蜂王漿調節小鼠免疫功能研究

周明良，喻建輝，余春濤，江平嶼

（江西汪氏蜜蜂園有限公司，江西南昌 330100）

0 引言

蜂王漿是蜜蜂巢中培育幼蟲的5～15日青年工蜂咽頭腺的分泌物[1]，也就是成年蜜蜂采食花粉后，自身分泌出的一種不同于蜂蜜的乳狀物質，天然的蜂王漿顏色為乳白色，由于其中成分的高低或者環境差異，有時也會呈現微黃色，此乳狀物就像哺乳動物的乳汁，是供給將要變成蜂王的幼蟲的食物，營養成分較為復雜，并且極具營養價值和免疫功能，也是蜂王一直都要食用的食物，在保健功能食品上有著極為重要的應用價值，也可以應用于醫療中，是介于食品與藥品之間的純天然保健食品[2]。

蜂王漿成分比較復雜，其中含有維生素A族以及B族物質，另外蛋白質和糖類是其中含量較多的物質，脂類物質液存在蜂王漿中，除去這些大分子物質，還有一些人體需要的氨基酸，在蜂王漿中也有發現。據研究，蜂王漿中含有26種以上的游離氨基酸[3]。10-羥基-α-癸烯酸，是人們較為熟知的王漿酸，生物術語上一般簡寫成10-HDA。王漿酸是自然界中很稀有的物質，一般來說是蜂王漿中特有的物質，常常代表著蜂王漿品質的優劣。蜂王漿食用營養價值極高，在蜂王漿的總脂肪酸中占有的比例在50%以上，同時還具有抗菌、抗病、抑制癌細胞生長等作用[4]。

許多國內外營養學家對蜂王漿進行了大量的研究認為，蜂王漿是一種可供人類直接食用的、具有高活性成分的超級營養食品。其中，周愛萍等人[5]通過動物試驗研究發現，分別經口給予小鼠不同劑量的蜂王漿30 d，能明顯增加抗體生成細胞數，高劑量試驗中還能提高小鼠NK細胞活性率，表明蜂王漿具有調節小鼠免疫的功能。張敬等人[6]觀察蜂王漿凍干粉對小鼠免疫功能影響時發現，蜂王漿凍干粉可以提高小鼠單核巨噬細胞系統和細胞免疫。同時還有研究表明，蜂王漿除了能滿足蜂王和幼蟲的基本新陳代謝以外，還可以調節身體機能和免疫功能[7-8]。

試驗通過采用不同劑量的蜂王漿灌胃小鼠，通過觀察其體重的變化，臟器/體重的比值、NK細胞活性率、淋巴細胞轉化率、半數溶血值及抗體生成細胞數來研究蜂王漿對小鼠免疫功能的影響。

1 材料和方法

1.1 樣品

由江西汪氏蜜蜂園有限公司提供的蜂王漿軟膠囊，其中內容物中蜂王漿凍干粉的比例為34%，于4℃下保存，供試驗用。

1.2 試驗動物及環境

SPF級昆明種雌性小鼠200只，體重18～22 g，由長沙市天勤生物技術有限公司提供，飼料也由該單位提供，試驗共分為兩大組，每大組有小鼠40只，免疫一組進行NK細胞的活性測定、進行ConA誘導的小鼠淋巴細胞轉化試驗；免疫二組，進行臟體比值測定、半數溶血值（HC50）的測定和抗體生成細胞數的測定。試驗期間，控制環境溫度為22～24℃，濕度為50%～56%。

1.3 劑量設計

人體推薦攝入量為3.0 g/日劑量的設計需參考人體，以其每日推薦量來確定，其每日推薦攝入量為3.0 g/日，相對劑量設計來說，也就是0.05 g/（kg·bw），根據該推薦量設置3個劑量組，5倍的低劑量組0.25 g/（kg·bw）、10倍的中劑量組0.5 g/（kg·bw）、30倍的高劑量組 1.5 g/（kg·bw），分別取汪氏牌蜂王漿軟膠囊內容物5.0，10.0，30.0 g加植物油定容至200 mL，按0.1 mL/10 g·bw體積給小鼠灌胃，對照組給予相同體積的植物油。每天1次，連續灌胃至少30 d。

