一株魚類水霉病原拮抗菌JL50分離鑒定及其拮抗特性分析

申 慧，魏冬梅，段魏魏，梁永增，王詠星

(新疆大學生命科學與技術學院，烏魯木齊，830046)

0 引 言

【研究意義】水霉病是漁業生產活動中的常發疾病，發病范圍廣，一旦發病難以進行有效治療，尤其在繁殖季節對魚類孵化造成較大危害。2002年傳統防治藥物孔雀石綠被列為我國水產養殖業的禁用藥，科研人員雖致力于開發新型安全的替代藥物，但截止目前產業中尚無廣譜、高效的水霉病防治藥物[1]。【前人研究進展】近年來，研究人員在水霉病的生物防治研究中取得了一定的進展，賀鳳[2]、雷翠霞[3]、劉俊[4]、宋增福[5]、Balcázar[6]等已篩選出對水霉生長有較強抑制效果的拮抗菌，并對其拮抗物質進行了初步的分離鑒定。然而，由于魚類水霉病病原多樣，不同地區病原菌優勢種群不盡相同，因而其拮抗菌的應用具有一定的地域性限制。新疆由于其獨特的氣候和水域特點，是魚類水霉病的高發區，水霉病原菌優勢種也有別于其他地區[7]。【本研究切入點】由于魚類水霉病病原多樣，不同地區病原菌優勢種群不盡相同，因而其拮抗菌的應用具有一定的地域性限制。新疆具有獨特的氣候和水域特點，研究分離獲得對魚類水霉病原菌有較強拮抗作用的拮抗菌，分析水霉拮抗菌的拮抗特性。【擬解決的關鍵問題】研究旨在以新疆本地分離純化的高致病性水霉病原菌為指示菌，從健康魚體表分離純化篩選具有較強拮抗性的細菌，并進行鑒定和分析。為新疆魚類水霉病的防治提供試驗數據和理論依據。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 水霉病原指示菌及供試菌

LF04菌株由實驗室前期分離獲得，并經魚卵感染試驗確定其為魚類水霉病原菌(科赫法則)，經形態學及18S rDNA序列分析，鑒定其屬于水霉科，寄生水霉屬；暫命名為SaprolegniaparasiticaLF04菌株；拮抗譜供試菌LF01、HL01、HL04、JY06、JY07、JY10、LY04、HZ、HZ04均由實驗室前期分離獲得，并經科赫法則驗證均為致病菌，且形態差異明顯[8]。

1.1.2 魚苗

鯉魚魚苗用于拮抗菌安全性分析，共300尾，平均體長(2.5±0.3)cm；鯉魚成魚用于拮抗菌拮抗性分析，共120尾，平均體長(15±1.7)cm(均由新疆兵團水產技術推廣站苗種場提供)。

1.1.3 培養基

馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基 (PDA)；牛肉膏蛋白胨培養基；LB培養基。

1.2 方 法

1.2.1 拮抗菌株的分離與純化

從健康鯉魚的體表隨機取下若干鱗片，置于錐形瓶中(無菌蒸餾水)搖床震蕩1 h。梯度稀釋菌溶液，將稀釋倍數為2、10、20、50、100及1 000倍的菌液分別涂布于無菌牛肉膏蛋白胨培養基表面，37℃下培養24 h。分別選取典型單一菌落平板劃線純化，對所得菌株進行編號，4℃斜面保存，備用。

1.2.2 拮抗菌株的篩選

參照劉莉莉等[9]的方法進行拮抗菌的篩選。運用濾紙片對峙培養法，將初篩得到的菌株分別用水霉LF04為指示菌進行抑菌活性的復篩，在PDA培養基的中心放置一塊直徑6 mm左右的水霉瓊脂塊，水霉菌絲面緊貼PDA培養基表面。在距離水霉塊25 mm處放置一片含有待測菌液的濾紙片。置于25℃恒溫培養箱中倒置培養3 d，觀察抑制效果；空白作為對照(無接種細菌)。根據抑菌譜的廣度及抑菌圈大小，選擇適宜菌株做進一步研究。

