獸醫實驗室抗體檢測結果影響因素的分析及注意事項

周俊宇

摘 要 隨著畜禽養殖業的進步發展以及國家動物疫病檢測計劃的實施和地方動物疫病預防與控制工作的進行，基層獸醫實驗室的發展也逐漸完善，動物免疫抗體檢測在動物疫病的防治上發揮出了巨大的作用，但是其在實驗過程中也因各種因素而導致實驗結果出現異常，繼而影響動物疫病防治的效果。基于此，本文結合牛血清A型口蹄疫抗體檢測實驗就影響獸醫實驗室抗體檢測結果的因素及對策進行了分析。

關鍵詞 獸醫實驗室；抗體檢測；影響因素；注意事項

1 引言

抗體檢測工作的開展能夠針對一些畜禽疾病進行有效的檢測，以便提出更好的診療辦法，但是實驗室在實際操作中，往往會因為試劑因素、樣品因素以及人為因素造成檢測結果失真的現象，由此有必要深入分析其影響因素，并積極采取措施規范實驗室操作，確保檢測結果的精確有效，以便為基層獸醫實驗室的工作開展提供依據。

2 影響獸醫實驗室抗體檢測結果的因素

2.1 試劑因素

實驗過程中使用的如陽性血清、標準抗原、稀釋液以及陰性血清等試劑都會直接影響到抗體檢測質量，因此需要嚴格注意ELISA 檢測相關試劑盒的購買情況，使用過程中還需要注意ELISA 檢測試劑盒生產日期及保存環境溫度，如果保存不當或者是過期都有可能會出現錯誤，影響抗體檢測結果。

2.2 樣品因素

待檢樣本的質量是確保實驗結果準確性的重要因素，如果被檢樣品被污染就可能導致 ELISA 敏感性和準確性降低，因此在樣品采集過程中應嚴格注意樣品采集的方式、時間以及樣品的前期處置和保管工作。在抗體檢測過程中，還需要注意不能重復多次凍融樣品，以免樣品的蛋白質結構被破壞而出現錯誤的檢測結果。

2.3 人為操作因素

2.3.1 加樣操作因素

在檢測過程中加樣成為影響檢測結果主要因素，尤其是人為加樣過程中，必須要保證加樣的均勻、定量，不能出現氣泡。需要注意加樣之前的樣品確保是在完全解凍的狀態下，加樣后必須要完全混合均勻才能夠進行檢測工作，否則就會出現特異性反應。

2.3.2 溫育時間與溫度

ELISA 檢測相關抗體時需要進行孵育來使被檢樣品和所包被抗原或者抗體更好的結合，因此需要參照說明書要求對不同類型抗體檢測過程進行孵育，如果時間、溫度控制不當還有可能造成被檢樣品不能與抗體或者抗原結合形成抗原符合物，使得實驗結果嚴重失真。

2.3.3 洗板次數因素

ELISA 檢測相關抗體需要自加完二抗進行孵育后進行洗板工作，但是洗滌次數過多容易洗掉反應結合的復合物，洗板次數過少導致洗滌不干凈，容易造成二抗稀釋液的殘留，導致實驗結果失真。

3 獸醫實驗室血清學抗體檢測操作應用

使用牛口蹄疫A型抗體檢測過程作為實例分析講解基層獸醫實驗操作的注意事項， 以待提高實驗室抗體檢測結果的準確性。

3.1 實驗用品的準備

首先，準備好實驗中需要用到的儀器耗材，包括酶標儀（型號：MK3）、深圳某生物公司生產的合格期內的試劑盒、高壓滅菌鍋、離心機、純水機、均質器等。其次，制備待檢血清，要求血清清亮，無溶血，共10份樣品。