1.4 儀器與試劑

動物臺秤、分析天平、潔凈工作臺、二氧化碳培養箱、離心機、722型分光光度計、恒溫水浴箱、酶標儀、顯微鏡等。

無菌手術器械、游標卡尺、微量注射器、細胞計數器、24孔和96孔平底細胞培養板，96孔U型細胞培養板、玻璃平皿、紗布、試管、玻片架、200目篩網、計時器、血色素吸管、載玻片等。

SRBC、生理鹽水、Hank's液、RPMI1640培養液、小牛血清、青鏈霉素、ConA、1%冰醋酸、1 mol/L的HCl溶液、酸性異丙醇、MTT、PBS緩沖液（pH值7.2～7.4）、補體（豚鼠血清）、SA緩沖液、瓊脂糖、都氏試紙、YAC-1細胞、乳酸鈉、硝基氯化四氮唑、吩嗪二甲酯硫酸鹽、氧化型輔酶Ⅰ、0.2 mol/L的Tris-HCl緩沖液、2.5%Triton、印度墨汁、0.1%的碳酸鈉、雞紅細胞、甲醇、Giemsa染液等。

1.5 試驗方法

1.5.1 臟器/體重比值測定

稱量后處死小鼠，取出脾臟和胸腺，在電子分析天平上稱量，計算臟器/體重比值。

1.5.2 ConA誘導的小鼠淋巴細胞轉化試驗（MTT法）

取脾，在無菌環境下，將小鼠的脾臟取出，小平皿中裝有適量無菌Hank's液，然后把小鼠的脾臟放入，制成細胞懸液，細胞懸液需要經過篩網過濾，過濾目數在200目即可，離心前需要用Hank's液清洗，清洗次數2～3次。過濾后的細胞懸液還需要經過離心，每次離心10 min（轉速1 000 r/min）。細胞懸液是用來活細胞計數，所以需要將處理好的細胞懸液放在1 mL完全培養液中，細胞濃度不宜過高或過低，一般設置在3×106個/mL，此時需要用RPMI1640培養液來對其進行調整，細胞懸液經過調整后要分成2孔加入24孔培養板中，每孔1 mL，在其中一孔加75μL ConA液（相當于7.5μg/mL），另一孔作為對照，設置培養時間為72 h，培養環境中需要5%二氧化碳，控制溫度為37℃。培養時，需要注意不能直接等時間結束后取出，在結束前4 h要吸取上清液0.7 mL，用不含小牛血清的RPMI1640培養液0.7 mL進行補充，與此同時還應該加入MTT（5 mg/mL），也就是相當于50μL/孔的量繼續培養，時間為4 h。酸性異丙醇要在培養結束后的時候加入，每孔加入1 mL，輕輕吹氣攪打混勻，使得紫色結晶的物質完全溶解。溶解后才能分裝在培養板中，每個培養板為96孔，每個孔都需要作平行，數目為3個，測定光密度值使用酶標儀，設置570 nm波長。淋巴細胞的增殖能力就可以用光密度值來表示，即用ConA孔的光密度值減去不加ConA孔的光密度值。

