RT-PCR和熒光探針PCR對手足口病腸道病毒的檢測效果分析

何鋒 劉穎迪 程艷君

【摘 ?要】目的：探討RT-PCR和熒光探針PCR對手足口病腸道病毒的檢測效果。方法：選擇我市2018年1月至2018年12月的225例手足口病患兒，均行RT-PCR和熒光探針PCR檢測，對比RT-PCR和熒光探針PCR兩種方法的病毒陽性檢出率，包括通用型腸道病毒、EV71、CoxA16。結果：熒光探針PCR對通用型腸道病毒、EV71、CoxA16等手足口病腸道病毒的檢出率明顯高于RT-PCR法，差異對比顯著，具有統計學意義（P<0.05）。結論：與RT-PCR相比，熒光探針PCR對手足口病腸道病毒的陽性檢出率較高，值得臨床推廣應用。

【關鍵詞】RT-PCR;熒光探針PCR;手足口病腸道病毒;陽性檢出率

【中圖分類號】R446??????【文獻標識碼】A??????【文章編號】1004-7484（2019）07-0138-01

手足口病是因腸道病毒感染引起的一種傳染性疾病，多發于嬰幼兒中，會引起小兒的足、手、口腔等部位發生皰疹，部分患兒甚至會引起肺水腫、心肌炎或無菌性腦膜炎等嚴重的并發癥^[1-2]，其中會引起手足口病的常見病包括科薩奇病毒A組16、4、5、9、10型，腸道病毒71型（EV71）及B組的2、5型，其中最為常見的病原體類型為腸道病毒EV71型及柯薩奇病毒A組的16型^[3]，因此對其進行早期、準確診斷非常重要，以往多采用逆轉錄-聚合酶連反應（RT-PCR）周期較長，不利于快速診斷，而實時熒光定量PCR是一種新興的用于病原體核酸快速檢測的技術^[4]。本文分析了RT-PCR和熒光探針PCR對手足口病腸道病毒的診斷價值，以為手足口病腸道病毒檢測選擇合適的診斷方法，現進行如下報告。

1 資料與方法

1.1一般資料

選擇我市2018年1月至2018年12月的225例手足口病患兒，所有患兒的發病時間均小于7d，排除免疫性疾病、感染性疾病及其他伴發疾病等。其中男115例，女110例，年齡范圍為8個月～4歲，平均年齡為3.1±0.9歲。

1.2方法

RNA提取試劑盒購自Roch公司，核酸分子質量標準DL2000 DNA marker購自TaKaRa公司，逆轉錄PCR擴增采用Titan One Tube RT-PCR Kit;熒光實時定量PCR試劑盒購自江蘇碩世生物科技股份有限責任公司，實時熒光定量PCR擴增儀器為AB 公司的StepOne，瓊脂糖凝膠電泳系統購自北京六一公司。

熒光探針PCR法：取原始樣本200μl，用固相提取法中的柱式提取法對RNA進行提取，并采用PCR核酸擴增檢測儀進行擴增，按說明書進行溫度條件、循環擴增參數設置，并設置陰性及陽性對照組。

RT-PCR：引物序列符合《手足口病診斷》標準（WS 588-2018），反應條件為50°C下進行逆轉錄半小時，之后94°C下2min，94°C下30s，45°C下30s，68°C下45s，進行40個循環后在68°C下7min，之后轉入4°C。

1.3觀察指標

對比RT-PCR和熒光探針PCR兩種方法的病毒陽性檢出率，包括通用型腸道病毒、EV71、CoxA16。

1.4統計學方法

采用SPSS23.0軟件進行數據的處理與分析，計量資料用均數±標準差表示，計數資料用n或百分比表示，對比分析采用卡方檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2?結果

表1結果表明，熒光探針PCR對通用型腸道病毒、EV71、CoxA16等手足口病腸道病毒的檢出率明顯高于RT-PCR法，差異對比顯著，具有統計學意義（P<0.05）。

3?討論

目前，手足口病檢測的金標準方法是用分離、鑒定病毒的方法，常用分離方法包括乳鼠接種及細胞接種，但因細胞對病毒的敏感性導致細胞出現明顯病變的周期較長，且因病毒抗原漂移容易受到阻礙，且接種乳鼠的鑒別過程繁瑣耗時，因此其不適用于短時間內處理大量樣本，也不滿足臨床早診斷及早干預的需要，且會出現難以采集合格標本的情況，從而無法對病毒進行檢測，腸道病毒特異性鑒定可采用血清中和實驗，多見于手足口病無癥狀的腸道病毒感染，但其檢測方法特異性較低^[5]，因此需采用合適的檢測方法，本文分析了熒光探針PCR對手足口病腸道病毒的檢測效果。

本文結果表明，熒光探針PCR對通用型腸道病毒、EV71、CoxA16等手足口病腸道病毒的檢出率明顯高于RT-PCR法，差異對比顯著，具有統計學意義（P<0.05），主要是由于熒光探針PCR具有快速、定量檢測、靈敏度、特異度高且自動化程度高等優點^[6]，因此其可用于手足口病腸道病毒的檢測。

綜上所述，與RT-PCR相比，熒光探針PCR對手足口病腸道病毒的陽性檢出率較高，值得臨床推廣應用。

參考文獻

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