用時，應進行氨基酸的平衡及抗營養因子的鈍化，以提高桑葉蛋白質的利用率及營養價值。