梭梭14-3-3蛋白基因HaFT-9的克隆及特性分析

劉栓栓，王 波，宗興風，王 嬌，王新奇，姚正培，任燕萍，張 樺,2

(1.新疆農業大學農學院，烏魯木齊 830052；2.新疆農業大學干旱區荒漠研究所,烏魯木齊 830052)

0 引 言

【研究意義】14-3-3蛋白是高度保守的調節蛋白，參與激素信號轉導等代謝調節過程[1]，在植物響應干旱、高鹽、高溫等非生物脅迫以及生物脅迫[2]中發揮重要作用。梭梭(Haloxylon ammodendron)為藜科梭梭屬多年生灌木或小喬木，主要分布于我國西北荒漠和半荒漠地區，具有較強的抗旱、抗寒、耐鹽堿、耐高溫、耐瘠薄等能力[3]，是荒漠地區主要的建群種，在荒漠地區防風固沙、保護生態環境、改善小氣候等多方面具有重要作用[4]。研究梭梭14-3-3蛋白功能，不僅有助于從調節蛋白這個側面理解梭梭抗逆適應性的分子機制，為作物抗逆基因工程提供新的基因來源，同時對選育和篩選抗逆梭梭植株，加快生態治理進程具有重要意義。【前人研究進展】14-3-3蛋白最早在牛腦組織中被發現，根據其在DEAE層析后所分離組分的片段數及在淀粉凝膠電泳中的遷移率而得名[5, 6]，該蛋白在植物體內主要以同源或異源二聚體的形式形成特殊的槽狀結構，進而結合相應的磷酸化靶蛋白[7]，序列由較高變異性的N端和C端，以及保守的核心區域組成，其中N端是決定它能否形成二聚體的關鍵區域[8,9]。它能夠以序列特異性和磷酸化依賴的方式與眾多的靶蛋白結合并通過改變靶蛋白的活性、穩定性、構象、亞細胞定位或者與其他蛋白的親和力來調控靶標的信號轉導[9]，參與代謝調控、細胞周期調控、轉錄、應激反應等一系列生物過程[10]。研究表明,過表達小麥與擬南芥14-3-3基因，可以提高植株對干旱和鹽脅迫的耐受能力，減弱植株的萎蔫程度[11, 12]。植株可在逆境條件下，利用14-3-3蛋白降低質膜H+-ATPase復合物的活性，從而降低質子泵活性，并關閉氣孔進而來提高植物的抗旱性[13]，同時擬南芥還可通過兩種不同結構的14-3-3蛋白與SOS2的相互作用抑制SOS2的活性，進而抑制正常生長條件下植物的SOS通路，而鈉離子可以通過降低14-3-3蛋白與SOS2的相互作用來激活SOS通路，提高植株耐鹽能力[14]。14-3-3蛋白還可參與激素信號通路的調控，該蛋白通過與OsBZR 1相互作用改變OsBZR 1的催化活性，從而導致BR敏感性降低、BR應答基因表達改變[15]。水稻14-3-3蛋白基因OsGF14e被鈣依賴蛋白激酶OsCPK 21磷酸化后促進水稻幼苗對ABA和鹽脅迫的響應[16]。前期對梭梭進行干旱和高溫的轉錄組測序，在差異表達的unigene中通過序列比對篩選了9個14-3-3蛋白基因，命名為HaFT-1～9，已克隆了與干旱和鹽脅迫相關的HaFT-1、HaFT-2[17]，HaFT-5和HaFT-6[18]基因。【本研究切入點】目前對梭梭抗逆性的研究主要集中在生理[19]和抗旱[20]機制方面，對梭梭耐高溫的研究少有報道。研究前期對梭梭幼苗模擬地表高溫脅迫后進行轉錄組測序，轉錄組數據分析表明，14-3-3蛋白基因HaFT-9在高溫脅迫后表達上調，推測該基因可能與梭梭響應高溫脅迫有關，因此，以研究梭梭14-3-3蛋白基因功能為切入點，探討其表達特性和結合活性，進而理解其調控功能，有助于解析梭梭耐高溫的分子機制。【擬解決的關鍵問題】研究梭梭14-3-3蛋白基因HaFT-9在非生物脅迫和激素處理后的表達模式，特別是對高溫脅迫適應的響應模式，分析HaFT-9蛋白的結合特性。