3.2 實驗器材的消毒

除了實驗中需要用到的一次性用具可以直接使用以外，其他可重復使用的實驗用具必須要用烘箱或者高壓滅菌進行消毒才能夠使用。

3.3 實驗操作的過程

3.3.1 牛口蹄疫A型抗體檢測試驗基本步驟：

1.試驗設置陽性對照1孔、陰性對照2孔；

2.加樣：將陰性對照、陽性對照、待檢樣品血清按10μl/孔加入孔內，再按40μl/孔加入抗體工作液，加完后震蕩混勻，

3.溫育：蓋上封板膜，置37℃溫育60分鐘；

4.洗板：揭開封板膜，甩掉板孔中的溶液，使用工作濃度洗滌液每孔加250μl，后甩去孔內液體，以上步驟重復5次，最后在干凈吸水紙上拍干；

5.溫育：每孔加酶結合物50μl，蓋上封板膜，置37℃溫育30分鐘。

6.洗板：小心揭開封板膜，甩掉板孔中的溶液，洗滌5次，方法同4.切記最后在干凈吸水紙上拍干。

7.加顯色劑：每孔加顯色液100μl，混勻，蓋上封板膜30℃避光顯色10分鐘。

8.加終止液：每孔加終止液50μl，使反應終止，10分鐘內測定結果。

3.3.2 實驗操作注意事項

（1）加樣位置

加樣位置至關重要，因為實驗中涉及陽性血清、陰性血清、被檢血清三種，如果稍不留意容易混淆，一旦加樣的位置錯誤，容易導致陰性對照及陽性對照的成立條件無法形成，從而導致實驗失敗。

（2）移液槍頭的及時更換

移液槍頭必須要保證每取一份血清就更換一次，如果交叉使用，容易造成樣品污染，繼而影響實驗結果。

（3）孵育的條件及時間

孵育的時候應注意避光，而且溫度要控制在37℃，因為酶的活性在37℃時活性最高，溫度過高或者過低都會影響其活性，所以溫度控制在37℃使酶結合物跟底物能充分反應。其次，溫育時間也很重要，溫育時間若人為延長，會導致非特異性結合緊附于反應孔周圍，不能完全清洗干凈，使試驗結果不準確。所以，在實驗過程中，應按照說明嚴格控制操作溫度和時間。

（4）洗板

配制洗滌液時應使用新鮮無污染的蒸餾水或去離子水，現配現用。洗板時需保證微孔板平放，將洗滌液注滿各孔，每次洗滌都要充分，盡量避免漏液、溢液現象。

（5）顯色

顯色是無色的底物生成有色產物的溫育反應，反應的溫度和時間仍是影響顯色的因素。加入底物后應立即避光顯色。顯色劑盡量在臨使用前配制，現配現用。若底物呈現顏色變化則堅決不能再用。

（四）結果判定

試驗成立的條件：

陰性對照OD值>0.5，同時陽性對照（P）阻斷率>50%

計算方法：

PI（阻斷率）={1-（樣品OD值÷陰性對照OD均值）}×100%

陰陽性判斷：

PI（阻斷率）>45%則判斷為陽性；PI≤45%則判斷為陰性。

4 結語

從實驗結果看：1.陽性和陰性對照條件成立，實驗有效；2.圖表中陽性代表經過口蹄疫A型抗體免疫的牛血清中含有抗體，陰性則代表沒有檢出其含有口蹄疫A型抗體，免疫綜合率占50%；3.樣品的標準偏差都控制在10%以內，不但從側面的反映出酶聯免疫試劑盒生產技術的成熟，也說明了在試劑因素、樣本因素以及人為操作因素操作上嚴格控制的話實驗結果會相對更理想。綜上所述，獸醫實驗室抗體檢測結果的準確性直接影響著動物疫病防控的實踐，通過在實驗過程中加強實驗室檢測技術的應用能夠最大程度上降低試劑因素、樣本因素以及人為操作因素對實驗結果產生的影響，從而為當前獸醫實驗室的動物疫病防控工作提供依據。

參考文獻：

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