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RT-PCR和熒光探針PCR對手足口病腸道病毒的檢測效果分析

2019-10-21 23:10:43何鋒劉穎迪程艷君
中國保健營養 2019年7期
關鍵詞:檢測方法

何鋒 劉穎迪 程艷君

【摘 ?要】目的:探討RT-PCR和熒光探針PCR對手足口病腸道病毒的檢測效果。方法:選擇我市2018年1月至2018年12月的225例手足口病患兒,均行RT-PCR和熒光探針PCR檢測,對比RT-PCR和熒光探針PCR兩種方法的病毒陽性檢出率,包括通用型腸道病毒、EV71、CoxA16。結果:熒光探針PCR對通用型腸道病毒、EV71、CoxA16等手足口病腸道病毒的檢出率明顯高于RT-PCR法,差異對比顯著,具有統計學意義(P<0.05)。結論:與RT-PCR相比,熒光探針PCR對手足口病腸道病毒的陽性檢出率較高,值得臨床推廣應用。

【關鍵詞】RT-PCR;熒光探針PCR;手足口病腸道病毒;陽性檢出率

【中圖分類號】R446??????【文獻標識碼】A??????【文章編號】1004-7484(2019)07-0138-01

手足口病是因腸道病毒感染引起的一種傳染性疾病,多發于嬰幼兒中,會引起小兒的足、手、口腔等部位發生皰疹,部分患兒甚至會引起肺水腫、心肌炎或無菌性腦膜炎等嚴重的并發癥[1-2],其中會引起手足口病的常見病包括科薩奇病毒A組16、4、5、9、10型,腸道病毒71型(EV71)及B組的2、5型,其中最為常見的病原體類型為腸道病毒EV71型及柯薩奇病毒A組的16型[3],因此對其進行早期、準確診斷非常重要,以往多采用逆轉錄-聚合酶連反應(RT-PCR)周期較長,不利于快速診斷,而實時熒光定量PCR是一種新興的用于病原體核酸快速檢測的技術[4]。本文分析了RT-PCR和熒光探針PCR對手足口病腸道病毒的診斷價值,以為手足口病腸道病毒檢測選擇合適的診斷方法,現進行如下報告。

1 資料與方法

1.1一般資料

選擇我市2018年1月至2018年12月的225例手足口病患兒,所有患兒的發病時間均小于7d,排除免疫性疾病、感染性疾病及其他伴發疾病等。其中男115例,女110例,年齡范圍為8個月~4歲,平均年齡為3.1±0.9歲。

1.2方法

RNA提取試劑盒購自Roch公司,核酸分子質量標準DL2000 DNA marker購自TaKaRa公司,逆轉錄PCR擴增采用Titan One Tube RT-PCR Kit;熒光實時定量PCR試劑盒購自江蘇碩世生物科技股份有限責任公司,實時熒光定量PCR擴增儀器為AB 公司的StepOne,瓊脂糖凝膠電泳系統購自北京六一公司。

熒光探針PCR法:取原始樣本200μl,用固相提取法中的柱式提取法對RNA進行提取,并采用PCR核酸擴增檢測儀進行擴增,按說明書進行溫度條件、循環擴增參數設置,并設置陰性及陽性對照組。

RT-PCR:引物序列符合《手足口病診斷》標準(WS 588-2018),反應條件為50°C下進行逆轉錄半小時,之后94°C下2min,94°C下30s,45°C下30s,68°C下45s,進行40個循環后在68°C下7min,之后轉入4°C。

1.3觀察指標

對比RT-PCR和熒光探針PCR兩種方法的病毒陽性檢出率,包括通用型腸道病毒、EV71、CoxA16。

1.4統計學方法

采用SPSS23.0軟件進行數據的處理與分析,計量資料用均數±標準差表示,計數資料用n或百分比表示,對比分析采用卡方檢驗,P<0.05為差異有統計學意義。

2?結果

表1結果表明,熒光探針PCR對通用型腸道病毒、EV71、CoxA16等手足口病腸道病毒的檢出率明顯高于RT-PCR法,差異對比顯著,具有統計學意義(P<0.05)。

3?討論

目前,手足口病檢測的金標準方法是用分離、鑒定病毒的方法,常用分離方法包括乳鼠接種及細胞接種,但因細胞對病毒的敏感性導致細胞出現明顯病變的周期較長,且因病毒抗原漂移容易受到阻礙,且接種乳鼠的鑒別過程繁瑣耗時,因此其不適用于短時間內處理大量樣本,也不滿足臨床早診斷及早干預的需要,且會出現難以采集合格標本的情況,從而無法對病毒進行檢測,腸道病毒特異性鑒定可采用血清中和實驗,多見于手足口病無癥狀的腸道病毒感染,但其檢測方法特異性較低[5],因此需采用合適的檢測方法,本文分析了熒光探針PCR對手足口病腸道病毒的檢測效果。

本文結果表明,熒光探針PCR對通用型腸道病毒、EV71、CoxA16等手足口病腸道病毒的檢出率明顯高于RT-PCR法,差異對比顯著,具有統計學意義(P<0.05),主要是由于熒光探針PCR具有快速、定量檢測、靈敏度、特異度高且自動化程度高等優點[6],因此其可用于手足口病腸道病毒的檢測。

綜上所述,與RT-PCR相比,熒光探針PCR對手足口病腸道病毒的陽性檢出率較高,值得臨床推廣應用。

參考文獻

[1]Wang M, Ren Q, Zhang Z, et al. Rapid detection of hand, foot and mouth disease enterovirus genotypes by multiplex PCR[J]. Journal of Virological Methods, 2018, 258:7-12.

[2]賴輝兵,喻黎明,馮梓來,等.2009-2015年廣東省云浮市手足口病流行病學特征和重癥病例的病原學分析[J].現代預防醫學,2017,43(3):23-27.

[3]李娟娟,王玉肖,周美靜,等.2013-2016年河北省保定市CoxA6型手足口病流行病學特征分析[J].醫學動物防制,2018,34(12):34-36.

[4]沈偉鋒,邵平揚,殷新光,等.多重熒光定量RT-PCR快速甄別手足口病病原體的方法研究[J].中華臨床感染病雜志,2017,10(2):141-145.

[5]呂莉琨,楊東靖,李力,等.手足口病柯薩奇病毒A2、A4和A5型SYBRGreenⅠ實時熒光定量RT-PCR檢測方法的建立[J].中國病原生物學雜志,2017,30(1):15-19.

[6]程潔萍,譚翰清.柯薩奇A組6型病毒TaqMan探針實時熒光RT-PCR的建立[J].熱帶醫學雜志,2017,17(7):908-911.

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