1 材料與方法

1.1 材 料

梭梭種子采集于新疆吉木薩爾育苗場，自然環境干燥后在-20℃冰箱保存備用。

1.2 方 法

1.2.1 梭梭幼苗處理

1.2.1.1 干旱脅迫、鹽脅迫以及激素處理試驗

在超凈工作臺內，梭梭種子經75%乙醇消毒30 s，無菌水沖洗3次，再用1%次氯酸鈉消毒15 min，無菌水沖洗6次后，將種子點播于1/2 MS固體培養基上。種子置于26℃恒溫箱中培養30 d，光照強度為900～1 260 μmol/(m2·s)，晝夜光照周期16 h/8 h。將生長30 d的梭梭幼苗轉移至具有20% PEG6000、200 mmol/L NaCl、100 μmol/L ABA和20 μmol/L IAA的溶液中(ddH2O配置)，在脅迫不同時間段(0 h、1 h、3 h、6 h、12 h、24 h)對幼苗同化枝取樣，樣品迅速置于液氮速凍，-80℃冰箱保存備用。

1.2.1.2 模擬地表高溫脅迫試驗

俞闐[21]通過模擬地表高溫脅迫發現地表高溫是引起梭梭幼苗死亡的主要原因之一，同時發現兩年生幼苗對高溫的耐受性明顯強于一年生幼苗。試驗利用電熱線恒溫加熱梭梭苗與地表接觸位置，對一年生和兩年生梭梭幼苗進行模擬地表高溫脅迫。1年生梭梭幼苗經40和55℃連續處理24 h后，停止高溫脅迫并置于30℃復原，同時對梭梭同化枝在不同時間點(0 h、2 h、12 h、24 h、3 d、6 d、15 d)取樣；2年生梭梭幼苗經55和65℃連續處理48 h后，停止高溫脅迫置于30℃復原，同時對梭梭同化枝在不同時間點(0 h、2 h、24 h、48 h、7 d、10 d、19 d)取樣。

1.2.1.3 高溫脅迫適應性試驗

將26℃恒溫下生長30 d的梭梭幼苗，進行以下兩種生長脅迫模式處理。試驗組脅迫模式為：正常生長條件下的幼苗置于26℃ 3 d(常溫對照，CK)→37℃ 1 h(高溫預處理，S1)→26℃ 3 d(第1次常溫復原，R1)→45℃ 1 h(高溫脅迫處理，S2)→26℃ 7 d(第2次常溫復原，R2)；對照組脅迫模式為：將正常生長條件下(CK’)的幼苗置于45℃ 1 h處理(S2’)后，直接進行26℃ 7 d復原(第1次常溫復原，R2’)，在8個時間點 (CK、S1、 R1、S2、R2、CK’、S2’、 R2’)對梭梭幼苗同化枝取樣，即試驗組比對照組多一項37℃預脅迫處理，以期分析高溫預處理后基因表達變化。

1.2.2HaFT-9基因的克隆

利用全式金Trizol提取45℃高溫脅迫1 h梭梭幼苗的RNA，使用反轉錄試劑盒TaKaRa FirstSrtand cDNA Synthesis kit進行cDNA第一鏈的合成。

從梭梭高溫轉錄組測序拼接得到標注為14-3-3蛋白基因的Unigene序列，將該基因命名為HaFT-9，利用NCBI與DNAMAN 分析得到HaFT-9 ORF全長序列，采用Primer 5.0設計HaFT-9的克隆引物(表1)，以cDNA為模板，進行PCR擴增。反應體系為：10×Buffer (含Mg2+) 5 μL、2.5 mmol/L dNTPs 2.0 μL、上下游引物各1.0 μL、cDNA 模板1.0 μL、Taq酶0.5 μL、其余用ddH20補足至50 μL。反應程序：94℃ 5 min；94℃ 30 s，58℃ 30 s，72℃ 45 s，35個循環；72℃ 10 min；PCR產物切膠回收后連接pEASY-T1 載體，轉化至Trans1-T1大腸桿菌感受態中。

膠回收方法參考Midi Purification Kit(天根生化科技有限公司)試劑說明書， pEASY-T1 載體連接與大腸桿菌轉化參考(北京全式金生物技術有限公司)說明書。表1