1.5.3 抗體生成細胞檢測（Jerne改良玻片法）

取羊血，使用生理鹽水洗滌，洗滌次數2～3次，之后需要以轉速2 000 r/min離心10 min，SRBC需要用生理鹽水配成質量分數為20%的細胞懸液，每鼠腹腔注射0.2 mL。4 d后，將小鼠處死、取脾，在無菌環境下將小鼠的脾臟取出，小平皿中裝有適量無菌Hank's液，然后把小鼠的脾臟放入，制成細胞懸液，細胞懸液需要經過篩網過濾，過濾目數在200即可，離心前需要用Hank's液清洗，清洗次數2～3次。細胞懸液是用來活細胞計數用，所以需要將處理好的細胞懸液放在8 mL完全培養液中，細胞濃度不宜過高或過低，一般設置在5×106個/mL。表層培養基需要稍微加熱使其完全溶解，溶解后、要用2倍濃度的Hank's液與表層培養基等量混合，Hank's液酸堿度應調節為pH值7.4，混合后分裝小試管，每管0.5 mL，再向管內加入用SA液配制的10%SRBC 20μL（V/V）、20μL脾細胞懸液 （5×106個/mL），準備好刷有薄層瓊脂糖的玻片，快速將懸液混合，混合后倒在玻片上，玻片扣在玻片架上應保持水平，待瓊脂糖凝固，放入二氧化碳培養箱中溫育，溫育時間為1.5 h，然后用SA液稀釋的補體，補體比例為（1∶8） 加入到玻片凹槽內，繼續溫育1.5 h后，計數溶血空斑數來表示抗體生成水平。

1.5.4半數溶血值（HC50）的測定

取羊血，然后使用生理鹽水洗滌，洗滌次數2～3次，SRBC需要用生理鹽水配成質量分數為2%的細胞懸液，每鼠腹腔注射0.2 mL。4 d后，取血樣品放在離心管，方式也略有不同，用摘除眼球的方法，樣品血不能立即處理，需要放置1h，血樣品會凝固，然后從管壁上取下，血清要分離，以轉速2 000 r/min離心10 min，這樣血清會分離得比較充分，收集血清。血清需要稀釋一定的倍數，以200倍為佳，稀釋液用SA，取1 mL置試管內，用SA緩沖液配制10%（V/V） SRBC和補體（1∶8） 分別加入0.5 mL和1 mL。這里的對照管加SA緩沖液。置恒溫水浴中保溫，溫度37℃，時間30 min，保溫后要使用冰浴停止反應。以轉速2 000 r/min離心10 min，取上清胞100μL攪拌，之后再加入2.5%Triton 100μL，這些孔都需要設置平行孔，一般要設置3個，處理好后放在二氧化碳培養箱中培養4 h，二氧化碳體積分數為5%，培養溫度37℃，然后將96孔培養板放在離心機中離心5 min處理，轉速設置為1 500 r/min，然后吸取每個孔的上清液100μL，同樣也要放在平底96孔的培養板中培養一段時間。除了這個處理，LDH基質液也要及時加入等量的覆蓋混勻，由于室溫的不同，一般反應3～10 min，每孔加入1 mol/L的HCl 30μL，在酶標儀處測定光密度（OD），測定波長設置為490 nm。

1.6 試驗數據統計

1 mL，加都氏試劑3 mL。SRBC用SA緩沖液配制的10%（V/V），使用0.25 mL，空白對照用等量的都氏試劑，分別于波長540 nm處測定各管光密度值。溶血素的量以半數溶血值（HC50）表示，按下式計算：

數據需要經過轉化和統計分析，試驗中采用Excel，Spss軟件進行。用Spss軟件分析時，如果方差齊，波動較小，那么單因素方差分析之后，再進行總體比較，發現差異的時候要用Dunnett法對劑量組進行比較。如果方差不齊，對原始數據有適當的轉化是正常的，這樣使得數據滿足方差齊性，用轉換后的數據進行統計；如果達不到方差齊，則改用秩和檢驗進行統計，發現總體比較有差異，采用Tamhane'sT2檢驗進行兩兩比較，該方法不要求方差齊性。

