基于D-101大孔吸附樹脂分離純化新疆石榴皮中的總黃酮

孟新濤，魏 健，張 婷，李德華，譚 歸，朱麗娜，邵文志，潘 儼

(1.新疆農業科學院農產品貯藏加工研究所， 烏魯木齊 830091；2.新疆主要農副產品精深加工工程技術研究中心，烏魯木齊 830091;3.喀什大學生命與地理科學學院，新疆喀什 844006；4.食品科學與藥學學院，新疆農業大學，烏魯木齊 830052)

0 引 言

【研究意義】石榴(PunicagranatumL.)是新疆特色水果之一，屬石榴科(Punicaceae)石榴屬(PunicaL.)植物，具有極高的營養價值及醫用保健功能，富含維生素、微量元素、氨基酸及蛋白質等物質[1-2]，其中VC含量高達11 mg/100g；石榴同時具有良好的抗氧化、調節血脂、消食化積、預防動脈粥樣硬化和癌癥等功效[3-5]。黃酮類化合物是石榴果實中具有醫療保健作用的主要成分，然而石榴可食部分只占鮮石榴的40%，而皮占其總重超過30%[2-3]，對石榴果皮中副產物開發再利用，具有重大的現實意義。【前人研究進展】目前關于黃酮類化合物的提取方法較多[6-8]，常用方法主要有硅膠柱色譜法、氣相層析法、高效液相色譜法、微孔薄層色譜法和聚酰胺層析法等[9-13]，這些方法都存在一些分離純化效果不佳、成本高及環境污染嚴重等問題，因此,選擇一種分離純化效果好、成本低及環境污染小的純化黃酮類化合物方法亟待解決。大孔吸附樹脂在黃酮類化合物的純化中被廣泛應用[14-16]。根據分子結構大孔吸附樹脂可分為非極性、中等極性和極性三種，分離純化物可根據自身極性大小，選擇與之相適應的樹脂結構，已達到較佳分離純化的目的。大孔吸附樹脂法純化黃酮類化合物，主要通過對黃酮類化合物有選擇性吸附作用的大孔吸附樹脂，將水溶液中的黃酮類化合物與其它物質分離而達到純化。【本研究切入點】前期提取石榴皮中總黃酮時發現，石榴皮提取液中總黃酮提取得率隨著乙醇濃度和提取溫度的增加反而降低，根據“相似相溶”原理，石榴皮中可能存在的黃酮類化合物極性較大的結論[3]，故石榴皮中黃酮類物質生成氫鍵的能力較強，有利于非極性大孔樹脂分離純化，選擇D-101型大孔吸附樹脂，并優化其對新疆石榴皮總黃酮的工藝條件，為生產中更加有效充分的利用石榴附產物，提供依據。

1 材料與方法

1 .1 材 料

1.1.1 石榴

新疆石榴，購買于烏魯木齊南昌路北園春市場；槲皮素(純度≥98%)，北京世紀奧科生物技術有限公司；乙醇、石油醚，天津市致遠化學試劑有限公司，分析純。D101大孔樹脂，上海藍季生物。

1.1.2 儀器與設備

UV 260紫外-可見分光光度計日本島津公司；旋轉蒸發儀，上海亞榮旋轉蒸發；德國eppendorf；IKA?A 11基本型研磨機，廣州儀科實驗室技術有限公司；pHS-3C 型酸度計，上海雷磁儀器廠；THZ-82 恒溫振蕩器，常州國華電器有限公司； SK720H型超聲波清洗器，上?？茖С晝x器有限公司。

1.2 方 法

1.2.1 石榴皮中總黃酮檢測

石榴皮中總黃酮的測定采用槲皮素作為對照品的紫外分光光度計法。

1.2.2 標準曲線繪制

將槲皮素標準品在95℃干燥箱中干燥至恒重，精密稱取2.0 mg，用30%乙醇溶解，定容至50 mL容量瓶中，得濃度為0.04 g/L的槲皮素標準品溶液。取槲皮素對照品溶液1.0 、1.5、2.0、2.5、3.0和3.5 mL，分別對應濃度為0.004、0.006、0.008、0.01、0.012和0.014 g/L。30%乙醇定容至于10 mL容量瓶中，在372 nm處，利用紫外分光光度計法測定槲皮素濃度(C)與吸光度(A)之間的關系。分析得：A=0.057 97C+0.028 26R2=0.998 5。