表1 PCR引物序列
Table 1 Primer sequences of PCR

基因名稱Gene name引物名稱Primer Name引物序列(5'→3')Primer sequence用途ApplicationHaFT-9HaFT-9FATGGCAACCACCGCACCT克隆引物HaFT-9RCTATGCCTCGTCCATTTGATClone primers

1.2.3 目的基因的生物信息學分析

利用NCBI在線數據庫對HaFT-9基因編碼的氨基酸序列進行搜索以及比對，并使用非在線軟件(clustalx和genedoc)對相似序列進行多序列比對。利用軟件ProtParam(http://web.expasy.org/protparam/)預測蛋白質的理化性質，利用軟件PSIPRED(http://bioinf.cs.ucl.ac.uk/psipred/)預測蛋白質的二級結構，利用軟件SWISS-MODEL(https://swissmodel.expasy.org/interactive/Lmyegg/models/)預測蛋白質的三級結構，利用軟件BaCelLo(http://gpcr2.biocomp.unibo.it/bacello/pred.htm)預測蛋白的亞細胞定位，利用軟件MEGA5.0構建系統進化樹。表2

表2 熒光定量引物序列
Table 2 Realtime fluorescence quantitative primer

基因名稱Gene name引物名稱Primer Name引物序列(5'→3')Primer sequence用途ApplicationHaFT-9HaFT-9qFTACTTTGGGTGAAGAGTCCTACA熒光定量引物HaFT-9qRTTTGATCCTGCATGTCTGATGTRealtime fluorescence quantitative primerHa18sRNA18sRNAFCTCTGCCCGTTGCTCTGATGAT內參基因引物18sRNARCCTTGGATGTGGTAGCCGTTTCReference gene primerHaACT7ACT7FTTGAACCCCAAGGCTAACAGAG內參基因引物ACT7RACGACCAGCAAGATCCAAACGGReference gene primerHaEF-1AEF-1AFCGTGAAGGCGACTCGTTAATTG 內參基因引物EF-1ARGCTTGGAGACGCTTGACAGGACReference gene primer

1.2.4 實時熒光定量PCR分析

將1.2.1中各處理材料提取總RNA后，使用反轉錄試劑盒TaKaRa FirstSrtand cDNA Synthesis kit進行cDNA第一鏈的合成。利用軟件Primer 5.0設計HaFT-9的實時熒光定量PCR引物，模擬干旱脅迫、高溫脅迫和IAA處理的內參基因為Ha18srRNA，高鹽脅迫的內參基因為HaAct7、ABA處理下的內參基因為HaEF-1A[22]，按照SYBR?Premix ExTaqTMII(TaKaRa)進行實時熒光定量PCR，反應體系：SYBR?Premix ExTaqTMII 10 μL，上下游引物各0.8 μL，Rox DyeⅡ 0.4 μL，cDNA 2 μL，其余用ddH2O補足至20 μL。反應程序：95℃ 預變性30 s；95℃ 變性3 s，60℃退火35 s，循環40次。待溶解曲線生成后，采用2-△△CT法，計算HaFT-9基因在不同處理及對照樣品中的表達量。

1.2.5 酵母雙雜交載體構建及互作驗證1.2.5.1 入門克隆載體構建

采用Gateway?系統構建酵母雙雜載體，根據HaFT-9的ORF序列設計入門克隆引物(表3劃線部分為attB位點)，以前期測序正確的pEASY-T1- HaFT-9質粒為模板進行PCR擴增，切膠回收，利用BP酶將回收產物與pDONR221載體連接，轉化Trans-T1感受態細胞，菌落PCR驗證正確的陽性克隆送測序。BP反應方法見Gateway?Technology(Invitrogen)說明書。表3

表3 入門克隆引物
Table 3 Entry cloning primers

基因名稱引物名稱引物序列(5'→3') 用途Gene namePrimer NamePrimer sequenceApplicationHaFT-9HaFT-9pFGGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTCATGGCAACCACCGCACCTA入門克隆引物HaFT-9pRGGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTCTATGCCTCGTCCATTTGATCEntry clone primers

1.2.5.2 AD與BD重組載體構建及互作驗證

pDESTTM32含有GAL 4 DNA結合區為BD載體，pDESTTM22含有GAL 4激活區為AD載體。利用LR酶將目的片段從pDONR221- HaFT-9入門克隆載體重組至BD載體與AD載體，驗證正確的陽性克隆送測序。LR反應方法見ProQuestTMTwo-Hybrid System(Invitrogen)說明書。

