靶向蛋白質組的研究

張修萍 徐晗 劉彬

摘要：選擇和檢查方針蛋白有關的信號，疏忽別的無關的信號，因而能夠完成對方針蛋白定量的高特異性和高準確性。

前言：

隨著FDA批準的新藥數量減少，醫藥研發也經歷著生產力的下降。市場力量、需求與競爭使得醫藥研發越來越具有挑戰性。對疾病機制理解的進步表明，可以剖析復雜和多因素系統，以確定可靠、安全和有效的藥物。

設計蛋白-蛋白相互作用的特異性抑制劑可以代替PPI網絡中高度互聯節點的多效抑制劑。這些抑制劑不僅有助于解開互連網絡的復雜性，而且可以提供更廣泛的藥物靶標。

一、靶向蛋白質組相互作用

小分子調節劑

發現與細胞內蛋白質伙伴競爭結合的小分子是一項艱巨的任務。設計抑制PPI的小分子的一個難點與應該被分子覆蓋的表面的大小有關，而抑制酶的活性位點一般通過占據酶的功能腔來實現。與酶的活性位點或受體的結合位點相比，PPI通過由蛋白質原子埋藏形成的大界面穩定，達到數千平方埃。除了與表面尺寸競爭的難度之外，PPI界面還代表著多樣化和多方面的結合位點，在構建有效的抑制劑方面構成重大挑戰。

尋找小分子PPI抑制劑的第二個難題在于缺乏用于篩選靶向激動劑或拮抗劑的簡單功能測定技術。在PPI的情況下，必須重新審視高通量篩選（HTS）。已經開發出測量使用反向兩種雜交或BRET的相互作用喪失的高通量蜂窩篩選，并且提供僅選擇細胞可穿透分子的優點。

由于八十年代蛋白質結合界面能量分析的出現，小分子PPI抑制劑得到了持續有力的發展。通過丙氨酸掃描技術探索在發生結合時不同接觸的貢獻。這種技術表明，界面殘基的一些突變對兩個分子的結合親和力幾乎沒有影響，另一些突變主要是不穩定效應。在熱點位置相互作用的小分子應與同源伴侶的結合形成競爭，而不必覆蓋整個相互作用的表面。

作為小分子PPI抑制劑開發的積極步伐，熱點位置與蛋白質多重結合位點的位置相關。定義這些位點為蛋白質同源家族表面的殘基，它們對應于穩定天然蛋白質協助伙伴的相互作用中起著關鍵作用的蛋白質的“粘性區”，并且易于結合小分子。最新的研究顯示這些粘性區域富集了抑制劑結合能，為合理選擇結合分子開拓了新的思路。

在較大的蛋白蛋白界面中，熱點可以在界面上分布得更多，其間距相當大。它們涵蓋了更復雜的化學功能組合，增加了發現所有熱點抑制劑的難度。PPI抑制劑顯示出比傳統藥物更大的尺寸和分子量。PPI抑制劑也更具疏水性，它們含有更多數量的氫鍵和至少四個環。這種與經典特征的偏離指出了組合專用于PPI篩選的分子庫的必要性，其含有比傳統藥物設計的化合物庫更高的化學多樣性和更大的復雜性。對天然產物的進一步探索通常應該有助于多樣化和補充這類化合物。用于搜索PPI抑制劑的計算工具也與實驗篩選相結合，以加速篩選和降低成本。

化合物庫組合的另一種方法稱作“片段方法”。它不是選擇分子量相對較高的起始分子，而是對一個伙伴進行一組簡單的低親和力小分子片段搜索，并通過基于結構的策略逐步建立抑制劑。對于該策略，結合熱點的確定對于定義分子可以有效結合與同源伙伴競爭的關鍵位置特別有用。在前期的篩選中采用X射線或NMR技術直接進行基于結構的篩選取得成功。可以基于其結合位點直接選擇起始分子。即使起始化合物的親合力落在毫摩爾范圍內，通過擴大分子大小同時優化結合親和力來優化已經足夠。也可以使用晶體接觸來找到新的結合位點，并通過連接片段增加分子的大小。選擇第一個片段的另一個成功的策略是通過SS鍵在接近靶向PPI相互作用的位置上束縛分子。在該策略中，靶標和初始片段化合物之間共價鍵的存在有助于獲得復合物的結構。