1.2.3 石榴皮中總黃酮的提取及含量測定

利用隨機質心映射優化法(RCO)經過兩輪循環[3]后得出超聲波法提取石榴皮中黃酮類物質較佳工藝：乙醇濃度為87%、超聲時間為37 min、提取溫度為59℃、料液比為1∶24 (g/mL)。得出新疆石榴皮中總黃酮的提取得率為7.25%。

1.2.4 D-101大孔樹脂的預處理

按照文獻[17]稍作修改，將D-101大孔樹脂中的破碎樹脂剔除，用蒸餾水浸泡，攪拌使其破碎樹脂及雜物漂浮，洗去雜物。95%乙醇浸泡48 h使其溶脹，期間充分攪拌趕出氣泡，再用蒸餾水洗至無醇味。用4% HCl溶液浸泡樹脂2 h，抽濾，而后用去離子水以同樣流速洗至出水pH值為中性；再用4%NaOH溶液浸泡樹脂2 h，抽濾，用去離子水以同樣流速洗至出水pH值中性晾干，備用。

1.2.5 D-101大孔吸附樹脂靜態吸附實驗1.2.5.1 D-101大孔吸附樹脂靜態吸附率測定

將預處理好的樹脂抽濾自然晾干，準確稱取2.00 g干樹脂，裝入100 mL具塞錐形瓶中，精確加黃酮溶液10.00 mL(濃度為7.587 mg/g)，搖勻后恒溫振蕩24 h(溫度30℃，轉速為150 r/min)，抽濾。取濾液測定黃酮類化合物的含量，計算吸附量和吸附率。吸附量和吸附率計算公式如下：

吸附量(mg/g濕樹脂)

式中：C0—吸附前黃酮溶液濃度(mg/g)；C1—吸附后溶液中剩余黃酮溶液濃度(mg/g)；W—樹脂質量(g)；V—吸附液體積(mL)。

1.2.5.2 D-101大孔吸附樹脂靜態解析率

將吸附飽和樹脂，置于100 mL具塞錐形瓶中，精確加入20 mL 95%乙醇，恒溫振蕩24 h后過濾，測定濾液中黃酮類物質的含量。按照下式計算解析率。

C0—吸附前黃酮化合物溶液濃度(mg/g)；C1—吸附后溶液中剩余黃酮化合物溶液(mg/g)；C2—解析后溶液中剩余黃酮化合物溶液(mg/g)。

1.2.5.3 pH值對D-101大孔吸附樹脂吸附能力的影響

準確稱取5 g D-101大孔吸附樹脂，分別加入20.00 mL黃酮類化合物溶液，用pH計分別調節溶液pH值為3、4、5、5.53，30℃搖振24 h，測定樹脂靜態吸附量，分析不同pH值對黃酮類化合物的影響。

1.2.5.4 料液比對D-101大孔吸附樹脂吸附能力的影響

稱取處理過的干樹脂2.00 g，裝入6只100 mL具塞錐形瓶中，按吸附料液比為1∶2，1∶4，1∶6，1∶8，1∶10，1∶15，1:20(黃酮類物質溶液：大孔吸附樹脂，mg/L)依次加入黃酮類物質(pH值為試驗驗證最佳值)，恒溫振蕩(30℃，轉速為150 r/min)24 h，過濾，測出濾液中黃酮類物質的含量，計算吸附率，比較得到最佳料液比。

1.2.5.5 溫度對D-101大孔吸附樹脂吸附能力的影響

取2 g/L的黃酮標準溶液各100 mL，加入5 g已預處理好的濕樹脂，控制溫度為25、30、35、40、45和50℃，靜態吸附(搖床振蕩)10 h，測定樹脂靜態吸附量，分析溫度對黃酮溶液的影響。