將-80℃冰箱保存的酵母菌株MaV203在YPDA固體培養基上劃線培養進行菌體活化，30℃培養2～3 d，挑取單菌落至2 mL YPDA液體培養基，30℃，200 r/min培養24 h。以1∶100的比例加入至30 mL YPDA液體培養基中，30℃，200 r/min培養至OD600為0.8～1.0，用于酵母轉化。BD載體和BD-HaFT-9載體分別轉化酵母菌株Mav203，涂布于SD-Leu培養基與SD-His培養基，進行轉錄自激活驗證。將AD、BD以及構建好的BD-HaFT-9、AD-HaFT-9轉化至酵母MaV203，轉化產物涂板于二缺板(SD-Leu-Trp) 30℃培養2～3 d。將長出的單克隆用蒸餾水稀釋至同一濃度，轉移至三缺板(SD-Leu-Trp-His)培養2～3 d，將三缺板生長的菌落進行X-gal染色，觀察結果。

轉化方法參考Frozen-EZ Yeast Transformation IITM試劑盒

注：M：2K Marker； 1：HaFT-9 PCR 擴增產物

Note: M:2K Marker;1:HaFT-9 PCR amplification products

圖1 梭梭14-3-3蛋白基因的擴增產物
Fig.1 The amplification result ofHaloxylonammodendron14-3-3 protein gene

2 結果與分析

2.1 14-3-3蛋白基因HaFT-9的克隆

梭梭干旱轉錄組拼接得到標注為14-3-3蛋白基因的Unigene序列，根據梭梭的拉丁名中的首字母和14-3-3蛋白名字中的fourteen與three將該基因命名為HaFT-9。以梭梭cDNA為模板進行PCR 擴增，得到與預期片段大小相符的目的條帶，將該條帶切膠回收，與pEASY-T1連接后轉化大腸桿菌感受態，挑取陽性克隆送新疆昆泰銳進行測序。測序結果顯示該基因片段大小為789 bp， NCBI登錄號為API85525。圖1

2.2 目的基因的生物信息學

2.2.1 保守結構域預測及序列比對

NCBI BLAST 結果顯示，HaFT-9基因的ORF為789 bp，編碼262個氨基酸。多重序列比對結果如圖3所示，HaFT-9蛋白序列與所有參與比對的14-3-3 的氨基酸序列和結構都高度保守，與菠菜14-3-3蛋白家族成員的氨基酸序列相似性最高，已達到87.40%，另外與擬南芥和柑橘的相似性分別為77.27%和76.89%。此外14-3-3蛋白與其他物種的14-3-3蛋白家族成員一樣具有保守的酪氨酸激酶磷酸化位點，N-末端和C-末端的蛋白質信號基序。HaFT-9屬于14-3-3蛋白家族。 圖2

注：HaFT-9為梭梭14-3-3蛋白序列；柑橘(XP_006426292.1)；菠菜(KNA23398.1)；擬南芥(XP_020890110.1)

Note:HaFT-9 is a 14-3-3 protein sequence ofHaloxylonammodendron;Trusclementina(XP_006426292.1);Spinaciaoleracea(KNA23398.1);Arabidopsislyratasubsp.lyrata(XP_020890110.1)

圖2 梭梭HaFT-9基因編碼蛋白質的保守結構域預測
Fig.2 The prediction of conserved domains ofHaFT-9 protein genes fromHaloxylonammodendron

圖3HaFT-9基因編碼氨基酸序列與其他植物14-3-3的序列比對
Fig.3 Alignments of theHaFT-9 deduced amino acid sequences with other 14-3-3 proteins from plants

2.2.2 蛋白質的理化性質及亞細胞定位等預測

利用ProtParam在線軟件對HaFT-9 蛋白的理化性質進行分析，結果顯示和HaFT-9蛋白質為不穩定蛋白，分子量是29.392 kD，等電點pI 值為4.88，分子式為C1294H2057N345O4-14S10。利用PSIPRED在線軟件對蛋白質的二級結構預測發現HaFT-9有12個α螺旋和1個β折疊。使用swiss-mode在線軟件預測HaFT-9的三級結構發現HaFT-9可以形成同源二聚體，并以“U”的形式排列。利用BaCelLo在線軟件對HaFT-9亞細胞定位進行預測表明HaFT-9基因編碼的蛋白質定位在細胞核內。圖4