1.2.3 拮抗菌株的形態及生化鑒定

參照《常見細菌系統鑒定手冊》[10]對拮抗菌株進行形態特征觀察及生理生化等初步鑒定試驗。包括革蘭氏染色、水解及發酵相關等18項試驗。

1.2.4 拮抗菌株的分子生物學鑒定

用Ezup柱式細菌DNA提取試劑盒提取拮抗菌的DNA。以DNA為模板，使用細菌16S rDNA通用引物7F和1 540 R[11-12]，進行PCR擴增。PCR擴增反應體系為25 μL：10×PCR Buffer 2.5 μL，0.25 mmol/L dNTP 1 μL，5 U/μLTaqDNA 聚合酶(Takara)0.2 μL，10 μmol/L上下游引物各0.5 μL，50 mg/μL模板DNA 0.5 μL，加超純水至總體積25 μL。PCR擴增程序：94℃ 4 min；94℃ 40 s，55℃ 1 min，72℃ 1 min，30個循環；72℃ 10 min，4℃保存。由上海生物工程有限公司檢測擴增產物的DNA片段序列。測序結果經NCBI數據庫進行Blast比對后，運用MEGA 7軟件，N-J法建立系統發育樹(自舉值Bootstrap分析采用1 000次重復抽樣)。

1.2.5 拮抗菌的安全性驗證

試驗前，將拮抗菌株接種到LB培養基中進行發酵培養并制備菌懸液。將購買的魚苗置于魚缸中適應性暫養2 d(25℃，充氣)。魚苗隨機分成兩組，每組設置3個重復，每個重復50尾魚苗。第一組加入拮抗菌株發酵液，菌液終濃度為1×104cfu/mL；第二組為對照組，加入等體積的無菌LB液體培養基。試驗期間水溫控制在25℃左右，充氣。連續6 d觀察魚苗的存活情況；及時撈出死魚。

1.2.6 拮抗菌的拮抗性驗證

選取體長約為15 cm的鯉魚，在魚樣體表人工創傷大小相等的傷口(約面積0.5 cm2，深2～3 mm)。試驗分成兩組，均加入終濃度為103cell/mL水霉孢子懸液。第一組加入終濃度為1×104cfu/mL的拮抗菌懸液；第二組為對照，加入等體積的無菌LB液體培養基(每組設置三個重復，每個重復20條鯉魚)。試驗期間水溫控制在25℃左右，充氣。連續7 d觀察魚體的感染情況(體表發現菌絲判定為感染)；及時撈出死魚。

1.2.7 拮抗菌拮抗穩定性驗證

將原代菌劃線于新的牛肉膏蛋白胨培養基平板上，于37℃培養24 h后進行傳代，共傳10代。測定菌落邊緣至平板邊緣的距離(mm)，觀察拮抗菌的拮抗活性變化。

1.2.8 拮抗菌的抗菌譜測定

以實驗室前期分離得到的10株水霉菌進行抗菌譜測定：將6 mm水霉菌瓊脂塊接種于無菌PDA培養基中央，活化后的拮抗菌株進行發酵培養，采用濾紙片法，在距離水霉瓊脂塊25 mm處，用移液槍吸取40 μL拮抗菌發酵液于滅菌濾紙片上，分別對10株上述活化處理的水霉病原菌株進行拮抗譜試驗，于25℃恒溫倒置培養72 h，觀察拮抗效果；空白作為對照(無接種細菌)。拮抗范圍測定所用指示菌均由實驗室分離，經形態學及分子鑒定均為不同種屬。

1.3 數據處理

使用SPSS 22軟件One-way ANOVA法進行統計學分析，P<0.05為差異顯著；使用GraphPad Prism 5軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 拮抗菌初篩及純化

從健康鯉體表獲得鱗片的菌懸液中共獲得50株細菌，經濾紙片平板對峙試驗，發現其中1株細菌對水霉病原菌LF04菌株具有很強的抑制性，將此細菌菌株編號為JL50；對照組LF04菌株長滿培養皿。圖1