1.2.5.6 D-101大孔吸附樹脂靜態吸附動力學

準確稱取6.00 g D-101大孔吸附樹脂，加入黃酮溶液(質量濃度為7.587 33 mg/g)20.00 mL，搖勻后靜置，每1 h取上清液測定吸光值，連續取樣12 h，計算剩余溶液的濃度。以取樣時間點為橫坐標，吸附量為縱坐標，作D-101大孔吸附樹脂靜態吸附動力學曲線。

1.2.6 D-101大孔吸附樹脂動態吸附和洗脫

先將一塊玻璃棉裝入內徑13 mm、高300 mm的玻璃層析柱底端，以防止柱子堵塞；準確稱取預處理后備用樹脂6.00 g，將樹脂緩緩加入柱子，邊裝柱邊用洗耳球敲打柱壁，以使大孔樹脂壓緊擠出氣泡。加入10 mL黃酮化合物溶液(7.587 mg/g)，進行動態吸附實驗。

在室溫條件下，取已經吸附平衡的樹脂裝填于玻璃層析柱中進行洗脫實驗，以每5 mL為單位收集流出液，繪制洗脫曲線，分析不同濃度洗脫液和不同洗脫流速對黃酮類物質脫附的影響，確定最佳洗脫條件。

1.2.7 正交試驗

D101大孔吸附樹脂純化石榴皮總黃酮優化設計在考察單因素試驗基礎上，選擇影響大孔樹脂純化總黃酮的幾個主要因素：溫度、洗脫液體積、pH值、料液比。表1

表1 D101大孔樹脂純化石榴皮黃酮工藝正交試驗因素及水平
Table 1 Factors and levels of orthogonal test for purification of pomegranate bark from patrinia with macroporous resin

水平LevelA溫度TemperatureB pHC 洗脫液體積%Exhaust volume%D 料液比Material ratio1303851∶22354901∶43405951∶6

1.3 數據處理

用Excel 2003處理試驗數據，Origin 8.0作圖。

2 結果與分析

2.1 D-101大孔吸附樹脂靜態吸附影響因素

2.1.1 pH值對D-101大孔吸附樹脂吸附能力

研究表明，pH值D-101大孔吸附樹脂吸附能力的影響較大，樣液pH為3～4時，樹脂對石榴皮中黃酮的吸附容量達到較大值，吸附量為25.74 mg/g?？赡苁怯捎邳S酮類化合物在pH為3～4時，分子結構中的輕基酚多以分子狀態存在，根據范德華力的作用，黃酮類物質與樹脂發生物理吸附，達到較高的吸附效果，隨著pH值升高，酸性條件減弱，黃酮類物質以離子的形狀態存在，與吸附樹脂不能較好結合。但當pH為2時，吸附量為19.02 mg/g，吸附率較低，是因為黃酮分子結構中的酚輕基生成烽鹽而導致其溶解[17-18]，在強酸催化下發生水解所致，所以選擇pH值為3～4為宜。圖1

圖1 不同pH下D-101大孔吸附樹脂吸附能力變化
Fig.1 Effect of pH of sample solution on adsorption ratio of D-101 macroporous adsorption resin

2.1.2 料液比對D-101大孔吸附樹脂吸附能力的影響

研究表明，D-101大孔吸附樹脂對石榴皮中黃酮的吸附能力隨料液比的增加呈先增后降的趨勢。料液比(樹脂：黃酮溶液體積(g:mL))在1∶2到1∶4，隨料液比的增加，吸附能力增大；料液比在1∶4到1∶15，隨料液比的增加，吸附能力降低?？赡苁钱旤S酮濃度過大時，大孔吸附樹脂的選擇性降低，而黃酮溶液濃度較低時，吸附不夠完全所致。D-101大孔吸附樹脂對石榴皮中黃酮含量的吸附最大容量為1∶4。 圖2