2.2.3 蛋白質的系統進化樹

選取擬南芥(XP_020890110.1)、油菜(XP_013738533.1)、中華獼猴桃(PSR99833.1)、橡膠樹(XP_021649588.1)、藜麥(XP_021725612.1)、煙草(BAD12174.1)、甜菜(XP_010681047.1)、菠菜(KNA23398.1)、柑橘(XP_006426292.1)等植物中與HaFT-9相似性較高的14-3-3的氨基酸序列，利用MEGA 5.0軟件系統分析。結果這些物種被聚為兩大類，其中HaFT-9的氨基酸序列與柑橘的親緣關系最近，與同為黎科的菠菜聚為一類，另一支甜菜、擬南芥、油菜、中華獼猴桃等聚為一類。同為黎科植物但不同來源的14-3-3 基因系統進化關系具有明顯的種屬特征。圖5

注：A和B為蛋白的不同面

Note: A and B are different sides of the protein

圖4 HaFT-9的三維結構預測模型
Fig.4 The 3-D structure of HaFT-9 established by SwissModel

注：HaFT-9為梭梭14-3-3蛋白序列

Note:HaFT-9 is a 14-3-3 protein sequence of Haloxylon ammodendron

圖5 HaFT-9與其他物種14-3-3蛋白的系統進化樹
Fig.5 Phylogenetic tree of the deduced amino acid sequences of HaFT-9 inHaloxylonammodendronand other species

2.3 不同脅迫條件下的HaFT-9基因表達

2.3.1 干旱、鹽脅迫和激素處理下的基因表達

采用實時熒光定量PCR的方法，檢測梭梭HaFT-9基因在20% PEG6000 模擬干旱脅迫、200 mmol/L NaCl高鹽脅迫、20 μmol/L IAA及100 μmol/L ABA處理下的表達，在模擬干旱脅迫與鹽脅迫下HaFT-9的表達均顯著上調，且該基因的表達量在6 h達到峰值(圖6 A，圖6 B)；在IAA和ABA激素處理下，HaFT-9基因的表達量分別在1和6 h達到峰值(圖6 C，圖6D)。以上結果表明，該基因可響應干旱脅迫、鹽脅迫和激素誘導，同時對IAA信號的響應快于ABA，并且ABA信號響應與干旱和鹽脅迫的響應模式相似。圖6

注：A、 B、C、D：分別為干旱脅迫、鹽脅迫、IAA、ABA處理下HaFT-9的表達模式；*代表顯著水平差異(P< 0.05)；**代表極顯著水平差異(P< 0.01)

Note: A, B, C and D: The expression patterns ofHaFT-9 under drought stress, salt stress, IAA and ABA treatments, respectively*Represent significant level difference (P< 0.05);**Represent extremely significant level difference (P< 0.01)

圖6 非生物逆境脅迫下HaFT-9 的表達模式
Fig.6 Expression patterns ofHaFT-9 under abiotic stress

2.3.2 地表高溫脅迫下的基因表達分析

研究表明， 一年生梭梭40℃脅迫下，HaFT-9基因的表達在脅迫時沒有增加，在常溫復原3 d時上調表達，但差異不顯著；55℃脅迫下，基因的表達量在2 h達到峰值，之后逐漸下降(圖7 A)，在復原15 d時仍有高表達。兩年生梭梭55℃脅迫下，HaFT-9基因的表達在常溫復原7 d時顯著上調，65℃脅迫下，24 h和常溫復原7 d時基因表達上調顯著，常溫復原7 d時達到最高(圖7 B)。表明HaFT-9基因可響應地表高溫脅迫誘導同時在脅迫后的常溫復原階段仍能持續表達，推測該基因可能與高溫脅迫和脅迫適應性相關。圖7