圖1 拮抗菌JL50的拮抗效果
Fig.1 Antagonistic effect of antagonistic JL50

2.2 拮抗菌株的鑒定

2.2.1 JL50菌株形態觀察

JL50菌株在牛肉膏蛋白胨培養基上培養24 h后，其菌落表面相對光滑、半透明；在油鏡下觀察其革蘭氏染色為陽性，呈細短桿狀。圖2

2.2.2 JL50菌株生理生化特性

JL50菌株經生化實驗觀察為需氧型細菌，可利用乳糖、麥芽糖、蔗糖、葡萄糖發酵生長，油脂及淀粉水解試驗結果為陰性，菌株部分生理生化特征見表1。對照細菌系統鑒定手冊，初步鑒定該菌株為芽孢桿菌科，芽孢桿菌屬，短小芽孢桿菌(Bacilluspumilus)。表1

圖2 拮抗菌JL50革蘭氏染色(×1 000)
Fig.2 Gram stain of antagonistic JL50(×1,000)

表1 拮抗菌JL50的生理生化性質
Table 1 Physiological and biochemical properties of antagonistic JL50

生化實驗 Biochemical experiment試驗結果 Result生化實驗 Biochemical experiment試驗結果 Result油脂分解試驗Oil decomposition-吲哚試驗 Indole test+明膠水解試驗Gelatin hydrolysis+甲基紅試驗 Methyl red test+尿素水解試驗Urea hydrolysis+伏-普試驗 Volt-general test+淀粉分解試驗Starch decomposition-H2S試驗 H2S test-乳糖發酵Lactose fermentation+檸檬酸鹽試驗 Citrate test+麥芽糖發酵Maltose fermentation+穿刺培養試驗 Puncture culture+蔗糖發酵Sucrose fermentation+好氧性試驗 Aerobic test需氧葡萄糖發酵Glucose fermentation+適宜pH試驗 Optimal pH5～8適宜溫度試驗 Optimal temperature10～45℃試管液體靜止培養 Static culture+

注: “+”表示陽性，“-”表示陰性

Note: "+" is positive, and "-" is negative

2.2.3 JL50菌株基因同源性鑒定

根據測序結果可知，JL50菌株16S rDNA序列長度為1 455 bp，通過與NCBI中8模式菌株的16S rDNA 序列比對分析和系統發育樹的構建， JL50菌株與短小芽孢桿菌Bacilluspumilusstrain ATCC 7 061 (GenBank 登錄號NR 043242) 同源性最近，相似性為100%。綜合菌株的培養特征、形態和生理生化特征及16S rDNA序列分析結果，判定該菌株為短小芽孢桿菌Bacilluspumilus。圖3

圖3 鄰接法構建JL50菌株 16S rDNA 序列系統發育樹
Fig.3 Phylogenetic analysis of 16S rDNA sequences by neighbor-joining method

2.3 JL50菌株拮抗特性

2.3.1 JL50菌株對魚苗的安全性

研究表明，隨著試驗的進行，實驗組和對照組存活率均呈下降趨勢。試驗組與對照組魚苗的存活率在第1 d和第2 d無顯著差異(P>0.05)，但隨著試驗天數的增加。試驗6 d后，實驗組存活率為73%，而對照組存活率僅為61%，差異顯著(P<0.05)。圖4

圖4 魚苗的存活率
Fig.4 The survival rate of the fry

2.3.2 JL50菌株拮抗活性

研究表明，試驗第1 d，對照組與實驗組均未出現水霉感染；試驗第2 d，對照組和實驗組開始出現水霉感染現象，對照組和實驗組感染率分別為8.3%和1.7%；試驗第4 d，對照組和實驗組感染率分別為36.7%和13.3%；試驗7 d時，實驗組累積感染率為53.3%，對照組累積感染率為95%，實驗組與對照組差異顯著(P<0.05)。圖5

圖5 鯉魚7 d感染率
Fig.5 The 7 d infection rate of carp

2.3.3 JL50菌株拮抗穩定性

為了獲得JL50菌株的拮抗穩定性，將JL50菌株進行傳代培養，共傳代10代。原代菌對水霉的抑制率為61.3%，經過10次傳代以后，其抑制率為63.6%。JL50菌株在傳代過程中，其拮抗活性比較穩定，無較大波動，拮抗活性在62%上下變動。圖6

圖6 傳代次數與菌絲抑制率關系
Fig.6 Relationship between the number of passages and the inhibition rate of mycelium

