分子生物學技術在微生物群落研究中的應用

劉華健

摘 要：微生物群落有個體小，種類多，不易觀察等特點，分子生物技術的興起彌補了傳統方法對于微生物群落研究的不足，簡單介紹了DGGE技術、T？RFLP技術、高通量測序等目前應用較為廣泛的分子生物學技術，包括技術原理，研究過程，和優缺點等。

關鍵詞：微生物群落;DGGE技術;T-RFLP技術;高通量測序技術

微生物數量大種類多，在生物地球化學循環中起著至關重要的作用，傳統的培養法等很難對微生物群落的作出全面深入的研究，自PCR法發明后，基于分子生物學技術方法應運而生，在微生物群落的研究中正廣泛的應用起來。

一、DGGE技術

DGGE（Denatured Gradient Gel Electrophoresis）技術，即變性梯度凝膠電泳技術，它最早是由Fischer和Lerman于1979年提出的，最初用于檢測DNA的點突變。1993年Muyzcr等人首次將DEEG技術運用于微生物群落結構的研究中，并且發現此項技術對于微生物群落的種群差異和遺傳多樣性方面的研究具有很大的優勢[1]。此電泳技術分離DNA的原理主要利用相同長度的DNA片段由于其堿基組成不同，解鏈時需要的變性劑濃度不同，導致DNA鏈在由低到高濃度的聚丙烯酰胺凝膠中移動時，會在不同的濃度下變性而減慢移動速度，從而把DNA鏈分離開來。此項技術已經成為微生物群落分子生態學的主要研究方法之一。

實驗流程為，微生物DNA的提取：可用CTAB法或生物公司的DNA提取試劑盒在無菌工作臺上提取微生物DNA。目的基因擴增：根據其所研究微生物的種類不同選取具有高度保守區的基因序列進行擴增，如原核微生物一般選取16S rDNA的V3、V4、V5等區域，真核微生物一般對其ITS和18S rDNA基因片段等進行擴增。電泳及電泳圖譜分析：電泳與瓊脂糖電泳相似，制膠時需要注意根據所擴增的目的基因制備合適濃度的變性凝膠。跑完的凝膠經過染色后形成可視條帶，可通過Quantity One等軟件來分析電泳條帶，來對微生物群落進行聚類和相似性等分析。DGGE技術，具有分辨率高、操作簡單迅速、重復性好等優點，但也有對環境微生物含量要求高、有些物種基因的不同拷貝中之間存在異質性問題等缺點[2]。

二、T-RFLP技術

T-RFLP（Terminal Restriction Fragment Length Polymorphism，末端標記限制性片段長度多態性）技術，是對人類遺傳學家1980年提出的PCR-RFLP技術的改良，使其更快速有效具有更高的分辨率，更容易操作分析，在微生物群落分析中有明顯的技術優勢[3]。T-RFLP技術主要技術原理是因不同物種基因序列存在差異，導致用限制性酶切后的基因片段長度不同，熒光標記的不同長度的限制性片段代表不同的細菌種類，從而達到對微生物群落結構多樣性等進行分析的目的。

T-RFLP的主要流程，先提取微生物群落的總DNA，用末端標記的引物PCR擴增細菌的16S rDNA（以細菌為例，真菌可擴增26S rDNA等），然后選擇合適的限制性核酸內切酶對擴增后的末端帶有熒光16S rDNA進行酶切。酶切后的產物用DNA自動測序儀進行片段分離，末端帶有熒光標記的片段被分離出來，因為每一種菌末端帶有熒光標記片段長度不同，所以測序儀上的峰值圖上，每一個峰值代表著一個細菌。峰值曲線下的面積越大代表該菌種的數量越多。

T-RFLP技術有快速、高分辨率、重復性高等優點，但其存在只能提供微生物的種類和相對數量的信息的缺點[4]，所以現在對利用T-RFLP技術的應用相對減少，但對于一些不需要嚴格定性分析的微生物群落調查中，T-RFLP技術仍然具有很大的技術優勢。如2016年龍海等人，利用T-RFLP技術對深港兩地的工程土壤細菌多樣性進行了多樣性分析。發現香港段土壤大約有141屬，235種細菌，深圳段大約存在132屬，206種。其中香港段的特有種屬有32個，深圳段的特有種有3個[5]。

三、高通量測序技術

高通量測序技術也叫第二代測序技術，2005年Roche公司首先推出了焦磷酸測序技術，實現了超高通量的基因測序，開創了第二代測序的先河[6]。隨后Illmina公司和ABI公司也相繼推出了自己的Solexa和SOLiD技術，目前Roche公司的焦磷酸測序技術面臨淘汰，Illmina公司的Hiseq測序技術應用廣泛，是目前全球使用量最大的第二代測序機器。

Illmina公司的Hiseq測序技術采用邊合成邊測序的原理，DNA在復制時加入帶有熒光標記的ddNTP無3′羥基，在合成中不能形成磷酸二酯鍵而終止合成反應，根據4種熒光標記的ddNTP（分為：ddATP、ddCTP、ddGTP、ddTTP）顯示的熒光顏色不同和堿基互補配對原則，就能知曉所測片段的DNA序列。

高通量實驗流程易操作，關于微生物總DNA的提取，和目的片段（16S rDNA、ITS等）PCR的擴增，與前面所介紹的分子生物學技術步驟基本相同。PCR擴增盡量選取低循環數擴增以免造成誤差。PCR擴增后的待測序列用超聲波打斷成200-500的小片段DNA，在其3′端加A堿基，構建DNA文庫，然后把構建好的DNA文庫放入測序機器的測序流動槽中，利用橋式PCR擴增上樣DNA鏈，最后邊合成邊測序，利用相機拍攝的熒光顏色通過電腦程序得出所測序的DNA序列。測序的序列還要經過拼接優化，并與基因庫里的基因做比對，確認所對應的物種信息后才能做后續微生物群落分析。高通量測序技術具有效率高、準確性高、可定量、測序通量大等特點。但也存在實驗耗資貴，數據量龐大帶來的后續分析困難等問題[7]。

微生物群落的研究中，在要求不高的情況下傳統的分析技術還有其很大的實用性，但對于微生物群落大量更深層次的研究中分子生物學技術的產生具有劃時代的意義，目前多種技術的應用和伴隨科技的發展更多的實用技術的產生（如，第三代測序技術）會使研究者對微生物群落的調查研究更深入更方便快捷。

參考文獻：

[1]張明月.DGGE用于兩種不同類型生境的微生物群落結構的研究[D].上海：上海海洋大學，2012

[2]劉瑩.夏季北冰洋海域微微型和微型浮游生物的多樣性及其群落結構研究[D].上海：上海海洋大學，2013

[3]王孟孟，楊兆光， 李海普等.陸地環境微生物多樣性研究技術的進展[J]. 化學工程與裝備，2018，（8）：277—278.

[4]賈俊濤，宋林生， 李筠等.T？RFLP技術及其在微生物群落結構研究中的應用[J]. 海洋科學，2004，28（3）：64—68.

[5]龍海，章桂明，馮建軍等.深港兩地工程土壤細菌多樣性的T？RFLP分析[J]. 生物技術通訊，2016，27（1）：106—109.

[6]王興春，楊致榮，王敏等.高通量測序技術及其應用[J]. 中國生物工程雜志，2012，32（1）：109—114.

[7]王紹祥，楊洲祥，孫真等.高通量測序技術在水環境微生物群落多樣性中的應用[J]. 化學通報，2014，77（3）：196—203.