2.3.3 高溫脅迫適應條件下的基因表達分析

經模擬地表高溫脅迫試驗，證明梭梭結束高溫誘導并恢復正常生長條件后，HaFT-9仍存在高水平表達，推測該基因可能與梭梭高溫脅迫適應機制相關，為進一步驗證該推測，設計如圖8 A所示的處理模式，試驗組和對照組初期都在26℃培養3 d作為CK和CK’，脅迫處理，試驗組比對照組多一項37℃預脅迫。結果表明，對照組(圖8B中的黑框):45℃高溫脅迫1 h(S2’)后HaFT-9上調表達，在26℃恢復7 d后(R2’)表達沒有下降，表達量是CK’的1.6倍；試驗組(圖8B中的灰框)：在37℃高溫預脅迫1 h(S1)后HaFT-9上調表達，相對表達量是CK的2倍，26℃ 恢復3 d后，表達量是CK的1.5倍，繼續進行45℃脅迫1 h(S2)后，HaFT-9的表達量仍為對照的1.5倍，繼續26℃常溫恢復7 d(R2)后HaFT-9的表達量上升至CK的2.7倍，顯著高于對照組的恢復階段(R2’)。表明HaFT-9在高溫處理和恢復階段都上調表達，且經過37℃高溫預處理后進行45℃脅迫后的恢復階段，HaFT-9的表達量顯著高于未經過預處理組，推測HaFT-9可能與高溫脅迫適應性和脅迫記憶相關。圖8

注：A：模擬地表高溫脅迫下一年生梭梭HaFT-9的表達模式； B：模擬地表高溫脅迫下兩年生梭梭HaFT-9的表達模式；*代表顯著水平差異(P< 0.05)；**代表極顯著水平差異(P< 0.01)

Note: A:Expression pattern of HaFT-9 in annualHaloxylonammodendronunder simulated surface heat stress; B:Expression pattern of HaFT-9 in biennialHaloxylonammodendronunder simulated surface heat stress*Represent significant level difference (P< 0.05);**Represent extremely significant level difference (P< 0.01)

圖7 模擬地表高溫脅迫下梭梭同化枝中HaFT-9的表達模式
Fig.7 Patterns ofHaFT-9 expression in assimilation branches ofHaloxylonammodendronunder simulated surface high temperature stress

注：A：處理模式； B：梭梭同化枝中HaFT-9的表達模式；CK’、CK、R1：梭梭幼苗26℃培養3 d；S1：梭梭幼苗37℃脅迫1 h；S2’、S2：梭梭幼苗45℃脅迫1 h；R2’、R2：梭梭幼苗26℃恢復7 d**代表極顯著水平差異(P< 0.01)

Note: A: High temperature treatment patterns; B: Analysis ofHaFT-9 expression in assimilated shoots ofHaloxylonammodendron;CK'、CK、R1: Seedlings ofHaloxylonammodendronwere cultured at 26℃ for 3 days; S1: Seedlings ofHaloxylon ammodendron were cultured at 37℃ for 1 hour; S2’、S2:Seedlings ofHaloxylon ammodendron were cultured at 45℃ for 1 hour; R2’、R2 : Seedlings ofHaloxylonammodendronwere cultured at 26℃for 7 days;**Represent extremely significant level difference (P< 0.01)

圖8 高溫脅迫和常溫復原條件下梭梭同化枝中HaFT-9的表達
Fig.8 Analysis ofHaFT-9 expression in assimilated shoots ofHaloxylonammodendronunder high temperature stress and normal temperature recovery

2.4 蛋白自激活及酵母雙雜交實驗

將BD載體和BD-HaFT-9載體分別轉化酵母菌株Mav203，涂布于SD-Leu培養基，挑取單克隆點于SD-His培養基上(含10 mmol/L 3-AT)，30℃培養2～3 d。轉化子能夠在SD-Leu培養基上正常生長，說明質粒成功轉入酵母細胞，但無法在SD-His培養基上生長，HaFT-9蛋白無自激活活性(圖9 A)。

將BD載體、BD-HaFT-9載體、AD載體、AD-HaFT-9載體、陽性對照(pEXP32-Krev1+pEXP22-RalGDS-wt)、陰性對照(pEXP32-Krev1+pEXP22-RalGDS-m2)轉化酵母菌株Mav203，結果表明，轉化子都能夠在雙缺培養基(SD-Leu-Trp)上生長，陽性對照與BD-HaFT9+ AD-HaFT-9可以在三缺培養基(含40 mmol/L 3-AT)上生長， 并在X-Gal的處理下顯藍色(圖9 B)。HaFT-9蛋白在酵母體內能與自身互作形成同源二聚體。圖9