1.5.5 NK細胞活性的測定（乳酸脫氫酶測定法）

受試小鼠采用頸椎脫臼的方法處死，將小鼠的脾臟作為觀察對象，取脾時要在無菌環境下，將取出的脾臟小心碾碎，制成一定濃度的細胞懸液，并采用Hank's液洗2～3次。經過洗滌后，對懸液進行離心10 min（轉速1 000 r/min） 處理，丟棄浮起的上清液，將細胞漿彈起。用滅菌水0.5 mL處理20 s即可，經此方法處理可以裂解紅細胞，然后再加入0.5 mL Hank's液及8 mL Hank's液，同樣要采用離心的處理，以轉速1 000 r/min離心10 min即可。將樣品進行重懸處理，小牛血清的RPMI1640完全培養液的質量分數10%，1 mL處理即可，計數前要處理，用1%冰醋酸稀釋，計數活細胞采用苔酚藍染色的方法，（活細胞數達95%以上的樣品才可以采用），細胞濃度不宜過高或過低，這里調整為2×107個/mL，得到效應細胞，生長良好的YAC-1細胞才可以用作有效的試驗，需經過傳代24 h，細胞濃度需要使用RPMI1640完全培養液，調整為4×105個/mL，得到靶細胞；靶細胞和效應細胞都取100μL（由于濃度的不同，所以對應的效靶比為50∶1），取好后混勻加入U型培養板中，培養板使用96孔；靶細胞自然釋放，先加靶細胞100μL攪拌，之后再加入培養液100μL混合均勻，靶細胞最大釋放孔先加靶細

2 結果與分析

2.1 樣品對正常小鼠體重的影響：

表1 免疫一組小鼠體重（±s，g）

表1 免疫一組小鼠體重（±s，g）

組別 動物數/只 初始體重 中期體重 末期體重 增重對照組低劑量組中劑量組高劑量組10 10 10 10 12.68±1.66 13.19±2.06 13.51±1.55 12.44±2.12 19.85±1.25 19.82±1.20 19.81±1.12 19.92±1.24 28.19±1.93 28.00±1.18 28.36±1.99 27.61±2.18 32.53±1.89 33.01±2.27 33.32±2.36 32.36±3.01

表2 免疫二組小鼠體重（±s，g）

表2 免疫二組小鼠體重（±s，g）

組別 動物數/只 初始體重 中期體重 末期體重 增重對照組低劑量組中劑量組高劑量組10 10 10 10 19.64±1.21 19.68±1.18 19.62±1.03 19.71±1.16 27.60±1.98 27.82±1.79 27.57±1.91 28.30±1.89 32.30±2.87 33.05±2.37 32.43±3.56 33.17±2.78 12.66±2.13 13.37±1.74 12.81±2.68 13.46±1.99

由表1，表2可見，各劑量組在體重方面，從試驗初期、中期、末期來看與對照組比較，差異性均無顯著性 （p＞0.05）。

2.2 樣品對小鼠免疫器官臟器/體重比值的影響

表3 樣品對小鼠免疫器官臟器/體重比值影響（±s，g）

表3 樣品對小鼠免疫器官臟器/體重比值影響（±s，g）

組別 動物數/只脾臟/體重/% p值 胸腺/體重/% p值對照組低劑量組中劑量組高劑量組10 10 10 10 0.465±0.079 0.491±0.136 0.528±0.101 0.551±0.121 0.335 0.319±0.064 0.340±0.095 0.361±0.076 0.371±0.074 0.467

由表3可見，樣品各劑量對小鼠脾臟/體重比值和胸腺/體重比值無顯著影響（p＞0.05）。

2.3 樣品對小鼠細胞免疫功能的影響

表4 樣品對小鼠ConA誘導的淋巴細胞轉化能力的影響（±s）

表4 樣品對小鼠ConA誘導的淋巴細胞轉化能力的影響（±s）

組別 動物數/只加ConA的OD值不加ConA的OD值淋巴細胞增殖能力（OD差值） p值對照組低劑量組中劑量組高劑量組10 10 10 10 0.223±0.020 0.231±0.014 0.218±0.025 0.220±0.014 0.189±0.025 0.190±0.016 0.169±0.037 0.155±0.027 0.035±0.022 0.041±0.023 0.050±0.023 0.065±0.024-0.869 0.333 0.015