圖2 不同料液比下D-101大孔吸附樹脂吸附能力變化
Fig.2 Effect of sample solution volume/D-101 resin weight ratio adsorption ratio of D-101 macroporous adsorption resin

2.1.3 溫度對D-101大孔吸附樹脂吸附能力的影響

研究表明，當溫度為30℃時，吸附率較高，隨著溫度的升高，吸附量下降，這是由于溫度升高，打破了吸附平衡。圖3

圖3 不同溫度下D-101大孔吸附樹脂吸附能力變化
Fig.3 Effect of temperature of sample solution on adsorption ratio of D-101 macroporous adsorption resin

2.1.4 D-101大孔吸附樹脂靜態吸附動力學

研究表明，D-101大孔吸附樹脂對石榴皮中黃酮溶液的靜態吸附平衡時間較慢，在1～6 h取樣測定時，吸附量基本保持不變，后續吸附量開始迅速增大，到10 h之后吸附量逐漸接近平衡。圖4

圖4 D-101大孔吸附樹脂靜態吸附動力學曲線
Fig.4 Static adsorption curve of D-101 macroporous adsorption resin towards total flavonoids from citrus peel

2.2 動態吸附和洗脫

2.2.1 動態吸附過程考察D101型樹脂對黃酮溶液的吸附穿透曲線

在室溫下，稱取5 g預處理好的樹脂，濕法裝柱，上樣液pH值為4，黃酮溶液濃度為0.03 mg/mL，控制0.25 mL/min的流速，測定層析柱的穿透曲線。當黃酮溶液的上柱體積為160 mL時，檢測到流出液濃度達到0.03 mg/mL，此時達到飽和。圖5

圖5 穿透曲線
Fig.5 Breakthrough curve

2.2.2 最佳洗脫液體積分數的確定

根據前期試驗可知[3]，當乙醇濃度為87.9%時，黃酮類化合物的提取率較高，在乙醇-水溶劑中溶解性較高，另外D101大孔吸附樹脂是弱極性，所以選擇乙醇-水作為洗脫液。利用上述上樣液的最佳pH、料液比、溫度條件，依次用體積分數為20%、30%、50%、60%、80%、90%和95%的乙醇溶液各30 mL在相同的流速下進行等度洗脫，收集洗脫液測定含量，繪制曲線。

乙醇溶液體積分數較高時對樹脂的解吸附效果最好。乙醇體積分數過低時對樹脂的解吸附效果不太理想，這是因為D101大孔吸附樹脂是弱極性，低濃度乙醇極性較大，根據相似相容原理，選擇極性較小的洗脫液效果較好，90%和95%的乙醇溶液洗脫效果相差不大，從節約環保角度考慮，選擇90%乙醇溶液作為洗脫液。圖6

圖6 不同洗脫液體積下大孔樹脂解吸附率變化
Fig.6 Effect of Elution volume on desorption ratio of D101 macroporous adsorption resin

表2 正交試驗結果
Table 2 The result of orthogonal test

試驗號 NumberA溫度Temperature(℃)B pHC洗脫液體Exhaust volume(%)D料液比Material ratio(g:mL)純化率Purification rate(%)1303801:216.32304901:417.933051001:612.64353901:614.453541001:213.96355801:412.574031001:414.28404801:613.19405901:28.9K115.60014.96713.96713.033K213.60014.96713.73314.867K312.06711.33313.56713.367R3.5333.6340.4001.834

2.3 D101大孔樹脂純化石榴皮總黃酮正交試驗

試驗因素的影響大小為：pH(B)>溫度(A)>料液比/%(D)>洗脫液體積(C)，最優工藝為：B2A1D2C2，即提取液pH為4、溫度30℃、料液比1∶4(g/mL)、洗脫液乙醇體積為90%。表2

2.4 驗證試驗

按照上述較佳純化工藝：提取液pH為4、溫度30℃、料液比1∶4(g/mL)、洗脫液乙醇體積為90%，對石榴皮中黃酮類物質進行純化，計算純度。D101大孔吸附樹脂純化后石榴皮黃酮含量由7.25 mg/g提高到17.32 mg/g，較純化前提高2倍。表3