蛋白調節劑：

在這一領域計算方法也做出了重大貢獻。建模和設計工具，如Rosetta已經達到了足夠的準確性以便能夠指導結合劑的合理設計。將合理的設計策略與最先進的顯示技術相結合，為結合劑類的多樣化打開了很大的視角。計算方法也可用于設計降低蛋白的免疫原性。設計用于抑制PPI的天然、工程或人造抗體通常被認為與同源伙伴競爭;但在少數情況下，他們也通過變構機制發揮效應。然而，由于蛋白質構象的微妙變化，后一種效應機制難以合理化或預測。最后，選擇用于緊密結合靶標的抗體、納米抗體和其他蛋白質的主要限制仍然是這些蛋白質進入細胞的困難。它們的應用主要限于細胞外靶標。

肽和肽擬似物：

肽是足夠大的天然化合物，可能阻礙PPI相互作用和命中幾個熱點。然而，靶向細胞內PPI時，肽抑制劑必須跨過細胞膜。目前細胞穿透肽（CPPs）方面取得了重大進展，這為細胞內肽樣藥物的發展帶來了顯著進步。特定肽序列穿透細胞的能力首先在神經遞質和病毒蛋白的小蛋白中發現。然后深入研究滲透機制，突出顯示各種機制，具體取決于仍在研究中的CPP類型。進入細胞涉及內吞吸收，但也可直接穿越膜。

二、靶向蛋白質組技能：

蛋白質是生命活動的直接執行者，生物學研討離不開剖析蛋白質的構成及含量改變。如今研討樣本中蛋白質的含量都是直接辦法：

1.根據抗體的檢查辦法，如Western blotting、ELISA。這些辦法的可靠性、靈敏度十分依賴于抗體的質量。對那些沒有商業化的抗體的蛋白而言，無法用這些辦法剖析蛋白含量改變。

2.經過基因表達的改變預測蛋白質含量改變，可是mRNA和蛋白含量之間有關性并不強，致使成果經常出現偏差。那么，有沒有一種辦法無需經過抗體、或許轉錄水平這些直接的辦法，而是能夠之間剖析樣品中的含量呢？答案是必定的，這種辦法即是咱們要介紹的蛋白質組技能。依照試驗意圖能夠將蛋白質組技能分為兩大類：高通量蛋白質組學和靶向蛋白質組學，別離用于前期的區別蛋白挑選以及后續的方針蛋白驗證。例如關于臨床Biomarker的挑選，通常是首先應從有限數意圖臨床樣本中運用高通量的辦法挑選出區別的方針蛋白，然后運用靶向蛋白組技能關于方針蛋白進行擴展樣本的驗證

靶向蛋白質組技能首要包含SRM/MRM和PRM兩種辦法。SRM/MRM （Selected/ Multiple reaction monitoring）運用的是三重四級桿的質譜，使用四級桿高選擇性的特色對母離子和子離子依次進行分選，該技能在2012年的在Nature Methods中有具體的總結論說1，并被評為年度技能（Method of the Year 2012），可見其重要意義和使用價值。在SRM/MRM的基礎上，2012年晚些時候，在MCP上報導了新式的靶向蛋白組技能——PRM（Parallel reaction monitoring）技能2，該技能聯系了四級桿的高選擇性以及Orbitrap的高分辯、高精度特性，能夠對二級圖譜進行獨立的判定，辦法流程愈加快捷。與傳統的SRM/MRM對比，PRM在雜亂布景下具有更優異的抗干擾才能和檢查靈敏度。因而，PRM是更具優勢和潛力的新式靶向蛋白質組檢查辦法，堪稱SRM/MRM的升級版。

總結：

考慮到尋找PPI抑制劑，需要擴大化學空間以有效篩選小分子，并且應該優先聚集專門的化合物庫，也可以選擇核酸適配子結合蛋白質表面并抑制蛋白質相互作用。設計廣泛的肽模擬物的開發工作仍在進行中，應增加有助于靶向PPI的分子化學空間，這種分子的主要障礙可能是免疫反應。最后，如果干擾PPI的研究不斷取得進展，那么能夠恢復由致病突變引起的PPI損失的分子仍然限于特殊情況。這種分子在開發遺傳性疾病中的新藥物將是非常有意義的，這可能是該領域即將到來的重要挑戰。