由表4可見，樣品高劑量組小鼠淋巴細胞轉化能力明顯高于對照組（p＜0.05）。

2.4 樣品對體液免疫的影響

2.4.1 樣品對小鼠抗體生成細胞數的影響

表5 樣品對小鼠抗體生成細胞數的影響（±s）

表5 樣品對小鼠抗體生成細胞數的影響（±s）

組別 動物數/只 溶血空斑數（個/106個脾細胞） p值對照組低劑量組中劑量組高劑量組10 10 10 10 120±59 153±72 170±64 206±54-0.511 0.198 0.011

由表5可見，高劑量組小鼠抗體生成細胞數與對照組比較顯著提高（p＜0.05）

2.4.2樣品對小鼠半數溶血數值（HC50）的影響

樣品對小鼠半數溶血數值（HC50）的影響（±s） 見表 6。

表6樣品對小鼠半數溶血數值（HC50）的影響（±s）

表6樣品對小鼠半數溶血數值（HC50）的影響（±s）

組別 動物數/只 半數溶血值 p值對照組低劑量組中劑量組高劑量組10 10 10 10 144.33±25.77 161.08±20.80 171.18±33.59 181.75±34.16-0.440 0.115 0.018

由表6可見，高劑量組小鼠半數溶血數值（HC50）與對照組比較顯著提高（p＜0.05）。

2.5 樣品對小鼠NK細胞活性的影響

表7 樣品對小鼠NK細胞活性的影響（±s）

表7 樣品對小鼠NK細胞活性的影響（±s）

組別 動物數/只NK細胞活性/%NK細胞活性平方根反正弦轉化值 p值對照組低劑量組中劑量組高劑量組10 10 10 10 22.42±11.43 30.29±12.38 37.35±10.40 39.19±9.59 27.40±8.64 32.87±8.30 37.54±6.14 38.66±5.62-0.869 0.333 0.015

由表7可見，中、高劑量組小鼠NK細胞活性與對照組比較顯著提高（p＜0.05或p＜0.01）。

3 結論

在試驗條件下，經口灌胃給予小鼠0.25，0.50，1.50 g/（kg·bw） 劑量的汪氏牌蜂王漿軟膠囊30 d，與對照組比較0.50，1.50 g/（kg·bw） 劑量能顯著提高小鼠NK細胞活性，1.50 g/（kg·bw） 劑量能顯著提高小鼠半血溶血值、抗體生成細胞數、淋巴細胞轉化能力（p＜0.05），各劑量對小鼠體重增長、胸腺/體重比值、脾臟/體重比值均無明顯影響（p＞0.05）。表明蜂王漿具有增強小鼠免疫力的功能。

綜上所述，蜂王漿在對小鼠免疫功能的影響有一定的調節作用，正常小鼠在灌食一定劑量的蜂王漿后，其體重并未發生明顯變化，臟器/體重比值也未觀察到明顯變化。中、高劑量的蜂王漿能明顯提高小鼠NK細胞活性，高劑量蜂王漿能明顯提高小鼠半血溶血值、抗體生成細胞數、淋巴細胞轉化能力。蜂王漿所含營養物質較多，營養成分特別復雜，就目前已有的研究來說，蛋白質是蜂王漿干物質的主要成分，蜂王漿中的蛋白質有12種以上，此外還有許多小肽類物質。蜂王漿中含有很多酶類蛋白質，如膽堿酯酶、超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽酶和堿性磷酸酶等[9]。另外，蜂王漿中還含有許多脂類有機酸，蜂王漿的特征性成分是短鏈羥基脂肪酸，已檢測到的有：10-羥基2-癸烯酸（10-HDA）、癸酸、2-十二碳烯二酸、10-羥基癸酸、3-羥基癸酸、9-十四烯酸、9-十六烯酸、琥珀酸、十三烷酸、棕櫚酸、亞油酸、花生酸、月桂酸、亞麻酸等多種游離脂肪酸[10-11]，其中10-HDA是蜂王漿中十分重要的物質，是特有的不飽和脂肪酸[12]，因其在不同溫度、不同保存時間的蜂王漿中含量穩定[13-15]，因此成為評價蜂王漿品質的重要指標。由于蜂王漿中營養成分物質太多，具體是哪些組分對免疫功能進行調節仍需要進一步研究。