注：A：HaFT-9自激活實驗；B：HaFT-9酵母雙雜交實驗；BD：載體pDESTTM32；SD-2：SD-Leu-Trp；SD-3：SD-His-Leu-Trp

Note: A :Self-activation experiment ofHaFT-9; B:Two-hybrid experiment ofHaFT-9 yeast; BD:Vector pDESTTM32; SD-2:SD-Leu-Trp; SD-3:SD-His-Leu-Trp

圖9 酵母雙雜交實驗檢測HaFT-9蛋白結合特性
Fig.9 Detection ofHaFT-9 protein binding characteristics by yeast two-hybrid assay

3 討 論

14-3-3蛋白是高度保守且功能多樣的調節蛋白[23]，在植物體內主要以同源或異源二聚體的形式存在，已報道的14-3-3蛋白二聚體，煙草14-3-3c[24]和人類14-3-3t[25]的每個單體都是由9個反平行α螺旋組成。Lozano-Durán等[26]研究發現煙草14-3-3c蛋白，以“U”的形式排列形成同源二聚體，該蛋白具有干擾靶蛋白結合、連接兩種靶蛋白、改變靶蛋白的催化活性和亞細胞定位等作用。試驗利用在線軟件swiss-mode預測HaFT-9的三級結構，發現HaFT-9可以形成同源二聚體，并以“U”的形式排列。由此對HaFT-9進行了轉錄自激活和酵母雙雜交實驗，結果證明，HaFT-9不具有轉錄自激活活性，并且與自身互作形成二聚體，說明，HaFT-9可以在酵母中形成同源二聚體。但試驗預測HaFT-9蛋白的二級結構，表明該蛋白單體由12個α螺旋和1個β折疊組成，與前人研究[24-26]結果不完全相同，這種結構是否引起HaFT-9蛋白功能上的不同還需進一步研究。

Zhang等[27]發現過表達小麥14-3-3基因TaGF14b可以利用ABA信號通路增強植物對干旱、高鹽等非生物脅迫的耐受能力。Yan等[11]發現過表達擬南芥14-3-3蛋白基因GF14λ，可提高棉花的耐旱性，減弱植株萎蔫程度。任江萍等[28]研究發現小麥14-3-3蛋白基因Ta14S的表達量在ABA、PEG、高溫脅迫下顯著上調。試驗對梭梭幼苗進行干旱、鹽脅迫和IAA、ABA處理時HaFT-9基因的表達均上調，說明，HaFT-9能夠響應干旱脅迫、高鹽脅迫、IAA、ABA激素信號誘導，該結果與前人的研究相似[11, 12, 27, 28]。

高溫脅迫是一種常見的非生物脅迫，植物在初次受到這種高溫脅迫后，體內的適應機制被啟動，產生“脅迫記憶”，當植物再次受到這種脅迫時就會表現出對這種脅迫的適應性[29, 30]。近年來對擬南芥和水稻等植物的研究發現，由高溫脅迫啟動的基因表達會在正常生長溫度下持續數日[31]，當第二次高溫來臨時，基因會表現出比第一次更高的表達水平[32]。研究發現，擬南芥在高溫脅迫處理結束后的2～6 h內，14-3-3蛋白基因GRF9仍然上調表達，表明GRF9的功能可能與高溫脅迫適應性相關[33]。試驗對一年生和兩年生梭梭進行模擬地表高溫脅迫處理時，發現梭梭在常溫復原階段，HaFT-9基因仍然上調表達，推測HaFT-9可能與熱脅迫適應性有關。為驗證這一推測，設計高溫脅迫和常溫復原試驗，給予梭梭幼苗37℃非致死溫度脅迫后，第二次再給予梭梭幼苗45℃脅迫后，HaFT-9表現出比第一次和對照組更高的基因表達水平，該結果與上述[29-33]研究一致。梭梭14-3-3蛋白基因HaFT-9可能與高溫脅迫和高溫脅迫適應性相關。

4 結 論

從梭梭中成功克隆得到了14-3-3蛋白基因HaFT-9，全長789 bp，編碼262個氨基酸，HaFT-9蛋白不具有轉錄自激活活性，能與自身互作形成同源二聚體。HaFT-9基因可響應模擬干旱、鹽、高溫脅迫和IAA、ABA處理，并可能與高溫脅迫適應性相關。