表3 D101大孔吸附樹脂純化前后石榴皮中黃酮提取率比較
Table 3 Before and after comparison of flavonoid extraction rate in the peel of purified Pomegranate by D101 macroporous resin

樣品名稱WSample純化前 Prior to purification純化后Purified石榴皮 2.0 gPomegranate skin吸光值濃度0.3920.005 1110.1130.001 4610.1080.001 375原液濃度(mg/mL)0.290 0ω0.255 60.073 120.068 80平均值ω(%)7.25吸光值濃度0.2290.003 4620.2280.003 4450.2300.003 479原液濃度(mg/mL)0.692 5ω0.173 20.172 30.174 0平均值ω(%)17.32

*標準曲線：A=0.057 97C+0.028 26，R2=0.998 5;*ω(%)=(C×V×D/W)×100，式中C為樣品溶液質量濃度(mg/mL)；V為所測樣品溶液總體積(mL)；D為所測樣品溶液稀釋倍數；W為樣品質量(g)

Standard curve:A=0.057 97C+0.028 26，R2=0.998 5 ω(%)=(C×V×D/W)×100，Cis the mass concentration of the sample solution(mg/mL)；Vis the total volume of the sample solution measured(mL);Dis the dilution multiple of the sample solution measured;Wis the sample quality(g)

3 討 論

應用大孔吸附樹脂分離純化有效成分在中藥產品研究和產業化生產等領域具有十分廣闊的前景，與其他純化方法相比較，在富集有效成分、減少雜質方面顯示出其優越性[17]。樹脂的吸附能力由樹脂孔徑、比表面積、表面電性或形成氫鍵等綜合性能決定，一般情況下，非極性吸附樹脂適合從極性溶液吸附非極性物質，反之亦然。團隊在前期提取石榴皮中總黃酮時發現，石榴皮提取液中總黃酮提取得率隨著乙醇濃度和提取溫度的增加反而降低，根據"相似相溶"原理，得出石榴皮中可能存在的黃酮類化合物極性較大的結論[3]，故石榴皮中黃酮類物質生成氫鍵的能力較強，有利于非極性大孔樹脂分離純化，因此,研究選擇D-101型大孔吸附樹脂。實驗對D-101大孔吸附樹脂的靜態吸附與pH、吸附料液比、溫度的關系進行了考察，樣液pH為3～4時，吸附料液比為1∶4(g/mL)，溫度30℃時樹脂對石榴皮中黃酮的吸附容量達到較大值，與吳斌[17]等采用柱層析方法分離純化籽瓜中L-瓜氨酸的研究結果不一致，這可能與分離純化的樣品不同有關。研究針對于單因素試驗結果，對D101大孔樹脂純化石榴皮總黃酮設計正交試驗驗證，得出試驗因素的影響大小為：pH>溫度>料液比/%>洗脫液體積，這可能是由于黃酮類化合物的分子結構比較特殊，輕基酚在不同的pH下，以分子狀態或烽鹽存在，故pH的影響較大[18-19]。

石榴皮作為石榴副產物，在石榴產品加工中石榴皮大部分被丟棄，沒有使石榴附產物得到很好的再利用，造成新疆石榴資源的嚴重浪費[2]。因此，研究新疆石榴皮黃酮分離純化方法，為新疆石榴綜合利用的品種篩選、原料檢測分級、深加工和功能食品的研發等提供理論依據。

4 結 論

通過對D101大孔吸附樹脂的研究，采用靜態和動態吸附-解析兩種方法，確定最佳分離純化石榴皮中黃酮類物質的條件為溫度30℃、吸附料液比1∶4(g/mL)、pH為4、洗脫液體積為90%，在此條件下，黃酮類物質的吸附量較大，洗脫集中，洗脫液用量較少。在此工藝下，石榴皮提取物黃酮類化合物含量由7.25 mg/g增加到17.32 mg/g。該工藝簡單可行，可用于石榴皮中黃酮類化合物的分離純化。