2.3.4 JL50菌株拮抗范圍

研究表明，拮抗菌JL50對水霉LF01和水霉LF04拮抗作用明顯，其拮抗譜較窄，僅對特定的水霉病原菌有拮抗性。圖7

注：供試水霉菌株編號：A:LF01 B:LF04 C:HL01 D:HL04 E:JY06 F:JY07 G:JY10 H:LY04 I:HZ J:HZ04 培養皿中心為供試水霉瓊脂塊，蘸有拮抗菌發酵液的濾紙片置于距瓊脂塊25 mm處

Note: the number of the tested Saprolegnia strains. A:LF01 B:LF04 C:HL01 D:HL04 E:JY06 F:JY07 G:JY10 H:LY04 I:HZ J:HZ04 The center of the culture dish is to test the Saprolegnia strains agar block, and the filter paper dipped in the fermentation liquid of antagonistic bacteria is placed at 25 mm away from the agar block

圖7 JL50菌株抑制效果實驗
Fig.7 The inhibitory effect of strain JL50

3 討 論

水霉病是養殖業中危害較大的真菌性疾病之一，新疆由于其水域的特殊性，水溫常年較低，有利于水霉菌的爆發與傳播；且部分地區水質鹽堿度較高，對于潑灑氯化鈉等防治方法較耐受，故尋找更為有效的水霉病防治方法需求急迫[7]。利用生物間的拮抗作用，進行疾病防止已被廣泛應用。其中利用拮抗菌對水霉菌進行的研究也有相關報道，Lategan等[13-14]發現中間氣單孢菌(Aeromonasmedia)A199菌株可以用于治療人工感染水霉的澳洲鰻鱺(AnguillaaustralisRichardon)及自發感染水霉的銀鋸鯻(Bidyanusbidyanus)，并取得了一定效果；Kentaro Takada[15]發現鏈霉菌KS84中含有可以抗寄生水霉(Saprolegniaparasitica)的物質，并解析了其結構。張書俊等[16]發現從水霉病害水體中分離的黏質沙雷氏菌(Serratiamarcescens)能產生幾丁質酶，其對水霉菌絲生長及孢子萌發具有明顯的抑制作用；呂利群等[17]從養殖水體附近的土壤中分離得到的解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)Sh1菌株，能明顯抑制水霉菌菌絲的生長，并驗證了其活性成分非蛋白質且熱穩定性好；劉莉莉等[9]從枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)TCCC11201菌株的發酵液中分離的粗蛋白，對水霉病原菌具有很強抑制作用；趙春暉等[18]發現在功能性拮抗菌芽孢桿菌(Bacillusspp)TCCC11322菌株的培養上清液中，存在有明顯抑制水霉生長的分泌性蛋白成分；陳飄等[19]從健康的養殖水體底泥中分離得到了鏈霉菌屬(Streptomycetesp.)的3株拮抗放線菌，均能抑制對水霉菌絲的生長，且對抑制水霉生長具有協同作用。以上研究均證明，利用拮抗菌防治魚類水霉病具有可能性。

短小芽孢桿菌對水產弧菌有一定拮抗作用[20-21]，作為復合型益生菌中的一員在魚類養殖中已經有廣泛的應用[22]，具有促進飼料利用效率[23]，提高魚類抗病力，減少魚類疾病發生[24-26]，改善養殖環境，調節養殖水質，維護微生態平衡[27]等特點，但國內尚未見短小芽孢桿菌對水霉病原菌拮抗的報道，試驗結果不僅為魚類水霉病的生物防治提供了依據，還為短小芽孢桿菌作為水產養殖的益生菌的作用進行了拓展，擴大了其應用范圍；為益生菌可作為拮抗菌的應用探索提供了思路。

4 結 論

研究從健康鯉魚體表分離得到1株對水霉病原菌有顯著抑制作用的拮抗菌JL50，經鑒定該拮抗菌為短小芽孢桿菌，該菌株可顯著抑制特定水霉病原菌的生長(P<0.05)，并能顯著提高鯉魚苗的成活率(P<0.05)，且該菌株傳代穩定性好，對水霉病原菌的拮抗譜較窄，針對性較強。